葛根素治疗阿尔茨海默病作用机制的网络药理学及分子对接研究.pdf

2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 上海中医药杂志葛根素治疗阿尔茨海默病作用机制的网络药理学及分子对接研究巴宗韬1，高外毛2，热爱拉 阿合力江1，徐颖2，王健11.上海中医药大学康复医学院（上海 201203）；2.上海中医药大学中西医结合学院（上海 201203）【摘要】目的运用网络药理学及分子对接的方法探究葛根素（Pue）干预阿尔茨海默病（AD）的分子作用机制，并进行动物实验验证。方法通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、集成药效团匹配平台（PharmMapper）等获取Pue的作用靶点，利用人类基因综合数据库（GeneCards）获取AD相关靶点，映射后获取交集靶点，应用Cytoscape v3.9.1 软件构建蛋白质相互作用网络图，并筛选出核心靶点进行基因功能富集分析、信号通路分析和分子对接；通过基因鉴定将5月龄的早老素1/2条件性双基因敲除（PS cDKO）小鼠给予Pue（100 mg/kg）的腹腔注射治疗，然后进行行为学测试，测试结束后取材进行分子生物学检测。结果通过筛选获得 Pue干预 AD的核心靶点共 118个。基因本体论（GO）功能富集分析得到 148个条目（P0.05），其中生物过程条目100个，细胞组成条目23个，分子功能条目25个；京都基因和基因组百科全书数据库（KEGG）通路分析富集得到11条信号通路（P0.05），主要包括AD信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等。分子对接结果显示，Pue与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、白蛋白（ALB）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）可以对接。行为学结果显示，Pue可以改善PS cDKO小鼠受损的空间记忆（P0.05）。免疫印迹（Western blot）结果显示，Pue下调了PS cDKO小鼠前额皮质中细胞外调节蛋白激酶（Erk1/2）的磷酸化水平的表达，并抑制了裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）的表达水平。结论基于网络药理学和实验研究表明，Pue可以通过多靶点、多通路发挥对AD的干预作用，在临床和新药研发中具有参考价值。【关键词】阿尔茨海默病；葛根素；网络药理学；分子对接；作用机制；中药研究Network pharmacology and molecular docking study on the mechanism of action of puerarin for Alzheimers diseaseBA Zongtao1，GAO Waimao2，AHELIJIANG Reaila1，XU Ying2，WANG Jian11.School of Rehabilitation，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.School of Integrative Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，ChinaAbstract：Objective To investigate the molecular mechanism of action of Puerarin（Pue）in intervening Alzheimers disease（AD）based on network pharmacology and molecular docking methods，and conduct animal experimental verification.MethodsUse Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），Integrated Pharmacophore Matching Platform（PharmaMapper），etc，to obtain the target of Pue.Use The Human Gene Database（GeneCards）to obtain AD related targets and intersection targets after mapping.Apply Cytoscape v3.9.1 to construct protein interaction network diagrams，and screen out core targets for GO enrichment analysis，KEGG signaling pathway analysis and molecular docking.The 5-month-old progerin-1/2 conditional double knockout（PS cDKO）mice were treated with intraperitoneal injection of Pue（100 mg/kg）based on gene identification，followed by behavioral testing，and after that the sample material was taken for molecular biological testing.ResultsA total of 118 core targets for Pue intervention in AD were obtained through screening.GO functional enrichment analysis revealed 148 items（P0.05），including 100 items for biological process，23 items for cell composition，and 25 items for molecular function.KEGG pathway analysis enriched 11 signaling pathways（P0.05），mainly including Alzheimers disease signaling pathway，phosphatidylino-sitol 3-kinase/protein kinase B（PI3K/AKT）signaling pathway and mitogen-activated protein kinase（MAPK）signaling pathway，etc.Molecular docking results showed that Pue had better docking activity with AKT Serine/Threonine Kinase 1（AKT1），cysteine proteinase 3（CASP3），albumin（ALB），epidermal growth factor receptor（EGFR），tumor DOI：10.16305/j.1007-1334.2023.2302040基金项目 国家自然科学基金项目（82174003）作者简介 巴宗韬，男，硕士研究生，主要从事中医药防治老年病的机制研究工作通信作者 王健，副研究员，硕士研究生导师；E-mail：wangjiant 。徐颖，教授，博士研究生导师；E-mail：33上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 necrosis factor（TNF），and vascular endothelial growth factor A（VEGFA）.Behavioral results showed that Pue could improve the impaired spatial memory in PS cDKO mice（P0.5，隐藏离散蛋白节点，构建 Pue-AD 疾病靶点 PPI并导出。使用Cytoscape 3.9.1软件对PPI网络进行分析和优化处理，利用Network Analyzer分析其Degree等网络拓扑特征值。以超过度中心性的中位数作为筛选标准，选取核心靶点。2.4GO 富集分析和 KEGG 信号通路分析将 Pue 干预AD的核心靶点通过进一步的基因注释和通路分析，确定其代表的功能。将核心靶点导入DAVID数据库与KEGG数据库，限定物种为人，设定阈值P0.05，然后进行基因功能和通路富集分析，并依据P-vaule值排序，对分析结果进行可视化处理。2.5分子对接验证选取PPI网络图中Degree值排名前 6 的靶点与 Pue 进行分子对接。从 SWISS-MODEL（https：/swissmodel.expasy.org）数据库中获取 PPI 网络中度值前6的靶标蛋白的PDB ID，依次输入PDB蛋白质结构数据库（RCSB PDB，https：/www.rcsb.org），在数据库获取对应蛋白结构的PDB格式文件。在Pymol软件中对Pue的mol2格式文件进行预处理并转换为PDB格式，再将Pue PDB格式文件与所有蛋白PDB格式文件在AutoDockTools 1.5.7软件中进行去水、加氢和电荷平衡等预处理，并获取Pue与所有蛋白结构的口袋位置参数，然后导出为PDBQT格式文件。应用Vina软件进行分子对接得到分子结合效能（affinity）。应用 Pymol软件对结果进行可视化处理。2.6动物实验验证2.6.1动物SPF小鼠 40只，体质量为（253）g，雌雄各半，由华东师范大学脑功能基因组学研究所赠送。对于PS cDKO小鼠的繁殖和鉴定方法同前期研究4，其中携带转基因 Cre，PS1 和 PS2 的基因型为 fPS1/fPS1、PS2-/-的小鼠作为PS cDKO小鼠，不携带Cre基因且PS1和 PS2的基因型为 PS1+/+、PS2+/+的小鼠作为 WT小鼠。所有小鼠均饲养在上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房，饲养温度为（222），明暗交替周期为12 h，自由饮水与摄食。动物生产合格证号：SCXK（沪）2017-0011。动物使用许可证号：SYXK（沪）2020-0009。与实验动物相关的实验操作遵守伦理规定，经过上海中医药大学实验动物管理和使用委员会批准（伦理批准号：PZSHUTCM221017015）。2.6.2药物Pue，上海同田生物技术股份有限公司（批号：1601262）；二甲基亚砜（DMSO），美国 Sigma-Aldrich公司（批号：D2650）；兔抗裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3），美国CST公司（批号：9661S）；兔抗细胞外调节蛋白激酶 p44/42 MAPK（Erk1/2），美国CST公司（批号：4695S）；兔抗磷酸化细胞外调节蛋白激酶 p-p44/42 MAPK（Erk1/2），美国 CST 公司（批号：4370S）。2.6.3主要仪器及软件多功能酶标仪，美国 BioTek公司（型号：Synergy2）；电泳仪，美国 Bio-Rad 公司（型号：PowerPacTMHC）；全自动凝胶成像仪，上海天能公司（型号：Tanon-4200SF）；VisuTrack啮齿类动物行为分析软件，上海欣软公司（型号：XR-VT）；ImageJ软件，美国National Institutes of Health公司。2.6.4分组与干预将5月龄的PS cDKO小鼠随机分为模型组（PS cDKO）和模型+Pue组（cDKO+Pue）；将同窝野生型小鼠随机分为野生型组（WT）和野生型+Pue组（WT+Pue）。每组10只。WT+Pue组和cDKO+Pue组的小鼠给予Pue（100 mg/kg）的腹腔注射治疗，WT组和cDKO组的小鼠给予相同溶媒0.02%DMSO注射，共治疗30 d，然后进行行为学测试，测试结束后取材进行分子生物学检测。第31天进行行为学测试，行为学测试期间继续如前给予Pue治疗。2.6.5检测指标与方法2.6.5.1Y迷宫实验Y迷宫实验是利用啮齿动物对新异环境的探索天性，测定动物的空间识别记忆能力。Y迷宫实验具体操作参照前期研究3，Y迷宫用于测试动物的辨别记忆、参考记忆、工作记忆，由3个完全相同的臂（30 cm6 cm15 cm）组成，各个臂之间夹角是120。小鼠始终从同一臂出发，将另一臂定义为新异臂后将其封闭，使小鼠自由探索8 min。1 h后将新异臂打开，使小鼠探索整个迷宫8 min。计算得到小鼠在新异臂停留的时间比和进入新异臂的次数。两次实验之间清理迷宫，使用75乙醇驱除小鼠残留气味。2.6.5.2Western blot实验小鼠麻醉后在冰上取海马放于液氮中冷冻，实验时用预冷的组织裂解缓冲液以及1 mmol/L苯甲烷磺酰氟、蛋白酶和磷酸酶抑制剂裂解所需组织。在4、15 000 r/min的条件下离心30 min获得裂解液，提取核蛋白并定量。每样取40 g用10%和12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）作用，然后转移到硝化纤维素膜上。将在4 与一抗Cleaved Caspase-3（11 000）、兔抗 p44/42 MAPK（Erk1/2）（11 000）、兔抗 p-p44/42 MAPK（Erk1/2）（1 35上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 2 000）孵育一夜的硝化纤维素膜与酶标二抗（1 3 000）在室温下孵育1 h，并使用发光底物进行孵育。用全自动凝胶成像仪扫描条带，用ImageJ软件对蛋白条带强度进行定量。相对蛋白水平归一化为-肌动蛋白水平。2.7统计学方法用 SPSS Statistics 24.0 软件进行数据分析，组间数据比较采用单因素方差分析（单因素ANOVA）。计量资料采用x s表示，以P12.110 79的靶点为 AD 的潜在靶点。最终得到 1 130 个靶点。在Venny 2.1.0平台将预测的药物成分靶点与AD靶点取交集，得到交集靶点 118 个，并绘制韦恩（Venn）图。见图2。3.3构建 PPI将“3.2”中所获得的 118 个靶点利用String数据库分析，构建PPI模型。见图3。将String数据库结果导入Cytoscape 3.9.1软件中对PPI网络进行分析和可视化处理，节点颜色及大小的变化与度中心性呈正相关，因此可直观获得Pue治疗AD的核心靶点。PPI网络具有比预期更多的边缘，表明这些蛋白质至少部分地作为一个群体进行生物学连接，整个网络高度互动。结果显示，Pue治疗AD的效应机制可能与丝氨酸/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 1（AKT1）、半 胱 氨 酸 蛋 白 酶（CASP3）、白蛋白（ALB）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）等蛋白相关。3.4GO 富集分析和 KEGG 信号通路分析对 Pue 干预AD的核心靶点通过DAVID数据库进行GO富集分析，共得到 GO 条目 148 个（P0.05）。其中生物过程（BP）条目100 个，细胞组成（CC）条目23个，分子功能（MF）条目25个，见图4。其中BP条目主要涉及Erk1和Erk2级联的正调节（positive regulation of Erk1 and Erk2 cascade）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联的正调节（positive regulation of MAPK cascade）、蛋白质磷酸化的正调节（positive regulation of protein phosphorylation）、蛋白质自磷酸化（protein autophosphorylation）等；CC条目主要涉及谷氨酸能突触（glutamatergic synapse）、突触后膜（postsynapse）、神经元细胞体（neuronal cell body）等；MF 条 目 主 要 涉 及 相 同 蛋 白 结 合（identical protein binding）、酶结合（enzyme binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、蛋 白 质 丝 氨 酸/苏 氨 酸/酪 氨 酸 激 酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）等。再对核心靶点进行KEGG通路富集分析，得到11条信号通路（P0.05），分别为白介素-17（IL-17）信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路、AD信号通路、核因子-B（NF-B）信号通路、环磷酸腺苷（cAMP）信号通路、激酶Janus 和转录因子 STAT（JAK-STAT）信号通路等，见图 5。将上述靶点输入KEGG数据库做通路图富集，选择代表性的通路图进行展示，见图5。上述表明Pue通过调控多条信号通路来干预AD的发展。3.5分子对接分析本研究分子对接结果显示见表1。结果进行可视化展示，见图6。表明Pue可通过与其相应的靶点受体结合而影响其功能，在AD治疗中发挥重要作用。3.6Y迷宫实验结果结果表明，与WT小鼠比较，PS cDKO小鼠在新臂的停留时间和探索新臂的次数均降低（P0.05），表明 PS cDKO 小鼠的空间识别记忆能力受损；经过Pue治疗后，这些情况发生了逆转（P0.05），表明Pue可以改善PS cDKO小鼠的空间识别记忆障碍。见图7。3.7Western blot实验结果与WT组比较，cDKO组小鼠前额皮质p-Erk1/2蛋白水平升高（P0.05）；与cDKO组比较，cDKO+Pue组小鼠前额皮质p-Erk1/2蛋白水平降低（P0.05）。与WT组比较，cDKO组小鼠前额皮质Cleaved Caspase-3蛋白水平升高（P0.05）；与 cDKO组比较，cDKO+Pue组小鼠前额皮质Cleaved Caspase-3蛋白水平降低（P0.05）。见图8。注：Pue为葛根素，AD为阿尔茨海默病。图2葛根素治疗阿尔茨海默病靶点的韦恩图36上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 注：A为交集靶点的蛋白质相互作用网络模型，B为其模型可视化分析。图3葛根素治疗阿尔茨海默病的靶点37上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 图4基因本体论数据库（GO）富集结果注：A为KEGG通路富集结果，B为阿尔茨海默病相关信号通路。图5京都基因和基因组百科全书数据库（KEGG）通路筛选38上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 4讨论近年来研究5显示天然化合物尤其是中药及其产物可以通过作用于多种机制来抑制AD的发生和发展，在药物开发困境尚未突破的今天，中药因为其多靶点治疗效应，已经成为AD药物开发的潜在对象。葛根为豆科植物葛的块根，于春、秋两季采挖，洗净后去除外皮，切片干燥后使用。神农本草经 言其能平消渴，除大热，止呕吐，通诸痹，起阴气，解诸毒。Pue是从葛根中分离的异黄酮类衍生物。药物代谢动力学显示，作用于体内后Pue主要分布于心脏、肺、脾、胃、乳房、肝、肾及血浆、睾丸、肌肉、胫骨和股骨，并可透过血脑屏障进入脑内6。Pue可以减轻蛛网膜下腔出血小鼠的神经功能缺损，有效减轻脑水肿，保护血脑屏障；并可能是通过B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）/Bcl-2相关蛋白质（Bax）/Cleaved Caspase-3 和去乙酰化酶 3（Sirt3）/超氧化物歧化酶2（SOD2）凋亡途径减轻蛛网膜下腔出血小鼠的神经功能缺损。7 Pue还在一定程度上恢复了AD模型小鼠海马和大脑皮质内脑源性神经营养因子、tau蛋白磷酸化、丙二醛、乙酰胆碱酯酶、糖原合成酶激酶-3的水平，以及SOD的活性，表明Pue可能对A诱导的认知损伤具有保护作用8。Pue 为葛根的特有异黄酮，研究9显示口服高剂量Pue在大鼠体内吸收较好，且安全性良好。Pue在AD中发挥神经保护作用的研究10主要涉及PI3K/AKT、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、Caspase-3、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）等信号通路，可通过抑制氧表1分子对接结果靶标（Target）AKT1ALBCASP3EGFRTNFVEGFAPDB编号（PDB ID）1UNQ6QIO6CKZ5WB77KPB4ZFF效能（affinity，kcal mol-1）-5.812-9.872-7.063-8.599-8.103-7.818注：AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1，ALB为白蛋白，CASP3为半胱氨酸蛋白酶 3，EGFR 为表皮生长因子受体，TNF 为肿瘤坏死因子，VEGFA为血管内皮生长因子A。注：A为葛根素-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1），B为葛根素-白蛋白（ALB），C为葛根素-半胱氨酸蛋白酶3（CASP3），D为葛根素-表皮生长因子受体（EGFR），E为葛根素-肿瘤坏死因子（TNF），F为葛根素-血管内皮生长因子A（VEGFA）。图6分子对接结果可视化展示注：A为小鼠在新臂的停留时间，B为小鼠探索新臂的频率。WT为野生型组，WT+Pue为野生型+葛根素组，cDKO为模型组，cDKO+Pue为模型+葛根素组。与cDKO组比较，*P0.05；n=10，x s。图7Pue对小鼠的空间识别记忆障碍的影响39上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 化应激、凋亡、A产生和沉积，降低tau蛋白过度磷酸化，调控铁代谢、抑制脂质过氧化、抗炎和改善突触可塑性，以及可能抑制铁死亡等机制，在AD中具有独特的药理作用。我们所做的网络药理学研究与上述众多实验性结果高度重合，并提供了更多尚未被验证的可能通路与机制。图5B中红色椭圆形区域内为Pue治疗AD的核心靶点，选取其中一条Ca2+-Erk1/2-CASP3-cell death通路进 行 验 证，而 CASP3 已 在 分 子 对 接 中 得 到 验 证。Western blot结果显示，Pue抑制了PS cDKO小鼠Erk1/2的磷酸化水平和 Cleaved Caspase-3 的表达水平。研究11表明，细胞间Ca2+水平升高会诱导内质网应激，并构成显著的促凋亡信号。此外，Ca2+也是细胞凋亡和自噬的刺激因子12-13。Rosen等14发现，Ca2+的内流或存储释放激活了PC12细胞和初级皮质神经元中的Ras蛋白。接下来Ca2+/钙调蛋白依赖的Ras蛋白特异性鸟嘌呤核苷酸释放因子 1（Ras-GRF1）的发现直接证实了Ca2+调节Ras活性15，而在Erk通路中，Ras作为上游激活蛋白，Raf作为MAPK之一，MAPK/Erk激酶（MEK）作为丝裂原活化蛋白激酶-激酶（MAPKK），形成Ras-Raf-MEK-Erk通路16。Erk1/2属于MAPK家族，在信号级联中发挥作用，并将细胞外信号传递到细胞内靶点。Erk级联是高度调控的级联，负责基本的细胞过程，包括细胞增殖和分化。这些调节因素影响双特异性磷酸酶17、支架蛋白18、信号持续时间和强度19以及级联成分的动态亚细胞定位20。Erk通路上游蛋白和激酶的过度激活已被证明可诱导各种疾病，包括癌症、炎症、发育障碍和神经障碍21。正常情况下，磷酸化的Erk1/2在脑内主要分布于神经纤维，可能参与调节神经元突起的发生，延长和稳定突触的形成22。在病理情况下，Erk1/2信号通路广泛参与脑血管病、脑损伤、AD等多种神经系统疾病的发生及发展过程。Erk1/2信号通路的持续性激活会启动凋亡级联反应，激活下游的Caspase-3，最终导致神经元凋亡。Caspase-3是一切细胞凋亡信号传导的共同通路，能够接受上游信号，自身被激活后作用于特异性底物使细胞凋亡，在凋亡级联反应中起关键作用。据估计，神经系统发育过程中产生的原始细胞群有一半通过细胞凋亡的方式被清除，如此便可以优化突触连接23。在发育中的神经系统中，凋亡在神经管形成的早期被观察到，并在涉及神经元、胶质细胞和神经祖细胞的神经网络的最终分化过程中持续存在。Kuida等24通过基因工程的方法生成了Caspase-3缺陷小鼠，该小鼠Caspase-3的缺陷导致了其神经系统凋亡的重要缺陷，在胚胎发育期间或在1至3周龄期间就因为脑细胞数量增多引起的脑畸变而死亡。此实验证明了Caspase-3依赖性细胞凋亡在神经系统发育中起重要作用。研究25表明，早老素（PS1和PS2与早发性家族性AD有关）在细胞凋亡过程中被Caspase-3裂解，Caspase-3也能在体外裂解纯化的PS。Louneva等26发现在对照组和AD病例中，Caspase-3在突触后选择性富集。此外，与同年龄的对照组相比，AD患者突触内pro Caspase-3和激活的Caspase-3表达水平显著增加，表明活跃的Caspase-3可能导致进行性突触变性并最终导致突触丧失，这是AD认知能力下降的最佳病理关联27。本研究显示，运用网络药理学的手段对 Pue治疗AD的潜在靶点与分子机制进行预测，能够让实验者在注：p-Erk1/2为磷酸化的细胞外调节蛋白激酶，Erk1/2为细胞外调节蛋白激酶，Cleaved Caspase-3为裂解的半胱氨酸蛋白酶-3，-actin为-肌动蛋白。WT为野生型组，WT+Pue为野生型+葛根素组，cDKO为模型组，cDKO+Pue为模型+葛根素组。与cDKO组比较，*P0.05；n=6，x s。图8各组前额皮质p-Erk1/2、Erk1/2、Cleaved Caspase-3蛋白表达情况40上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第9 期 Shanghai J Tradit Chin Med，Vol.57，No.9，Sept.2023 实验设计中把握主要方向，缩小研究目标，其重要作用不言而喻，在整个实验研究中的优先级更在预实验之前。同时本研究也提示Pue治疗AD具有多通路、多靶点同时作用的特点，预测到的分子机制也为后续开展Pue的基础药理学研究提供了方向。参考文献：1 KNOPMAN D S，AMIEVA H，PETERSEN R C，et al.Alzheimer disease J.Nat Rev Dis Primers，2021，7（1）：33.2 ELDER G A，GAMA SOSA M A，DE GASPERI R，et al.Presenilin transgenic mice as models of Alzheimers diseaseJ.Brain Struct Funct，2010，214（2-3）：127-143.3 ZHANG L，ZHANG Z，FU Y，et al.Trans-cinnamaldehyde improves memory impairment by blocking microglial activation through the destabilization of iNOS mRNA in mice challenged with lipopolysaccharideJ.Neuropharmacology，2016，110（Pt 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