黑眉锦蛇消化道各部位主要消化酶的活力及pH对消化酶活力的影响.pdf

实验研究112023 年/第 9 期黑眉锦蛇消化道各部位主要消化酶的活力及 pH对消化酶活力的影响王 伟胡雨佳宋 华张盛周（安徽师范大学生命科学学院重要生物资源保护与利用重点实验室安徽芜湖241000）摘要：采用福林-酚试剂法、聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法、3，5-二硝基水杨酸比色法、羧甲基纤维素钠水解法分别对黑眉锦蛇消化道中蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的活力以及 pH 对这些消化酶活力的影响进行了研究。结果表明，在各自最适 pH 条件下，黑眉锦蛇消化道中蛋白酶和脂肪酶活力排序是前肠中肠胃后肠食道，淀粉酶活力排序是前肠后肠中肠食道胃，在黑眉锦蛇消化道各部位均未检测到明显的纤维素酶活力。食道、胃、前肠、中肠、后肠蛋白酶最适 pH值分别为 4.0，2.2，7.4，7.4 和 7.0；食道、胃和后肠脂肪酶最适 pH 值均为 6.0，而前肠和中肠最适 pH值均为 7.4；食道淀粉酶的最适 pH 值为 7.0，胃、前肠和中肠最适 pH 值均为 8.0，后肠最适 pH 值为 7.4。本研究结果可为黑眉锦蛇人工养殖技术的发展提供参考。关键词：黑眉锦蛇；消化酶；消化道；pH黑眉锦蛇（Elaphe taeniura）隶属于爬行纲（Reptile）有鳞目（Squamata）游蛇科（Colubridae），是一种大型无毒蛇，善攀爬，多捕食鼠类和鸟类。其肉味鲜美，有较高的营养价值，同时其肉、胆、蜕均可作为优良的药材，有很高的经济价值1。为保护野生动物资源，黑眉锦蛇的人工养殖已得到大范围推广2，与其养殖相关的基础生物学研究也在不断深入开展3-6。研究消化酶的活力，可了解动物对不同营养成分的消化能力，进而为天然饲料的选择和人工饲料的配制提供理论基础。目前，国内外有关低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在鱼类7-11和两栖类12-15，爬行动物消化酶的研究也有一些报道16-20。宋华等21利用酶组织化学技术对黑眉锦蛇消化道黏膜过氧化氢酶、非特异性酯酶、三磷酸腺苷酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶等 6 种酶进行了定位和活性研究，但黑眉锦蛇消化道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的活力尚未见报道。采用生化检测方法对黑眉锦蛇消化道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的活力及 pH 对酶活力的影响进行了研究，旨在增进对黑眉锦蛇消化酶机能的认识，为其人工养殖技术的发展提供基础资料。1材料与方法1.1试验材料人工养殖的黑眉锦蛇 5 条，均购于芜湖市吉和市场，单重 320455g，体长 135160cm。低温麻醉，迅速解剖，将消化道分 5 段取材，即食道、胃、前肠、中肠、后肠（直肠），用 065%的生理盐水快速洗净，用吸水纸轻轻吸干、称重。1.2酶液的制备取消化道各段材料，加入 25 倍质量的 4蒸馏水后，分别在冰水浴中用匀浆器充分匀浆，再以 4000r/min 的速度冷冻离心 10min，收集上清液即为酶液。置于-20冰箱中保存备用，酶活力在 24h 内测定分析完毕。1.3消化酶活力的测定分别采用福林-酚试剂法、聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法、3，5-二硝基水杨酸比色法、羧甲基纤维素钠水解法对蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、基金项目：安徽省自然科学基金（1808085MC82）；国家级大学生创新创业训练计划项目（202110370094）。作者简介：王伟（2001.9-），女，研究方向：生物科学。通讯作者：张盛周（1970.7-），男，教授，研究方向：动物细胞学与生理生化。PECIAL ECONOMIC ANIMALS AND PLANTS特种经济动植物S122023 年/第 9 期纤维素酶活力进行测定，具体方法参考文献 14。1.4pH 梯度的设置利用不同 pH 值的缓冲液来调节反应的 pH条件。4种缓冲液分别为 KCl-HCl 缓冲液（pH 值1015）、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH值2280）、巴比妥钠-盐酸缓冲液（pH 值8096）、甘氨酸-NaOH 缓冲液（pH 值100）。胃消化酶设置10，15，22，30，40，50，60，70，74，80和90共11个 pH 值梯度；食道、前肠、中肠、后肠消化酶设置22，30，40，50，60，70，74，80，90，96和100共11个 pH 值梯度。1.5数据处理及分析实验数据用 3 次测量的平均值 标准差（MeanSD）表示，用单因素方差分析（one-wayANOVA）对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较。2结果与分析2.1黑眉锦蛇主要消化酶活力黑眉锦蛇消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，见表 1。表 1黑眉锦蛇消化道主要消化酶活力单位：U/g食道胃前肠中肠后肠蛋白酶活力3348468c367802814b542762641a379971445b78701164c脂肪酶活力4062984d190801776b332682271a284591635a104501372c淀粉酶活力247105c073076d714341a312202c427141b注：表中肩标不同小写字母表示组间存在显著性差异（P005），相同字母表示组间不存在显著差异（P005）。由表 1 可知，在消化道中，蛋白酶活力排序是前肠中肠胃后肠食道。前肠酶活力最高（P005），中肠和胃酶活力均较高，且两者差异不显著（P005），后肠和食道酶活力均显著较低（P005）；脂肪酶活力排序是前肠中肠胃后肠食道，前肠和中肠脂肪酶活力显著较高（P005），胃酶活力较高，后肠酶活力较低，食道酶活力最低（P005）；淀 粉 酶 在 消 化 道 各 段 活 力 均 较低，酶活力排序是前肠后肠中肠食道胃，前肠酶活力最高（P005），后肠酶活力次之，中肠和食道酶活力较低，胃酶活力最低（P005）。此外，还对黑眉锦蛇消化道各段纤维素酶活力进行了检测，结果未观测到明显的酶活力。2.2pH 对消化酶活力的影响2.2.1 pH 对蛋白酶活力的影响根据单因素方差分析，不同 pH 条件下，黑眉锦蛇消化道各段蛋白酶的活力变化有显著差异（P005）。由图 1 可知，食道、胃、前肠、中肠、后肠蛋白酶最适 pH 值分别为 40，22，74，74 和 70。食道蛋白酶活力最低，整个酶活力曲线变化平缓，在 pH 值 40 时酶活力最大。胃蛋白酶在 pH 值1530 范围内活力较强，在 pH 值 1022 范围内酶活力上升迅速，在 pH 值为 22 时酶活力最强，pH 值大于 22 后酶活力急剧下降，至 pH值 40 时酶活力仅有最大值的 26%左右。前肠和中肠蛋白酶活力曲线相似，在 pH 值 2240范 围 内 酶 活 力 均 较 弱，且 上 升 缓 慢，在 pH4074 范围内，酶活力随 pH 值的升高而迅速升高，pH 值 74 时酶活力达到最大值，pH 继续增大时酶活力迅速下降，至 pH 值 90 时酶活力仅为最大值的 37%左右。后肠蛋白酶活力也较低，变化趋势和食道相似，pH 值为 60 时酶活力最大。?图1pH 对蛋白酶活力的影响实验研究132023 年/第 9 期2.2.2 pH 对脂肪酶活力的影响 根据单因素方差分析，不同 pH 条件下，黑眉锦蛇消化道各段脂肪酶的活力变化有显著差异（P005）。由图2 可知，食道、胃和后肠的最适 pH 值均为 60，而前肠和中肠的最适 pH 值均为 74。食道和后肠脂肪酶活力变化趋势相似，在最适 pH 值（60）前后酶活力上升和下降都较平缓，但后肠酶活力变化稍大。胃脂肪酶活力在 pH 值 60 时达最大值，在 pH 值 2240 和 80100 范围内上升和下降均较缓慢，在 pH 值 4060 和 6080 范围内上升和下降均较迅速，在 pH 值 40 与 80 时酶活力均为最适 pH 值时的 17%左右。前肠和中肠脂肪酶活力变化趋势也相似，在 pH 值 2240 范围内酶活力变化不明显，但在 4074 范围内急剧上升，在 pH 值 74 时达到最大值，而后至 90又迅速下降，在 pH 值 90 时酶活力仅为最大值的 21%左右。?图 2pH 对脂肪酶活力的影响2.2.3 pH 对淀粉酶活力的影响 根据单因素方差分析，不同 pH 条件下，黑眉锦蛇消化道各段淀粉酶的活力变化有显著差异（P005）。由图3可知，食道淀粉酶的最适 pH 值为70，胃、前肠和中肠最适 pH 值均为80，后肠最适 pH 值为74。食道和后肠淀粉酶活力变化趋势相似，在 pH 值3060范围内酶活力均缓慢上升，pH 值60至最适 pH 范围内酶活力上升较快，而后又迅速下降，在 pH 值100时酶活力几乎丧失。胃淀粉酶活力较弱，酶活力变化趋势总体平缓，在 pH 值80时酶活力最强。前肠淀粉酶的活力在 pH 值3050范围内上升较缓慢，而在 pH 值5080范围内上升较快，在 pH 值80时达最大值，而后至100又急剧下降，在 pH 值100时约为最大酶活力的12%。中肠淀粉酶活力在 pH 值3060范围内上升也较缓慢，在 pH 值6080范围内上升稍快，在 pH 值80时达最大值，而后至100又迅速下降，在 pH 值100时酶活力几乎丧失。?图 3pH 对淀粉酶活力的影响PECIAL ECONOMIC ANIMALS AND PLANTS特种经济动植物S142023 年/第 9 期3讨论3.1黑眉锦蛇主要消化酶的活力蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶是动物消化道中的主要消化酶类，本研究在黑眉锦蛇消化道中检测到蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，未检测到明显的纤维素酶活力。不同消化酶在黑眉锦蛇消化道中的活力存在显著差异，蛋白酶和脂肪酶活力较强，淀粉酶活力较弱，这与黄金鲈（Perca flavescens）7、牛蛙（Rana catesbeinana）14、虎斑颈槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）19、棕黑锦蛇（Elaphe schrenckii）20等动物的消化酶活力情况相一致。消化酶活力与动物的食性密切相关，肉食性动物的蛋白酶、脂肪酶活力相对较强，草食性动物的淀粉酶活力相对较强，黑眉锦蛇多捕食鼠类和鸟类等，属于肉食性动物，其蛋白酶及脂肪酶活力较强。在黑眉锦蛇养殖过程中，可对人工饲料的成分进行调整，适当提高饲料中蛋白质和脂肪的含量，减少淀粉含量。在最适 pH 值下，黑眉锦蛇消化道中蛋白酶活力在前肠最强，中肠和胃次之。不同动物消化道中蛋白酶活力分布有较大差异，如黄金鲈7和蒙古鲌（Culter mongolicus）8蛋白酶活力均在前肠显著较高，与本研究结果相似，而牛蛙14、幼鳖（Trionyx sinensis）16和 北 草 蜥（Takydromus septentrionalis）17的蛋白酶活力均为胃强于肠道。黑眉锦蛇脂肪酶活力在前肠和中肠较强，黑斑蛙（Rana nigromaculata）13脂肪酶活力在中肠显著较强，而黄金鲈7脂肪酶活力以胃最强，牛蛙14脂肪酶活力在后肠较强。黑眉锦蛇淀粉酶活力在前肠显著较强，黄金鲈7淀粉酶活力也在前肠较强，而蒙古鲌8淀粉酶在各部位分布无明显差异，翘嘴红鲌（Erythroculter illshaeformis）10和牛蛙的淀粉酶活力均在中肠较强，可见不同动物的消化酶分布存在物种特异性。黑眉锦蛇消化道中消化酶的分布表明前肠、中肠和胃是蛋白质的主要消化部位，前肠和中肠是脂质的主要消化部位，前肠是淀粉的主要消化部位。3.2pH 对消化酶活力的影响pH 是影响酶促反应的重要因素之一，pH 值过大或者过小都会影响酶的活力。本研究中 pH对蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影响均较为显著，且三种酶的活力随 pH 值的变化曲线大都呈单峰型。蛋白酶活力在不同组织中的最适 pH 值不同，其中胃蛋白酶活力的最适 pH 值为 22，表明胃蛋白酶在强酸性时活力较强，这与胃中蛋白质只有在强酸时才能被有效分解的结论22一致。黄金鲈7和牛蛙14胃蛋白酶活力最适 pH 值分别为 25 和 22，均与本研究结果相似，但金建丽等20对棕黑锦蛇的研究显示胃蛋白酶活力的最适 pH 值为66。蒙古鲌8、翘嘴红鲌10和牛蛙14肠道蛋白酶活力的最适 pH 值分别为 74，70，74，本研究中黑眉锦蛇的肠道蛋白酶活力最适pH 值在 7074，与上述动物研究结果相类似。但黄金鲈7肠道蛋白酶活力最适 pH 值为90，棕黑锦蛇20肠道蛋白酶活力最适 pH 值在 8690，明显高于黑眉锦蛇。大量研究表明，肠道脂肪酶在中性 pH 环境中活力较强，如黄金鲈7肠道脂肪酶活力的最适pH 值为 6070，蒙古鲌8、翘嘴红鲌10和牛蛙14肠道脂肪酶活力的最适 pH 值均为 74。黑眉锦蛇的脂肪酶活力在前肠和中肠的最适 pH 值均为 74，在后肠的最适 pH 值为 60，与上述几种动物的研究结果相一致。黑眉锦蛇胃脂肪酶活力最适 pH 值为 60，而牛蛙14胃脂肪酶活力最适 pH 值为 22，黑斑蛙13胃脂肪酶活力最适 pH值为 50，棕黑锦蛇20胃脂肪酶活力最适 pH 值为 54，表明不同动物胃脂肪酶活力的最适 pH 值存在一定的物种特异性。黄金鲈7胃淀粉酶活力最适 pH 值为60，牛蛙14淀粉酶在胃中最适 pH 值为70，棕黑锦蛇20胃淀粉酶活力最适 pH 值为 62。而本研究中黑眉锦蛇的淀粉酶活力在胃中最适 pH 值为 80，明显高于上述动物胃淀粉酶的最适 pH 值。黄金鲈7、蒙古鲌8、翘嘴红鲌10和牛蛙14的肠道淀粉酶活力最适 pH 值分别为 70，74，70，80，黑眉锦蛇的淀粉酶活力在前肠和中肠最适 pH 值为80，在后肠最适 pH 值为 74，与上述动物消化道淀粉酶活力的最适 pH 范围相一致，但棕黑锦蛇20肠道淀粉酶活力的最适 pH 值为 5866。蛋白酶和脂肪酶是黑眉锦蛇消化道主要消化酶类，黑眉锦蛇胃蛋白酶活力在强酸下较强，脂肪酶活力也在酸性时较强。据此，在配制黑眉锦实验研究152023 年/第 9 期蛇人工饲料时，适量添加酸化剂可提高黑眉锦蛇对饲料中蛋白质和脂质的消化能力，进而提高养殖效益。参考文献1时云朵，孙豪.黑眉锦蛇肠道菌群结构分析 J.湖南农业大学学报（自然科学版），2017，43（3）：292-297.2谢伟商，谢恩义.黑眉锦蛇的人工养殖J.怀化师专学报，2000，19（2）：66-68.3Chen L，Xia H C，Wang Y T，et al.Proteomic profiling of liver from Elaphe taeniura，a common snake in eastern and southeastern Asia J.Genetics and Molecular Biology，2013，36（3）：438-447.4陈亮，陈克平，刘伟，等.黑眉锦蛇的肝脏转录组分析 J.四川动物，2014，33（1）：1-7.5Liu W，Wang T，Liu L B，et al.The occurence of the strongylid nematodes Kalicephalus brachycephalus，K.bungari and K.indicus in snake speices from Hunan Province，China J.2016，91（3）：384-386.6Liu w，Tan L，Huang Y，et al.Prevalence and molecular characterization of Spirometra erinaceieuropaei spargana in snakes in Hunan Province，China J.Journal of Helminthology，2020，94：131-131.7杨婳，邢秀苹，黄权，等.温度和 pH 对黄金鲈消化酶活力的影响 J.西北农林科技大学学报（自然科学版），2014，42（10）：1-6.8韩庆，龚丽军，凌卯梅，等.pH 对蒙古鲌肝胰脏和肠道中消化酶活性的影响 J.水产学杂志，2020，33（6）：39-43.9Haryanti，Gunawan，Setiadi A，et al.The effect of probiotics on digestive enzyme activity during larvae and juvenile stage of Yellow Fin Tuna（Thunnus albacares）J.IOP Conference Series：Earth and Environmental Science，2021，890（1）：1-8.10韩庆，凌卯梅，龚丽军，等.温度和 pH 对翘嘴红鲌消化酶活性的影响 J.水产学杂志，2021，34（2）：28-33.11Wang S L，Han Z H，Giobanni T，et al.Effects of dietary phospholipids on growth performance，digestive enzymes activity and intestinal health of largemouth bass（Micropterus salmoides）larvae J.Frontiers in Immunology，2022，12：827946.12Teo L H，Chen T W，Tan L L，et al.The proteases of the common malayan toad Bufo melanostictus Schneider J.Comp Biochem Physiol，1990，96（4）：715-720.13张盛周，朱联九，钱玉，等.pH 和温度对黑斑蛙消化道脂肪酶活力的影响 J.安徽师范大学学报（自然科学版），2008，31（2）：159-162.14朱联九，朱升学，程文娟，等.牛蛙主要消化酶的分布及 pH 和温度对消化酶活力的影响 J.激光生物学报，2008，17（4）：496-501.15田新民，石兰英.黑龙江林蛙胃肠道三种消化酶的活力研究 J.湖北农业科学，2019，56（19）：3703-3705.16龙启良，白东清，梁拥军，等.幼鳖胃肠胰组织中主要消化酶活性分布 J.动物学杂志，1997，32（6）：23-26.17孙建礼，贾守菊，陈盛想，等.北草蜥和中国石龙子几种消化酶活力比较研究 J.四川动物，2003，22（3）：137-139.18Sun J Y，Du J，Qian L C，et al.Distribution and characteristics of endogenous digestive enzymes in the red-eared slider turtle，Trachemys scripta elegans J.Comparative Biochemistry and Physiology，2007，147（4）：1125-1129.19王小龙，侯天德，张建萍，等.温度对虎斑颈槽蛇消化酶活性的影响 J.四川动物，2008，27（6）：1058-1061.20金建丽，刘思宇，刘艳爽，等.温度和 pH 对棕黑锦蛇消化酶活性的影响 J.贵州农业科学，2019，47（5）：80-85.21宋华，朱红年，郭慧，等.黑眉锦蛇消化道 6 种酶组织化学定位 J.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（5）：457-461.22Vys W，Hecht T.Assays on the digestive enzymes of sharptooth catfish，Clarias gariepinus（Pisces：Clariidae）J.Aquaculture，1987，63（1-4）：301-310.