复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及特性分析.pdf

宁志雪，朱立斌，朱丹，等.复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及特性分析 J.食品工业科技，2023，44（18）：235243.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100232NING Zhixue,ZHU Libin,ZHU Dan,et al.Process Optimization and Characteristic Analysis of Sea Buckthorn Juice Deacidificationby Compound Lactic Acid Bacteria FermentationJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):235243.(in Chinesewith English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022100232 工艺技术 复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及特性分析特性分析宁志雪1,2，朱立斌1,2，朱丹3,*，牛广财1,2,*，魏文毅1,2，徐瑞航1,2（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江大庆 163319；3.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江大庆 163319）摘要：为了研究复合乳酸菌发酵对沙棘汁降酸效果的影响，以酒酒球菌和短乳杆菌为菌株发酵沙棘汁。以总酸降解率为指标，通过单因素实验和响应面试验优化沙棘汁发酵降酸工艺，并研究发酵过程中黄酮、多酚、总酸、pH、总可溶性固形物（TSS）、还原糖、有机酸以及抗氧化活性的变化。结果表明：复合乳酸菌发酵的最优工艺条件为酒酒球菌:短乳杆菌比例为 1:1、初始 pH3.7、发酵温度 31、发酵时间 18 h、接种量 5%，在该条件下总酸降解率为 38.52%，此时，黄酮、多酚、总酸、pH 和 TSS 含量与发酵前相比，均具有显著性差异（P0.05）。发酵液中苹果酸含量显著下降（P0.05），降解率为 94.59%，乳酸含量显著增加（P0.05）。沙棘汁经复合乳酸菌发酵后，对 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和 2,2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2-azino-bis(3-ethylben-zothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除率及铁离子还原能力最大值分别达到 78.20%、64.48%和1.1626 mmol/L。因此，复合乳酸菌发酵沙棘汁能有效降低其酸度，提高其品质和抗氧化活性，为沙棘汁的降酸工艺和相关产品的开发提供了理论依据。关键词：沙棘汁，乳酸菌，降酸工艺，成分分析，抗氧化活性本文网刊:中图分类号：TS275.4 文献标识码：B 文章编号：10020306（2023）18023509DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022100232ProcessOptimizationandCharacteristicAnalysisofSeaBuckthornJuiceDeacidificationbyCompoundLacticAcidBacteriaFermentationNINGZhixue1,2，ZHULibin1,2，ZHUDan3,*，NIUGuangcai1,2,*，WEIWenyi1,2，XURuihang1,2（1.Food College,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China；2.Agri-Food Processing and Engineering Technology Research Center of Heilongjiang Province,Daqing 163319,China；3.College of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China）Abstract：In order to study the effect of compound lactic acid bacteria fermentation on reducing acid of sea buckthorn juice,the Oenococcus oeni and Lactobacillus brevis were used to ferment sea buckthorn juice.With the total acid degradation rate 收稿日期：20221024 基金项目：黑龙江省“双一流”新一轮建设学科协同创新成果建设项目（LJGXCG2022-109）；黑龙江省高校首批“新工科”研究与实践项目（黑教高函2018681 号）；黑龙江八一农垦大学“三横三纵”平台支持计划项目（PTJH202103）。作者简介：宁志雪（1997），女，硕士研究生，研究方向：果蔬贮藏与精深加工，E-mail：。*通信作者：朱丹（1972），女，硕士，副教授，研究方向：植物资源开发利用，E-mail：。牛广财（1971），男，博士，教授，研究方向：农产品贮藏与加工，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 as the index,the fermentation process of sea buckthorn juice was optimized by single factor experiment and responsesurface experiment,and the changes of flavonoids,polyphenols,total acid,pH,total soluble solids(TSS),reducing sugar,organic acid and antioxidant activity during fermentation were studied.The results showed that the optimal fermentationconditions were as follows:The ratio of Oenococcus oeni to Lactobacillus brevis was 1:1,the initial pH was 3.7,fermentation temperature was 31,fermentation time was 18 h,inoculation amount was 5%.Under these conditions,thetotal acid degradation rate reached 38.52%.At this time,the contents of flavonoids,polyphenols,total acid,pH and TSSwere significantly different from those before fermentation(P0.05).The content of malic acid in fermentationbroth decreased significantly (P0.05),the degradation rate was 94.59%,and the content of lactic acid increasedsignificantly(P0.05).The maximum values of DPPH and ABTS+free radical scavenging rate and ferricreducing antioxidant power(FRAP)of sea buckthorn juice after lactic acid fermentation reached 78.20%,64.48%and1.1626 mmol/L,respectively.Therefore,the sea buckthorn juice fermented by compound lactic acid bacteria couldeffectively reduce its acidity and improve its quality and antioxidant activity,which would provide a theoretical basis forthe development of acid-reducing technology and related products.Keywords：sea buckthorn juice；lactic acid bacteria；reducing acid process；component analysis；antioxidant activity 沙棘是一种药食同源植物，属胡颓子科，所结浆果呈橙色或红色，因其富含抗坏血酸、多酚、类胡萝卜素和类黄酮等生物活性物质而备受关注1。另外，沙棘是公认的抗氧化活性非常高的浆果，已有研究证明沙棘果汁的氧自由基吸收能力可达 111.57 mol TE/mL，分别是蓝莓汁、柠檬汁和柑橘汁的 2.82、15.96和 60.97 倍2。然而，高含量的苹果酸使沙棘果具有强烈的酸味，这对其在食品工业中的应用构成了障碍。最近的研究表明，乳酸菌在改善产品风味或提高保质期方面有着巨大的发展前景。例如，李维妮等3以嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌和副干酪乳杆菌发酵苹果汁，在菌株比例 1:1:1:1、接种量 2%、发酵温度 37、发酵时间 24 h 的条件下处理苹果汁，苹果酸含量为 1574.36 mg/L，较发酵前下降了46.06%，且风味物质更加丰富。张晟等4使用酒酒球菌 6066 对北五味子汁进行发酵，在初始 pH3.4、接种量 7%、发酵温度 24、发酵时间 8 d 的条件下处理北五味子汁，发酵后苹果酸含量降低了 59.00%，DPPH、ABTS+自由基清除率和还原力分别是发酵前的 1.22、1.10 和 1.444 倍。由此可见，乳酸菌发酵果汁具有使产品风味和香气复杂性增强、酸性降低的优点5。沙棘具有强烈的酸性和收敛性，因此，乳酸菌发酵也是提升沙棘汁感官品质的一个潜在方法。已有研究证实复合菌种发酵不仅可使产品品质提升，而且复合菌株发酵体系中自由基清除效果要优于单一菌株发酵6。目前，尚未有采用酒酒球菌与短乳杆菌复合使用对沙棘汁降酸的报道。本研究以酒酒球菌与短乳杆菌为复合菌种，通过单因素实验和响应面法优化其对沙棘汁的降解工艺，并对发酵沙棘汁的理化指标与抗氧化活性进行分析，以期为拓宽沙棘汁的商业用途提供一定的理论依据。1材料与方法 1.1材料与仪器沙棘果购于黑龙江省孙吴县宝江大果沙棘展销中心；酒酒球菌 SP-2T（Oeniococcus oeni SP-2T）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）黑龙江八一农垦大学微生物实验室保藏；芦丁、没食子酸标准品上海麦克林生化科技有限公司；酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、NaOH、苯酚、无水亚硫酸钠、葡萄糖、无水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、K2S2O4、乙酸钠、冰醋酸、浓盐酸、FeCl36H2O、FeSO4、福林酚试剂、碳酸氢钠天津大茂化学试剂厂；MRS 培养基、Na2CO3、蛋白胨、酵母膏、MnSO4H2O、MgSO47H2O、L-盐酸半胱氨酸北京奥博星生物技术有限责任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）、三吡啶基三嗪（TPTZ）分析纯，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；甲醇、磷酸二氢钾、磷酸色谱纯，天津大茂化学试剂厂；草酸、抗坏血酸、乳酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸标准品美国 Sigma 公司。980 力邦全自动破壁料理机宁波禾高电子科技有限公司；AHP9052 电热恒温培养箱上海澳程检测仪器有限公司；高压灭菌器西班牙 SELECTA；EX324 型电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；TD4C 台式低速离心机盐城市凯特实验仪器有限公司；752N 紫外可见分光光度计上海仪电（集团）有限公司；SW-CJ-2F 超净工作台常州恩培仪器制造有限公司；HWS 电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司；PHS-25 型 pH 计上海仪电科学仪器股份有限公司；2WAJ 型单目阿贝折光仪上海申光仪器仪表有限公司；1260 Infinity 高效液相色谱仪美国 Agilent 公司。236 食品工业科技2023 年 9 月 1.2实验方法 1.2.1 复合乳酸菌发酵沙棘汁工艺流程与操作要点 1.2.1.1工艺流程 沙棘冻果挑选清洗解冻打浆调pH杀菌接种菌种活化发酵取样测定 1.2.1.2 操作要点打浆：取解冻后的沙棘果与蒸馏水按照 5:2（W:V）的比例进行打浆。调 pH：用 1 mol/L 的 NaHCO3调 pH。杀菌：置于 85 的水浴中杀菌 40 min。菌种活化：ATB 培养基参照参考文献 7 制备。将适量酒酒球菌冻干粉接种到 ATB 液体培养基中，31 培养 2 d，将所得菌液离心（4000 r/min、10 min），收集菌泥，蒸馏水悬重，使细胞浓度为 1109 CFU/mL；取短乳杆菌冻干粉放入已经灭菌后的 MRS 培养基中溶解均匀，放入 37 培养基中培养 24 h，用蒸馏水悬重，使细胞浓度为 1109 CFU/mL。接种：冷却后的沙棘汁，按照一定的比例接入酒酒球菌与短乳杆菌种子液进行发酵。发酵：接种后的样品，置于设定的恒温培养箱中发酵一定时间后取出，留样置于80 冻存，备用。1.2.2 乳酸菌株接种液比例确定沙棘汁经杀菌后，分别接入酒酒球菌:短乳杆菌为 1:0、2:1、1:1、1:2 和 0:1 比例的混合菌，接种量为 7%，于 31 恒温培养箱中发酵，每 6 h 取样，通过比较总酸降解率确定其最佳混菌比例。1.2.3 单因素实验 1.2.3.1 初始 pH 对沙棘汁总酸降解率的影响以发酵温度 31，发酵时间 18 h，接种量 7%，初始pH 分别为 3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 的条件下进行复合乳酸菌发酵，确定其优选初始 pH。1.2.3.2 发酵温度对沙棘汁总酸降解率的影响以初始 pH3.4，发酵时间 18 h，接种量 7%，发酵温度分别为 25、28、31、34、37 的条件下进行复合乳酸菌发酵，确定其优选发酵温度。1.2.3.3 发酵时间对沙棘汁总酸降解率的影响以初始 pH3.4，发酵温度 31，接种量 7%，发酵时间分别为 6、12、18、24、30 h 的条件下进行复合乳酸菌发酵，确定其优选发酵时间。1.2.3.4 接种量对沙棘汁总酸降解率的影响以初始 pH3.4，发酵温度 31，发酵时间 18 h，接种量分别为 1%、3%、5%、7%、9%的条件下进行复合乳酸菌发酵，确定其优选接种量。1.2.4 响应面优化复合乳酸菌降酸工艺以初始pH（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、接种量（D）为因素，总酸降解率为响应值，优化复合乳酸菌降酸的工艺参数，因素与水平编码表见表 1。1.2.5 总酸降解率的测定采用张晟等4的方法测定总酸降解率。按式（1）计算总酸降解率。总酸降解率(%)=m1m2m1100式（1）式中：m1表示未经发酵的沙棘汁总酸含量，g/L；m2表示发酵后沙棘汁总酸含量，g/L。1.2.6 黄酮含量的测定采用 NaNO2-Al（NO3）3比色法测定沙棘发酵汁黄酮含量8。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=0.4595x0.0084（R2=0.9968）。1.2.7 多酚含量的测定采用 Folin-ciocalteu 法测定沙棘发酵汁多酚含量8。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=8.8017x+0.0059（R2=0.9993）。1.2.8 总酸含量的测定参照国标 GB/T 12456-2021食品安全国家标准 食品中总酸的测定中 pH 计电位滴定法，总酸含量以苹果酸计。1.2.9 pH 测定pH 计直接测定。1.2.10 TSS 的测定阿贝折射仪法测定。1.2.11 还原糖含量的测定采用 3,5-二硝基水杨酸比色法测定9。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=0.7117x0.0472（R2=0.9993）。1.2.12 有机酸含量的测定参考樊秋元等10的方法，略作修改。HPLC 条件如下：色谱柱：VP-ODS 柱（150 mm4.6 mm I,d，5 m）；流动相为 20 mmol/LKH2PO4溶液（pH2.8）；流速为 0.8 mL/min；柱温 30；进样量 20 L；等度洗脱 10 min，并在 210 nm 处使用紫外检测器进行监测。标准溶液配制：分别配制奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、抗坏血酸、草酸、酒石酸等浓度为 4、4、3、3、1、1、1 mg/mL 的母液，根据需要稀释到不同浓度，用 0.45 m 微孔滤膜过滤后分别进样。在分析 表 1 Box-Behnken 试验设计因素及水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design水平A初始pHB发酵温度（）C发酵时间（h）D接种量（%）13.42812303.63118513.834247 表 2 有机酸标准曲线Table 2 Organic acid standard curve有机酸回归方程相关系数线性范围（mg/L）苹果酸y=1337.8x+23.251.0000104000奎宁酸y=1065.9x11.210.999964000乳酸y=951.28x29.870.999543000柠檬酸y=1783.9x+2.731.0000253000抗坏血酸y=11731x+32.820.999921000草酸y=18749x61.2720.999321000酒石酸y=3191.7x+28.730.999011000第 44 卷 第 18 期宁志雪，等：复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及特性分析 237 前，将不同沙棘汁样品稀释 10 倍，并通过 0.45 m尼龙微滤器过滤。所测有机酸标准曲线见表 2。1.2.13 DPPH 自由基清除能力测定采用张琪等11的方法，略有改动。吸取 2 mL 沙棘稀释液于比色管中，加入 0.5 mL 的 0.5 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合均匀，暗处 37 反应 20 min 后，在 517 nm 处测样品吸光值 A1。用相应体积的无水乙醇分别代替DPPH 乙醇溶液与样液，重复上述操作，分别测定对照组 A2和空白组 A0的吸光度值，并按式（2）计算清除率。DPPH自由基清除率(%)=A0(A1A2)A0100式（2）式中：A1=2 mL样液+0.5 mL DPPH；A2=2 mL样液+0.5 mL 无水乙醇；A0=2 mL 无水乙醇+0.5 mLDPPH。1.2.14 ABTS+自由基清除能力测定采用张璇12的方法，略有改动。吸取 0.4 mL 沙棘稀释液于比色管中，加入 3.6 mL 的 ABTS+工作液混合均匀，暗处室温反应 20 min 后，在 734 nm 处测样品吸光值A1。用相应体积的蒸馏水分别代替 ABTS+工作液与样液，重复上述操作，分别测定对照组 A2和空白组A0的吸光度值，并按式（3）计算清除率。ABTS+自由基清除率(%)=A0(A1A2)A0100式（3）式中：A1=0.4 mL 样液+3.6 mL ABTS 工作液；A2=0.4 mL 样液+3.6 mL 蒸馏水；A0=0.4 mL 蒸馏水+3.6 mL ABTS 工作液。1.2.15 铁离子还原能力（FRAP）的测定参照倪俊等13的方法将配置好的醋酸缓冲液、TPTZ 溶液、FeCl3溶液按照体积比 10:1:1 混合得到 FRAP 溶液。分别取 0.5 mL 不同浓度的 FeSO4溶液与 3 mLFRAP 溶液充分混合，37 下反应 30 min，在 593 nm下测定吸光值。以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：y=0.0011x+0.114（R2=0.9972）。1.3数据处理所有试验重复三次，结果采用表示，使用 Origin8.6、Design-Expert V8.0.6 和 SPSS 26.0 软件进行数据处理与分析，以及图表制作。2结果与分析 2.1不同乳酸菌比例对沙棘汁总酸降解率的影响通过沙棘汁的总酸降解率来评价其发酵能力和质量，由表 3 可知，酒酒球菌与短乳杆菌复合菌种发酵，可使沙棘汁总酸含量降低。在沙棘汁发酵中，酒酒球菌与短乳杆菌比例为 1:0 时的总酸降解率低于0:1，表明在沙棘汁降酸实验中，短乳杆菌的降酸效果要优于酒酒球菌，这可能由于初始 pH 过低抑制了酒酒球菌生长5。复合菌种发酵时，在酒酒球菌短乳杆菌比例为 1:1、1:2、2:1 的条件下，总酸降解率都要优于酒酒球菌或短乳杆菌单独发酵，表明两种乳酸菌是可以协同发酵的。另外，混菌发酵可使果汁口感更加柔和，并有明显香味物质生成14。当菌株比例1:1 时，沙棘发酵汁总酸含量与其他比例复合菌之间无显著差异（P0.05），且更易于操作，因此，选择酒酒球菌:短乳杆菌比例 1:1 作为沙棘汁后续发酵接种用菌株比例。表 3 乳酸菌配比对沙棘汁总酸降解率的影响Table 3 Effect of lactobacillus ratio on total acid degradationrate of sea buckthorn juice乳酸菌配比总酸降解率（%）6 h12 h18 h24 h30 h1:011.570.08a16.980.55b25.420.84d22.560.27c21.751.12c2:113.311.83a23.731.26b28.510.15c28.050.35c27.950.50c1:112.811.12a23.040.98b29.700.28d28.300.43cd27.340.21c1:212.311.12a23.141.12b28.900.01c28.350.21c28.650.21c0:113.211.12a22.241.26b27.311.54c27.210.56c26.400.69c注：同行字母不同表示差异显著（P0.05）；表6表8同。2.2初始 pH 对沙棘汁总酸降解率的影响由图 1 可知，沙棘汁总酸降解率在初始 pH3.23.6 时呈上升趋势，在 pH3.6 时发生显著增高（P0.05），达到最大值 35.51%，说明 pH 为 3.6 时最适宜这两种乳酸菌的生长，而较低的初始 pH 使总酸降解率下降，这可能是因为低 pH 会使乳酸菌细胞内环境和蛋白质结构发生变化，从而抑制了乳酸菌生长和代谢15。沙棘汁总酸降解率在初始 pH 大于 3.6 时呈下降趋势，这可能是由于过高的 pH 对苹果酸-乳酸酶等关键酶的合成起不到诱导作用16，使得总酸降解率下降。这一规律与韩诚武等17在实验中明确的苹果酸降解率随初始 pH 的增加先上升后下降的研究结果一致。因此，优选初始 pH 为 3.6 进行响应面试验。4035302520153.23.43.63.84.0总酸降解率(%)pH值bceda图 1 初始 pH 值对沙棘汁总酸降解率的影响Fig.1 Effect of initial pH on total acid degradation rate of seabuckthorn juice注：同一条曲线上不同字母表示其差异显著（P0.05），这与张晟等4报道的苹果酸降解率伴随发酵温度升高而先上升后下降的规律不同，可能是由于酒酒球菌与短乳杆菌的适宜生长温度和代谢温度产生了互补。李维妮3通过实验也证明了复合乳酸菌活菌数在较高的温度下无显著变化，从而进一步使总酸降解率变化不明显。因此，优选发酵温度为 31 进行响应面试验。323028262422a2528313437bcdd总酸降解率(%)发酵温度()图 2 发酵温度对沙棘汁总酸降解率的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on total aciddegradation rate of sea buckthorn juice 2.4发酵时间对沙棘汁总酸降解率的影响如图 3 可知，当发酵时间低于 18 h 时，随着发酵时间的增加，沙棘汁总酸降解率也不断增加。在发酵 18 h 时，沙棘汁总酸降解率上升到最高值（P0.05），这可能是因为接种量大，乳酸菌克服滞后时间快，使细胞的代谢能力完全恢复，同时，Selma 等22的研究结果表明在克服滞后时间后，乳酸菌最大生长量不会受到接种量大小的影响。因此，总酸降解率变化不明显。这与辛宇等23在实验中明确的灵芝菌发酵北五味子果汁中接种量对总酸降解率的影响一致。因此，在本实验中优选接种量为 5%进行响应面试验。302826242220181613579总酸降解率(%)接种量(%)abccc图 4 接种量对沙棘汁总酸降解率的影响Fig.4 Effect of inoculation amount on total acid degradationrate of sea buckthorn juice 2.6响应面试验结果与分析 2.6.1 模型的建立与分析以初始 pH（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）和接种量（D）为试验因素，总酸降解率 Y（%）为评价指标进行响应面设计，其试验设计及结果见表 4。上述试验结果通过多元回归方程拟合，得初始pH、发酵时间、发酵温度、接种量为影响因素的多元二次方程为：Y=38.21+5.21A+0.96B+2.54C+0.31D2.27AB5.34AC3.53AD2.76BC0.80BD2.37CD6.16A23.48B26.38C22.75D2。从表 5 可知模型 P0.05，模型校正决定系数 R2Adj=0.9710，决定系数 R2值为 0.9855，表明该模型与实验拟合程度较好，可用于复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸过程的分析和优化。由 F 值可知，各因素对沙棘汁总酸降解率的影响大小顺序为 ACBD，即初始pH发酵时间发酵温度接种量。2.6.2 数学模型及响应面分析响应曲面坡度越陡峭、等高线越密集以及形状呈现椭圆形或马鞍形都表明该因素变化或两因素间的交互作用越显著24。由图 5 和表 5 可知，模型中 A、B、C、AB、AC、AD、3025201510612182430总酸降解率(%)发酵时间(h)abdcbc图 3 发酵时间对沙棘汁总酸降解率的影响Fig.3 Effect of fermentation time on total acid degradation rateof sea buckthorn juice 第 44 卷 第 18 期宁志雪，等：复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及特性分析 239 BC、CD、A2、B2、C2、D2对 Y 影响极显著（P0.01）。在所有交互项中，AC 交互作用对响应值的影响最强，表明初始 pH 与发酵时间的交互作用对沙棘汁总酸降解率的影响最为显著，由图 5b 可知，随着初始pH 和发酵时间的增加，沙棘汁总酸降解率先增加后趋于平缓，且发酵时间曲面的坡度与初始 pH 相比较为平滑，说明初始 pH 影响大于发酵时间。图 5d 呈现出发酵时间和发酵温度之间显著的交互作用，其中发酵时间曲面陡于发酵温度，说明发酵时间的影响程度大于发酵温度，与方差分析结果一致。2.6.3 响应面优化结果及验证以沙棘汁总酸降解率的最大化为目标，预测得到的优选发酵条件为：初始 pH3.68，发酵温度 30.54，发酵时间 18.21 h，接种量 4.79%。在此条件下，回归方程模型对沙棘汁总酸降解率的预测值为 39.33%。考虑实际操作的便利性，将发酵参数调整为：初始 pH3.7，发酵温度 31，发酵时间 18 h，接种量 5%，在上述条件下进行 3 次平行实验，验证得到沙棘汁总酸降解率为 38.51%0.64%，相对误差为 2.08%，说明模型可靠。2.6.4 沙棘汁发酵过程中主要理化指标的变化由表 6 可知，在发酵到 18 h 时，除还原糖外，黄酮、多酚、总酸、pH 和 TSS 含量与发酵前均具有显著性差异（P0.05）。多酚与黄酮含量在发酵过程中都呈现出先上升后下降趋势，在经过 18 h 的发酵后达到最大值，分别比发酵前增加了 44.74%和 22.22%。乳酸菌在发酵过程中产生大量水解酶，使沙棘细胞壁被破坏，与木质素结合在一起的黄酮被释放25，使黄酮含量上升。多酚类物质增多，可能是在发酵后产生了糖苷酶和酚酯酶，能水解结合的酚类化合物形成游离酚，使总酚含量增加26。发酵过程中总酸含量呈现出下降趋势，由初始的 8.49 g/L 下降至 18 h 时的 5.22 g/L，下降了 38.52%，表 4 沙棘汁降酸工艺的响应面试验设计与结果Table 4 Response surface experiment design and results ofreducing acid process of sea buckthorn juice实验号A初始pHB发酵温度（）C发酵时间（h）D接种量（%）Y总酸降解率（%）13.42818519.5323.82818535.9533.43418526.0043.83418533.3353.63112323.4563.63124335.0373.63112728.1183.63124730.2393.43118319.90103.83118336.27113.43118728.62123.83118730.88133.62812521.61143.63412528.95153.62824532.49163.63424528.81173.43112514.05183.83112534.80193.43124527.74203.83124527.12213.62818330.29223.63418333.91233.62818732.19243.63418732.59253.63118538.37263.63118539.11273.63118538.35283.63118537.41293.63118537.81 表 5 回归模型方差分析结果Table 5 Variance analysis results of regression model方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1101.521478.6868.030.0001*A-初始pH325.631325.63281.550.0001*B-温度11.08111.089.580.0079*C-时间77.27177.2766.810.0001*D-接种量1.1811.181.020.3287AB20.66120.6617.860.0008*AC114.171114.1798.720.0001*AD49.77149.7743.040.0001*BC30.36130.3626.250.0002*BD2.5912.592.240.1566CD22.37122.3719.340.0006*A2246.001246.00212.700.0001*B278.37178.3767.760.0001*C2264.301264.30228.530.0001*D248.99148.9942.360.0001*残差16.19141.16失拟项14.54101.453.510.1187纯误差1.6640.41注：*差异极显著，P0.01；*差异显著，P0.05）的研究结果相同。2.6.5 沙棘汁发酵过程中有机酸的变化酒酒球菌与短乳杆菌发酵沙棘汁，改变了其有机酸的含量，发酵过程中沙棘汁中有机酸的变化见表 7。发酵前有机酸以苹果酸和奎宁酸为主，分别为 6.2340.200和 9.8690.179 mg/mL，其次为柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸、乳酸和草酸。发酵 18 h 后有机酸比例和含量发生了明显变化，以乳酸和奎宁酸为主，含量分别为 10.3720.618 和 9.8540.432 mg/mL。在发酵时间为 018 h 的范围内，沙棘汁中苹果酸含量快速降低，在发酵时间至 18 h 时苹果酸含量降低了 94.59%，4035302520101576543 1215182124总酸降解率(%)D:接种量(%)C:发酵时间(h)403530252015343332313029283.43.53.63.73.8总酸降解率(%)B:发酵温度()A:pH40353025201510242118151224211815123.43.53.63.73.8总酸降解率(%)C:发酵时间(h)A:pH4035302520101540353025201015765433.43.53.63.73.8总酸降解率(%)D:接种量(%)A:pH28293031323334总酸降解率(%)C:发酵时间(h)B:发酵温度()abced图 5 各因素交互作用的响应面图Fig.5 Response surface diagram of interaction of factors 表 7 沙棘汁发酵过程中有机酸的动态变化Table 7 Dynamic changes of organic acids in sea buckthorn juice during fermentation类别（mg/mL）发酵时间（h）0612182430苹果酸6.2340.200d2.6930.205c0.8430.057b0.3370.145a0.4980.191a0.3650.073a奎宁酸9.8690.179b8.5950.175a9.9710.359b9.8540.432b9.5030.177b9.5530.137b抗坏血酸0.1150.009a0.1100.023a0.1070.018a0.1080.024a0.1050.021a0.1000.024a乳酸1.0330.210a2.3130.198b5.9600.195c10.3720.618e9.4110.223d10.3190.735e酒石酸1.5030.068ab1.5230.072ab1.6550.128b1.4370.120a1.5580.109ab1.4650.126ab草酸0.1770.024a0.1630.015a0.1850011a0.1680.011a0.1650.005a0.1720.009a柠檬酸0.4370.037a0.4400.077a0.3550.037a0.4210.051a0.4000.079a0.3980.043a第 44 卷 第 18 期宁志雪，等：复合乳酸菌发酵沙棘汁降酸的工艺优化及特性分析 241 乳酸含量增加了 904.07%。奎宁酸、抗坏血酸、酒石酸、草酸和柠檬酸含量在发酵前后没有显著变化（P0.05）。2.7沙棘汁发酵过程中抗氧化活性的变化由图 6 可以看出，DPPH、ABTS+自由基清除率与 FRAP 总体呈现先上升后降低趋势。在 024 h时，DPPH 自由基清除率由最初 62.61%上升至78.20%，ABTS+自由基清除能力在发酵 18 h 时达到最大值，为 64.48%，较发酵之前提高了 20.38%，对FRAP 来说，发酵时间为 1824 h 是发酵的较佳时期，其维持在 1.1626 mmol/L 左右。由此可以看出，沙棘汁通过乳酸发酵可以不同程度提高 DPPH 和ABTS+自由基的清除率以及 FRAP，这