甘薯小孢子发育时期与花器外观形态的相关性.pdf

第41 卷第2 期2023年5月文章编号：2 0 9 5-42 9 8(2 0 2 3)0 2-0 0 2 4-0 5江苏师范大学学报（自然科学版）Journal of Jiangsu Normal University(Natural Science Edition)Vol.41,No.2May,2023甘薯小孢子发育时期与花器外观形态的相关性焦伟静1,2，刘兰服，严景洲，胡亚亚1，韩美坤1，高志远，陈敬辉1.，王颖帅1，刘艳芬2*，马志民1*（1.河北省农林科学院粮油作物研究所/河北省作物遗传育种实验室，河北石家庄0 50 0 35；2.河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸0 56 0 38；3.保定市种子工作站，河北保定0 7 1 0 51)摘要：为研究甘薯小孢子发育时期与花器外观形态的相关性，以冀粉2 号、广薯1 5-1 56 和紫罗兰为试验品种，选取不同纵径、横径的花蕾，采用醋酸洋红染色法对小孢子发育时期进行细胞学观察，确定小孢子不同发育时期及其形态特征，并对花蕾大小与小孢子发育时期的对应关系进行分析.结果表明：3个甘薯品种小孢子发育过程主要经历小孢子母细胞时期、四分体时期、单核期和成熟花粉粒期，每个发育时期特征明显；小孢子发育时期与花器外观形态密切相关，花蕾大小可以作为判断小孢子发育时期的主要依据；3个甘薯品种小孢子处于单核期时，花蕾明显变大，花萼顶端有开裂，花蕾纵径为9.30 9.41 mm，横径为2.52 2.53mm，花药长度为1.2 9 1.46 mm.研究结果可为甘薯花药或小孢子培养提供细胞学依据.关键词：甘薯；小孢子；发育时期；花器形态；相关性中图分类号：S531Correlation between microspore development stage and floralJiao Weijingl.2,Liu Lanfu,Yan Jingzhou,Hu Yaya,Han Meikun,Gao Zhiyuan,Chen Jinghuil-?,Wang Yingshuai,Liu Yanfen?*,Ma Zhimin*(1.Key Laboratory of Crop Genetics&.Breeding of Hebei/Institute of Cereal&.Oil Crops,Hebei Academy ofAgriculture&Forestry Sciences,Shijiazhuang 050035,Hebei,China;2.College of Landscape&Ecological Engineering,Hebei University of Engineering,Handan 056038,Hebei,China;3.Baoding Seed Workstation,Baoding 071051,Hebei,China)Abstract:To explore the correlation between the microspore development stage and the morphology of floral organ insweetpotato,Jifen 2,Guangshu 15-156 and Violet were used as test varieties.Flower buds with different longitudi-nal and transverse diameters were selected.The cytological observation of microspore development stage was carriedout by using Aceto-Carmine staining method to determine the different development stages of microspore and theirrespective morphological characteristics,and the correspondence relationship between bud size and microspore devel-opment stage was analyzed.The results showed that the microspore development of the three sweetpotato varietiesmainly experienced microspore mother cell stage,tetrad stage,the uninucleate stage and mature pollen grain stage,with obvious characteristics in each development stage.The development stages of microspore were closely related tothe morphology of floral organs,and the bud size could be used as the main basis for judging the development periodof microspore.When the microspores of the three sweetpotato varieties were at the uninucleate stage,the flowerbuds became significantly larger,the top of the calyx was cracked,the longitudinal diameters of the flower budswere 9.30-9.41 mm,the transverse diameters of the flower buds were 2.52-2.53 mm,and the lengths of the an-thers were 1.29-1.46 mm.The results could provide cytological basis for anther or microspore culture of sweet-potato.Key words:sweetpotato;microspore;development stage;floral organ morphology;correlation文献标志码：Aorgan morphology in sweetpotatodoi:10.3969/j.issn.2095-4298.2023.02.005收稿日期：2 0 2 2-1 1-2 8基金项目：财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系资助项目（CARS-10-C1），河北省农林科学院科技创新专项课题资助项目（2 0 2 2 K JCXZX-LYS-1 2），河北省农林科学院基本科研业务费基金项目（2 0 2 1 0 6 0 2 0 7），河北省重点研发计划项目（2 2 32 2 91 1 D），河北省现代农业产业技术体系创新团队项目（HBCT2018080203），河北省高层次人才资助项目（A202003009）作者简介：焦伟静，女，研究实习员，硕士研究生，主要从事甘薯育种与花药培养研究，E-mail：1 7 2 53547 95 q q.c o m.*通信作者：马志民，男，研究员，主要从事甘薯育种与栽培生理研究，E-mail：s p 1 37 8 51 8 1 2 59 1 6 3.c o m；刘艳芬，女，教授，主要从事园艺、园林植物组织培养与栽培应用研究，E-mail:.第2 期甘薯又称红薯、白薯、地瓜等，为旋花科一年或多年生草本植物，原产于南美洲，因其抗旱耐、适应性广，已成为世界上重要的粮食、饲料及工业原料作物.随着其抗氧化、增强免疫力以及预防肿瘤、糖尿病等保健和药用功能被逐渐认可，甘薯越来越受到人们的欢迎。甘薯属短日照、营养体繁殖的同源六倍体作物，具有自交不亲和特性，遗传背景复杂，杂交育种需在不孕群间选择亲本，严重制约了甘薯的育种效率.通过花药培养技术诱导单倍体是提高甘薯育种效率的有效途径，该技术操作简单，广泛应用于多种作物.据报道，花药培养是小麦单倍体诱导中最成熟和应用成果最多的技术，已培育出2 3个花培小麦新品种，并大面积推广种植，取得了良好的社会经济效益1.辣椒也通过花药培养技术获得单倍体，选育出塞花一号、海花三号、豫0 7-0 1、海丰1 6 号、海丰1052等品种，推广并取得了经济效益2-6 .1 97 0 年代以来，先后有多位学者开展了甘薯花药培养研究，但均未获得单倍体植株7-9.由于甘薯花药愈伤组织诱导率低，器官分化难度大，花药诱导单倍体植株仍处于探索阶段，国内外相关研究少有报道1 0 1.前人研究表明，当小孢子发育到一定时期，受到外界刺激后，配子体将转向孢子体发育成花粉植株1 1 .选择适宜的小孢子发育时期是花药培养诱导单倍体成功的关键因素1 2-1 4.褚云霞等1 5 对百合花药培养研究发现，当小孢子处于单核期时，对应的花蕾大小为2 42 6 mm，此阶段诱导率最高，容易出愈伤组织.吴艺飞1 6 发现，小孢子单核靠边期适宜菜墓花药的培养和小孢子培养，单核靠边期对应的花蕾长度为2.53.5mm.王家旭等1 0 l发现，单核期或单核靠边期适宜甘薯及近缘野生种花药的培养，花萼取材长度为9 1 0 mm.花药培养前，需通过镜检的方法判断小孢子的发育时期，该过程费时费力，且会导致小孢子活力降低，死亡率和污染率增加1 7 .辛建华等1 8 研究发现，加工番茄小孢子发育时期与花器外部形态特征具有密切关系.为确定甘薯小孢子发育时期与花器外观形态的对应关系，本试验观察了冀粉2 号、广薯1 5-1 56 和紫罗兰3个甘薯品种的花器形态，以及不同发育阶段小孢子的细胞学特征，从而确定小孢子在不同发育阶段的花器官形态特征，为甘薯花药培养的取材时期提供依据，以及为构建甘薯花药培养体系奠定基础。1材料和方法1.1试验材料选择冀粉2 号、广薯1 5-1 56 和紫罗兰3个品种焦伟静，等：甘薯小孢子发育时期与花器外观形态的相关性及颜色，并拍照记录.1.2.2小孢子发育时期细胞学观察将花蕾置于4mL离心管中，用甲醛-乙酸-乙醇固定液（FAA）固定，常温下保存备用.在解剖镜下剥离出花药，在载玻片上用解剖针和解剖刀将花药捣碎，用醋酸洋红染色，去除残渣，盖上盖玻片，静置1 min后，在酒精灯上烤一下，放置在OLYMPUSBX41光学显微镜下进行观察.分别在1 0 X、40 X、6 0 和1 0 0 物镜下观察小孢子发育过程的不同发育时期，并拍照记录.1.2.3数据分析使用Excel进行数据处理，并采用SPSS21.0软件进行差异显著性分析.2结果与分析2.1甘薯小孢子发育时期细胞学特征细胞学观察结果表明，冀粉2 号、广薯1 5-1 56和紫罗兰3个甘薯品种的小孢子发育过程主要经历了4个发育时期.各甘薯品种小孢子不同发育时期的形态特征见图1.由图la可以看出，一个单一大细胞，体积大，染色深，细胞核明显，为小孢子母细胞时期特征.小孢子母细胞减数分裂后，显示为一个正四面体形，肼眠质壁把4个小孢子包围在一起，即为四分体时期（图1 b)；四分体的肼质壁被分解后，释放出游离小孢子,最后形成单个细胞，细胞核位于细胞中间位置，核大，染色清晰可见，即为单核期（图1c)；进人小孢子发育后期，花粉孔凸起，形成成熟的花粉粒结构，即为成熟花粉粒期（图1 d).由此可见，3个甘薯品种小孢子发育过程主要经历小孢子母细胞时期、四分体时期、单核期和成熟花粉粒期，且每个发育时期特征明显.2.2甘薯小孢子发育时期与花器大小的对应关系2.2.1小孢子母细胞时期与花器大小的对应关系冀粉2 号、广薯1 5-1 56 和紫罗兰3个甘薯品种小孢子母细胞时期花蕾及花药大小对应结果见表25的甘薯作为试验材料.其中，冀粉2 号、紫罗兰为河北省农林科学院粮油作物研究所自主繁育，广薯15-156引自广东省农业科学院作物研究所.在河北省农林科学院粮油作物研究所的堤上试验站内诱导各品种现蕾开花.1.2试验方法1.2.1花蕾和花药的形态学观察与测量于晴天上午9:0 0 一1 1:0 0 取样，选取健壮植株上的花蕾装人取样袋，冷藏备用.选择纵径为6 1 4mm的花蕾，以1 mm为级差进行分级，每级选取30 个花蕾，精准测定其纵径、横径，再从中随机选择1 0 个花蕾在解镜下剖离出花药，测量其长度，观察形态特征261.由表1 可知，在小孢子母细胞时期，不同品种花蕾纵径、花药长度虽有所不同，但品种间的差异性均不显著；紫罗兰花蕾横径显著低于其他2 个品种，而花蕾纵横径比显著高于其他2 个品种.由于各品种花蕾纵径、花药长度2 个指标在不同品种间发育表现较为一致，因此，本试验中花蕾纵径区间为6.92 7.04mm、花药长度区间为0.6 7 0.7 2 mm，可作为判断小孢子母细胞发育时期的主要依据.花蕾横径及纵横径比2 个指标因在品种间具有差异性，建议作为辅助判断指标。江苏师范大学学报（自然科学版）2.2.2小孢子四分体时期与花器大小的对应关系由表1 知，冀粉2 号、广薯1 5-1 56 和紫罗兰3个甘薯品种小孢子四分体时期花蕾纵径、花药长度同小孢子母细胞发育时期一样，在3个甘薯品种间仍然无显著差异，但花蕾横径、纵横径比产生了显著差异，冀粉2 号的花蕾横径增至最大，显著高于其他2个品种，纵横径比显著低于其他2 个品种.因此，花蕾纵径区间8.348.38 mm、花药长度区间0.961.0 8 m m 可以作为判断小孢子四分体发育时期的主要依据.花蕾横径以及纵横径比，建议作为辅第41 卷冀粉2 号广薯1 5-1 56紫罗兰a.小孢子母细胞时期(1 0 0）Fig.1 Cytological characteristics of microspores at different development stagesTab.1Flower buds and anthers sizes of microspore in 4 development stages of 3 sweetpotato varieties小孢子发育时期品种母细胞时期冀粉2 号广薯1 5-1 56紫罗兰四分体时期冀粉2 号广薯1 5-1 56紫罗兰单核期冀粉2 号广薯1 5-1 56紫罗兰成熟花粉粒期冀粉2 号广薯1 5-1 56紫罗兰注：同一发育时期，同一列数据后不同小写字母表示差异显著（P0.05).b.四分体时期(1 0 0)图1 小孢子不同发育时期的细胞学特征表1 3个甘薯品种小孢子4个发育时期花蕾及花药大小花蕾纵径/mm6.920.01 a6.990.05a7.040.02 a8.360.01 a8.380.17 a8.340.20a9.30 0.17 a9.410.23a9.410.01 a11.400.01a11.460.05 a11.920.01ac.单核期(1 0 0)花蕾横径/mm2.060.01 a1.980.05a1.850.02 b2.320.01 a2.210.70 b2.180.20 b2.52 0.17 a2.530.23a2.520.01 a3.090.01a3.090.05 a3.200.01ad.成熟花粉粒期(1 0 0)花蕾纵横径比花药长度/mm3.360.01 b0.670.02 a3.530.05b0.720.01 a3.800.02a0.720.02a3.600.01b0.960.02a3.790.17 a1.070.01 a3.830.20a1.080.02a3.69 0.17 a1.290.02a3.720.23a1.460.01 a3.730.01 a1.430.02 a3.690.01a2.360.02a3.710.05 a2.470.01 a3.730.01 a2.410.02a第2 期助指标.2.2.3小孢子单核期与花器大小的对应关系由表1知，3个甘薯品种在小孢子单核期，花蕾纵径、横径、纵横径比以及花药长度4个主要花器官大小指标，均无显著差异，说明甘薯品种的花器官大小在小孢子单核期不因品种不同而不同.本试验中花蕾纵径区间为9.3 0 9.41mm，花蕾横径区间为2.522.53mm，花蕾纵横径比区间为3.6 9 3.73花药长度区间为1.2 9 1.46 mm，以上指标可以作为甘薯品种在单核期的花器官外观指示指标，进而可作为不同甘薯品种小孢子单核期的取材依据.2.2.4小孢子成熟花粉粒期与花器大小的对应关系由表1知，3个甘薯品种在小孢子成熟花粉粒期，花蕾纵径、横径、纵横径比以及花药长度4个主要花器官大小指标，均无显著差异，说明甘薯品种的花器官大小不因品种不同而不同.花蕾纵径区间为11.4011.9 2 m m，花蕾横径区间为3.0 9 3.20mm，花蕾纵横径比区间为3.6 93.7 3，花药长度区间为2.36 2.47 mm，以上指标可以作为判断甘薯小孢子成熟花粉粒发育时期的依据.2.3甘薯小孢子发育时期与花器外部形态的关系观察解剖显示，冀粉2 号、广薯15-156 和紫罗兰3个品种花蕾外部形态特征和花药颜色相近（表2、图2），但花蕾的颜色因品种不同而不同，冀粉2号和广薯15-156 的花蕾颜色为绿色略带粉，紫罗兰为紫色.3个品种小孢子母细胞时期，花蕾较小，萼片闭合，其他时期花蕾外观描述见表2.因3个品种的花蕾形态、花萼开裂状态以及花药颜色在小孢子发育过程中呈现一致性，故它们可以作为判断取材时期的依据。焦伟静，等：甘薯小孢子发育时期与花器外观形态的相关性被萼片包被单核期花蕾明显变大，花萼顶端有开裂，被萼片包被成熟花粉粒期花蕾充分膨大，萼片裂口开张角度明显，被萼片包被3讨论与结论通过花药培养来诱导再生单倍体植株，是提高育种效率的有效途径.小孢子发育时期是决定花药培养单倍体植株成功的关键，适宜发育时期的小孢子较易产生愈伤组织，进而产生花粉胚，最终再生单倍体.因此，确定小孢子发育时期是花药培养前期的关键环节.前人在黄花菜、湖北海棠、番茄和火龙果等多种植物上的研究表明19-2 2，小孢子发育时期和花器形态具有一定的对应关系.本试验通过对冀粉2号、广薯15-156 和紫罗兰3个甘薯品种花器官的形态学观察和小孢子发育时期的细胞学观察发现，小孢子发育时期与花器官形态也具有一定的对应关系.因此，甘薯花药培养时，可以根据花蕾和花药的外部形态特征来确定小孢子发育时期及合适的取材时期，而无需通过镜检，从而简化取材程序，节约时间.在甘薯小孢子发育过程中，3个品种的花蕾纵径与花药长度在4个阶段均无显著差异，可以作为判断小孢子发育时期的主要形态依据.小孢子发育早期（小孢子母细胞时期与四分体时期），品种不同，花蕾横径、纵横径比不同，且差异显著；小孢子发育后期27表2 冀粉2 号、广薯15-156 和紫罗兰小孢子不同发育时期花蕾及花药外部形态特征Tab.2 External morphological characteristics of flower budsand anthers of Jifen 2,Guangshu 15-156 and Violet atdifferent development stages of microspore小孢子发育时期母细胞时期花蕾较小，萼片闭合，被萼片包被四分体时期花蕾稍膨大，少许花萼稍有开裂，花蕾外观花药颜色白绿色白绿色白绿色黄色花蕾123456781234567812345678花药123456781234567812345678a.冀粉2 号b.广薯15-15618表示花蕾的纵径区间分别为6.0 0，7.0 0）、7.0 0，8.0 0）、8.0 0，9.0 0）、9.0 0，10.0 0）、10.00,11.00)、11.0 0,12.0 0)、12.0 0,13.0 0)13.0 0,14.0 0 m m.Fig.2 Flower buds and corresponding anthers of three varietiesc.紫罗兰图2 3个品种的花蕾及对应的花药28（单核期与成熟花粉粒期），3个品种的这2 个指标之间无显著差异.由此说明，甘薯小孢子发育过程中，各品种的花蕾纵径与花药长度的增长表现一致.虽然不同品种小孢子在发育过程中，横径的增长快慢呈现差异性，但最终外观大小的差别不显著.国外学者已在辣椒2 3、结球甘蓝2 4、大白菜2 5上获得了单倍体植株或建立了花药培养技术体系，我国学者已在皱叶甘蓝、小麦、马铃薯等植物上获得单倍体植株2 6-2 91.197 9年，Tasy等首次由甘薯花药诱导出体细胞胚并发育成植株8.王家旭等9对7 个甘薯栽培品种和1个二倍体野生种（I.leucantha）的花药进行组织培养，其中只有2 个栽培品种和野生种看到了根的分化，均未获得单倍体植株.本试验结果表明，甘薯小孢子发育过程中主要经历4个时期，即小孢子母细胞时期、四分体时期、单核期和成熟花粉粒期，各时期特征明显，与王家旭等10 的研究结果一致.小孢子发育时期与花器外观形态密切相关，花蕾大小可以作为判断小孢子发育时期的主要依据.3个甘薯品种小孢子处于单核期时，花蕾明显变大，花萼顶端有开裂，花蕾纵径为9.30 9.41mm，横径为2.522.53mm，花药长度为1.2 9 1.46 mm.研究结果可为甘薯花药或小孢子培养提供细胞学依据.参考文献：1马强，余国东，李伯群，等.小麦单倍体诱导技术研究进展J.南方农业，2 0 10，4（6）：7 2.2陈肖师.甜椒花药培养及塞花一号 的育成J.中国蔬菜,19 8 8(3):5.3李春玲，蒋钟仁.甜椒花培新品种海花三号的育成J.园艺学报，19 9 0,17（1)：39.4张晓伟，姚秋菊，蒋武生，等.辣椒新品种豫0 7-0 1的选育J.中国蔬菜，2 0 13（4）：10 4.5邢永萍，张树根，李春林，等.甜椒新品种海丰16 号的选育J.中国蔬菜，2 0 14（6）：49.6张树根，邢永萍，张军民，等.辣椒新品种海丰10 52 J.中国蔬菜，2 0 15（5）：6 3.7Sehgal C B.Regeneration of plants from anther cul-tures of sweet potato（I p o m o e a b a t a t a s Po i r.)JJ.ZPflanzenphysiol Bd,1978,88:349.8 Tsay H S,Tseng M T.Embryoid formation and plant-let regeneration from anther callus of sweetpotatoJ.Bot Bull Acad 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