肝豆灵片通过调节TLR4_NF-κB_NLRP3信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制.pdf

山 东 科 学 第 卷 第 期 年 月出版.:./.【药理与毒理】收稿日期:基金项目:安徽高 校研 究生科 学研究 项目()安 徽省自 然科学 基金()安徽 高校 自 然 科 学 研 究 项 目()安徽中医药大学第一附属医院临床科学研究项目()国家自然科学基金()安徽中医药大学科技创新基金()作者简介:闻雨雅()女硕士研究生研究方向为中医药防治神经变性疾病:.通信作者董婷()女博士主任医师博士生导师研究方向为中医药防治神经变性疾病:.肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制闻雨雅董婷江张胜陈洁田丽伟赵晨玲唐露露(.安徽中医药大学 研究生院 安徽 合肥 .安徽中医药大学第一附属医院安徽 合肥)摘要:基于/信号通路探讨肝豆灵片对 小鼠肝豆状核变性神经炎症的影响以及对 诱导的小胶质细胞炎性反应的作用机制 将 小鼠分为对照组模型组肝豆灵片低、中、高剂量组青霉胺组 细胞分为对照组、模型组、肝豆灵片组、组、肝豆灵片 组采用 染色检测各组小鼠海马组织病理学改变蛋白质免疫印迹检测各组小鼠海马组织及 细胞中、蛋白的表达酶联免疫吸附测定法检测各组小鼠海马组织及 细胞中 、的含量实时荧光定量聚合链式反应检测各组 细胞中、的表达 结果表明:与对照组相比模型组海马组织出现明显炎性损伤、蛋白表达均明显增高、的含量明显升高(.)与模型组相比肝豆灵片组和青霉胺组海马组织的病理损伤均得到改善且肝豆灵片高剂量组效果更明显肝豆灵片组和 组能抑制 细胞活化、蛋白与 表达较模型组均明显减少、的含量明显降低(.)肝豆灵片能减轻 小鼠海马组织炎性损伤抑制 诱导的 细胞过度活化其机制可能与下调/信号通路有关关键词:肝豆灵片肝豆状核变性/神经炎症作用机制中图分类号:文献标志码:文章编号:()开放科学(资源服务)标志码():/(.)第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制 /.(.).(.)././肝豆状核变性()是一种以铜代谢异常为特点的常染色体隐性遗传病神经炎性损伤是引起 患者神经症状的主要因素 样受体热蛋白结构域相关蛋白 ()炎性小体在多个神经退行性病中发挥重要作用前期研究证明 在 小鼠中处于高表达水平 炎症小体的激活可导致小胶质细胞产生白介素()诱导神经炎性损伤加重疾病进程 研究表明高铜能触发 依赖性小胶质细胞活化引起炎症级联反应导致神经损伤 样受体()在小胶质细胞中广泛表达其中 是激活 信号通路以响应内源性分子所必需的 信号激活后诱发 炎症小体活化募集促炎细胞因子促进炎症反应因此调控/信号通路是保证神经系统稳定的重要手段中医认为痰与瘀贯穿 始终“痰瘀伏邪”是该病一大重要学说 安徽中医药大学第一附属医院脑病中心根据 患者痰瘀互结的病证特点创制的肝豆灵片由丹参、姜黄、莪术、鸡血藤、黄连、生大黄六味中药组成具有化浊、解毒、祛瘀之效 现代药理研究显示丹参、莪术、姜黄的提取物隐丹参酮、莪术醇、姜黄素对小胶质细胞炎性反应和表型转换具有干预作用 临床用于治疗 的青霉胺等金属螯合剂因出现了较多副作用而应用受限如今中医药治疗 已得到广泛认识肝豆灵片用于治疗 能通过多个途径延缓患者神经症状的发展进程临床应用近 年疗效确切且无金属螯合剂的毒副作用课题组前期已确证肝豆灵片可抑制小胶质细胞活化抑制 炎症小体表达 为肝豆灵片治疗 神经炎症损伤的关键靶点但其具体的分子机制仍不清楚 因此本研究以 小鼠为体内实验模型以 诱导的 细胞为体外实验模型/通路调控 炎症小体活化为主线探讨肝豆灵片对 神经炎性损伤的保护机制为肝豆灵片治疗 神经炎症提供理论依据山 东 科 学 年 材料与仪器.实验动物选取 月龄左右无特定病原体()级的 只 雄鼠()(品系号/)和 只野生同背景型 雄鼠体重 在安徽中医药大学教育部重点实验室动物中心饲养 所有小鼠置于通风良好相对湿度 温度为 的清洁动物房内自由饮食取水并及时更换饲料 所有动物方案均经安徽中医药大学动物伦理委员会批准(批准文号).细胞株 细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司).药物与试剂肝豆灵片(生产批号 准字规格./片安徽中医药大学第一附属医院)青霉胺片(生产批号规格./片上海上药信谊药厂有限公司)胎牛血清(上海煊翎生物科技有限公司批号规格 )总 小量抽提试剂盒(广州美基生物科技有限公司批号)逆转录试剂盒(新贝(上海)生物科技有限公司批号)增强型 试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司批号)酶联免疫吸附测定()试剂盒(南京建成生物工程研究所批号、)兔抗(上海碧云天生物技术有限公司规格)兔抗(公司批号 规格 )(公司批号 规格)兔抗、(武汉三鹰生物技术有限公司、规格 ).主要仪器 型倒置相差显微镜(日本 公司)型高速冷冻离心机(德国 公司)型全波段酶标仪(美国 公司)型免疫印迹系统(瑞士 公司)型实时荧光定量 仪(瑞士 公司)实验内容.体内实验.动物分组及给药 只 小鼠作为对照组 只 小鼠随机平分为 组:模型组肝豆灵片低、中、高剂量和青霉胺组给药组剂量按照给药组按体重 成人日用量的.倍进行等效剂量换算肝豆灵片低、中、高剂量组分别为.、.、./灌胃青霉胺组剂量为./灌胃对照组及模型组给予等体积生理盐水等量灌胃连续 周 灌胃结束后禁食 的戊巴比妥钠(/)腹腔注射麻醉取各组小鼠海马组织分别进行液氮冷冻 保存中性福尔马林固定处理.观察肝豆灵片对 小鼠海马组织炎性损伤的影响()采用 染色观察 小鼠海马组织病理学改变取各组小鼠海马组织固定于 中性甲醛溶液中经脱水、包埋、切片、常规 染色后置于光学显微镜下观察评价海马组织病理学状态()检测各组小鼠海马组织炎症因子 、的表达取出冻存的海马组织称重后加入 倍质量的生理盐水分别在冰上研磨成匀浆后 /下 离心取上清液其余按照 试剂盒说明书步骤进行.观察肝豆灵片基于/信号通路对 小鼠神经炎症的影响采用蛋白质免疫印迹()检测信号通路相关蛋白、的表达情况:分别第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制取各组小鼠海马组织在冰上进行研磨抽提组织蛋白通过 电泳以及电转移装置将蛋白质转移至 膜上 用 的 浸泡 膜室温摇床封闭 加入一抗 水平摇床孵育过夜加入二抗室温孵育 洗去多余的二抗以 为内参用 软件分析、计算目标条带的灰度值.体外实验.细胞培养复苏 细胞复苏后加入含 双抗、胎牛血清的 培养基接种于培养瓶中置于培养箱中培养(、)待细胞生长达亚融合状态用.胰蛋白酶消化传代每周传代 次取对数期的细胞进行实验.肝豆灵片含药血清的制备与保存将 只 大鼠随机分为对照组和肝豆灵片组每组 只 肝豆灵片组中药含药血清组按 正常人剂量等量换算采用人的.倍剂量./()的肝豆灵片进行灌胃对照组灌等量生理盐水每天 次连续灌胃 末次灌胃后禁食 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉在无菌条件下进行腹主动脉取血离心取上清液于 水浴 用.滤器过滤除菌将滤液置于 保存备用.比色法观察细胞活性取对数生长期细胞以.个/密度接种于 孔培养板中每孔 、孵箱中培养细胞在含体积分数 胎牛血清的 培养液中培养过夜换液后继续培养 每孔分别加入/铜离子刺激 细胞在加铜离子的孔内分别加入 不同浓度的肝豆灵片含药血清(、)同时设对照组、铜离子负荷组每组设 个复孔孵育、后每孔加入 继续孵育 置酶标仪 处测吸光度 观察不同浓度肝豆灵片含药血清作用不同时间后对 细胞的影响为后续实验筛选出肝豆灵片最佳浓度含药血清和最佳作用时间细胞活性(给药组对照组)/(空白组对照组).细胞分组与干预 细胞随机分为对照组、模型组、肝豆灵片组、组、肝豆灵片 组 对照组用空白血清培养基培养不作其他处理模型组给与/的 诱导处理肝豆灵片组给与 和肝豆灵片含药血清同时处理 组给 和 抑制剂 同时处理肝豆灵片 组给与肝豆灵片和 抑制剂 同时处理.观察肝豆灵片基于/信号通路对 细胞的影响()测各组细胞中/信号通路相关蛋白、的表达情况取对数生长的 细胞按照.项分组与干预方法于 、培养箱中孵育 提取细胞总蛋白通过 电泳以及电转移装置将蛋白质转移至 膜上 用 的 浸泡 膜室温摇床封闭 加入一抗 水平摇床孵育过夜加入二抗室温孵育 洗去多余的二抗以 为内参用 软件分析、计算目标条带的灰度值()检测各组细胞中信号通路及下游炎症因子 的表达情况取对数生长的 细胞按照.项分组与干预方法于 、培养箱中孵育 采用试剂盒提取细胞总 进行逆转录总反应体系 水浴 合成第一链 取上述反应液作为荧光定量的模板进行扩增引物由上海新贝生物科技有限公司进行设计详见表 反应程序首先 热启动然后按以下条件进行:预变性 设定 个循环(变性 退火 )反应体系 .样本.总体积为 以 为内参进行扩增 利用 计算相对表达量山 东 科 学 年表 、引物序列及产物长度 、基因名称引物序列产物长度/上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 上游 下游 ()检测各组细胞上清液中炎症因子、的含量取对数生长的 细胞按照.项分组与干预方法于 、培养箱中孵育 取上清参照 试剂盒说明书检测细胞中、的含量.统计学分析使用 .软件对数据进行统计学分析计量资料以 表示多组间比较采用单因素方差分析.为差异有统计学意义 实验结果.染色观察肝豆灵片对 小鼠海马组织病理学改变的影响对照组海马组织未见明显异常与对照组相比模型组海马组织细胞固化萎缩细胞坏死明显增多肝豆灵片低、中剂量组与青霉胺组细胞间结构松散较模型组细胞坏死减少肝豆灵片高剂量组细胞坏死明显减少 见图 图 各组 小鼠海马组织 染色结果().()第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制.检测各组小鼠/信号通路相关蛋白的表达情况与对照组比较模型组、表达水平上调(.)与模型组比较肝豆灵片低、中、高剂量组与青霉胺组、表达水平均下调(.)见图 注:与对照组比较.与模型组比较.与肝豆灵片高剂量组比较.图 各组海马组织、蛋白表达情况.检测各组小鼠海马组织炎症因子的表达采用 检测海马组织上清液中、的质量分数结果:与对照组比较模型组 、表达均明显升高(.)与模型组比较肝豆灵片低、中、高剂量组青霉胺组、质量分数均下降(.)见图 注:与对照组比较.与模型组比较.图 各组海马组织上清液中、的质量分数.山 东 科 学 年.法观察肝豆灵片含药血清最佳作用浓度和作用时间与对照组比较 肝豆灵片组在、作用时间内细胞活性无明显改变肝豆灵片组在、后细胞活性值明显升高肝豆灵片组在、后细胞活性值无明显变化 肝豆灵片组在、细胞活性值均升高 因此本实验选择 作为肝豆灵片含药血清最佳作用浓度和时间 见图 图 法检测肝豆灵片含药血清最佳作用浓度和作用时间.肝豆灵片对 细胞/信号通路相关蛋白表达的影响 检测 细胞、蛋白表达情况:与对照组比较模型组、表达水平上调(.)与模型组比较肝豆灵片组、组、表达水平显著下调(.)见图 注:与对照组比较.与模型组比较.与肝豆灵片组比较.图 各组 细胞中、蛋白的表达情况.第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制.肝豆灵片对 细胞/信号通路相关 表达的影响 检测 细胞、表达结果:与对照组比较模型组表达显著升高(.)与模型组比较肝豆灵片组和 组表达均下降(.)见图 注:与对照组比较.与模型组比较.与肝豆灵片组比较.图 各组 细胞中、的表达情况.肝豆灵片对 细胞炎症因子表达的影响 检测炎症因子 、的含量结果:与对照组比较模型组炎症因子表达显著升高(.)与模型组比较肝豆灵片组炎症因子表达均下降(.)见图 注:与对照组比较.与模型组比较.图 各组 细胞上清液中、的含量.山 东 科 学 年 讨论 脑内铜过量沉积引起氧化应激和炎症反应对神经网络造成破坏最终导致认知障碍等神经症状 大量的动物实验和临床研究证实神经炎症贯穿于 神经症状发生的始终神经炎症不仅仅是 神经病理学的关键组成成分同时可能也是其他病理特征形成和发展的诱发因素 神经炎症与 神经症状的发生发展关系密切并有可能成为新的药物作用靶点 本研究通过对海马组织炎性因子水平、炎症相关/通路、海马病理学指标等进行检测研究 神经症状与慢性炎症反应之间的联系以及肝豆灵片对其干预作用小胶质细胞是中枢神经系统中最常见的免疫细胞在维持其正常功能中发挥重要作用活化状态的小胶质细胞可诱导 途径并产生多种促炎因子 如今小胶质细胞广泛应用于神经退行性变、炎症反应和免疫等动物和生物实验研究永生化的小鼠小胶质细胞系 是许多实验环境中原代小胶质细胞的有效替代品小胶质细胞介导的神经炎症是 发病机制的重要部分因此本实验采用 诱导的 细胞模型探讨 神经炎症损伤机制 本研究结果表明在小鼠海马组织和体外培养的 细胞中与模型组相比肝豆灵片组、炎症因子含量均明显下调、蛋白表达明显下调提示肝豆灵片具有抗炎作用并可能通过/通路改善炎症反应 此外体内实验结果显示 小鼠海马组织存在炎性损伤肝豆灵片组可以明显减轻海马组织的病理损伤以及信号通路相关蛋白和下游炎症因子的表达并且与青霉胺组相比肝豆灵片高剂量组具有更明显的效果 在小胶质细胞中大量表达并诱导小胶质细胞活化在启动神经炎症反应和介导神经免疫中发挥关键作用 研究表明 可以被许多外源性和内源性危险信号分子激活继而激活 等转录因子随后上调炎性小体组分 的表达形成 炎症小体的组装最终促进炎症因子的产生 本实验中模型组、蛋白和 表达水平较对照组均明显增加提示/通路参与 神经炎症反应 是 的特异性抑制剂可充当小胶质细胞调节剂将小胶质细胞极化从促炎状态转移到抗炎状态从而发挥保护和修复神经的作用并通过下调 和 信号传导来保护神经元细胞免受活化的 细胞的毒性 本实验结果表明 组较模型组、蛋白表达均下调进一步说明了通过抑制 下调/信号通路可以抑制 的神经炎症损伤综上所述本研究体内实验以 小鼠为模型证明了肝豆灵片对 小鼠海马区炎性损伤的积极作用可能与/信号通路的下调有关 以 诱导的 细胞为模型进行体外实验初步证明了肝豆灵片能抑制小胶质细胞过度活化减轻炎症反应并发现其机制可能与抑制/信号通路有关 该研究为肝豆灵片治疗 神经炎症提供了一定的实验依据对中医药治疗 具有现实意义但其具体作用机制仍需进一步探讨参考文献:.():.():.:./.():.:./.第 期闻雨雅等:肝豆灵片通过调节/信号通路减轻肝豆状核变性神经炎症的机制.:.:./.().():.:././.()():.:././.():.:./.韩辉 郑明翠 吴丽敏 等.肝豆状核变性中医证型与 基因突变的相关性研究.中国中西医结合杂志():.:./.许琛林.双去甲氧基姜黄素激活/通路改善 对 细胞的毒性作用.衡阳:南华大学.赵红晔.隐丹参酮对 大鼠重要大脑细胞网络模型氧糖剥夺/复氧糖损伤的干预研究.大连:大连医科大学.董婷 杨文明 张娟 等.肝豆灵对 病患者前瞻性记忆功能的影响.安徽中医药大学学报 ():.:./.韩辉 方向 吴丽敏 等.化痰祛瘀法治疗肝豆状核变性认知功能障碍 例.安徽中医药大学学报 ():.:./.():.:./.林康 王共强 金平.铜与认知障碍病理机制的研究.中医药临床杂志 ():.:./.李祥 汪瀚 胡建鹏 等.例肝豆状核变性合并抑郁症状患者的中医证型及神经递质与炎症因子变化特点研究.安徽中医药大学学报 ():.:././.:.:./.():.:./.:.:.:./.:.:./.():.:./.:/.(:)():.:./.:.:./.