氟中毒对肉鸡促红细胞生成素和红细胞膜ATP酶的影响.pdf

第 7 卷第 2 期2023 年 6 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.2Jun.2023收稿日期:2022-10-10基金项目:河南省高等学校重点科研项目(20B230006);河南牧业经济学院校级重点学科建设项目(XJXK202202)。作者简介:刘玲玲(1987),女,河南辉县人,实验师,博士。通信作者:张磊(1979),男,河南西平人,讲师,博士。氟中毒对肉鸡促红细胞生成素和红细胞膜 ATP 酶的影响刘玲玲,李德印,李先芳,沈永恕,张 磊(河南牧业经济学院 动物医药学院,河南 郑州 450046)摘要:研究氟中毒对肉鸡促红细胞生成素(EPO)和红细胞膜 ATP 酶的影响。选用 240 只 1 日龄的健康萨索肉鸡,随机分为对照组(F,11 mg/kg)、高氟 1 组(F,300 mg/kg)、高氟 2 组(F,600 mg/kg)、高氟 3 组(F,900 mg/kg)四组,正常饲喂,分别于染毒第 14 天、28 天和 42 天检测网织红细胞数目、红细胞膜的 ATP 酶活性、红细胞渗透脆性、血清中促红细胞生成素等血液相关指标。结果表明,氟中毒导致肉鸡血液网织红细胞数量降低、红细胞膜 ATP 酶活性降低,红细胞渗透脆性增加、血清促红细胞生成素(EPO)含量降低,是导致肉鸡发生贫血的根本原因之一。关键词:氟;肉鸡;贫血;促红细胞生成素;红细胞膜 ATP 酶中图分类号:S859.8 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)02-0001-05Effect of dietary high fluoride on the erythropoietin and erythrocyte membrane ATPase activity in chickenLIU Lingling,LI Deyin,LI Xianfang,SHEN Yongshu,ZHANG Lei(College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou Henan 450046)Abstract:To study the effects of fluorosis on erythropoietin(EPO)and erythrocyte membrane ATPase of broilers.A total of 240 one-day-old healthy Sasso broilers were randomly divided into four groups:control group(F,11 mg/kg),high fluoride group 1(F,300 mg/kg),high fluoride group 2(F,600 mg/kg)and high fluoride group 3(F,900 mg/kg).The number of reticulocyte,ATPase activity of erythrocyte membrane,osmotic fragility of erythrocyte,erythropoietin in serum and other blood-related indexes were detected at 14,28 and 42 days after exposure,respectively.The results showed that fluorosis was one of the fundamental causes of anemia in broilers,which resulted in decreased number of erythrocytes,decreased activity of erythrocyte membrane ATPase,increased osmotic fragility of erythrocyte and decreased serum erythropoietin(EPO)content.Key words:Fluoride,chicken,anemia,erythropoietin,erythrocyte membrane ATPase1刘玲玲,等:氟中毒对肉鸡促红细胞生成素和红细胞膜 ATP 酶的影响 氟是动物机体必需的微量元素之一,在自然环境中广泛存在,具有蓄积毒性,对动物的危害主要表现在其对机体的多器官、多系统性损伤等,能造成多种机能和形态的异常改变1,2。近年来,人畜氟中毒的报道日益增多,氟污染已经严重威胁到当地畜禽和人类的健康3。大量研究表明,氟中毒会引起机体发生贫血4,5,能够显著降低肉仔鸡血细胞数、血清溶菌酶和补体 C3、C4 含量6。促红细胞生成素(EPO)作为调控红细胞生成的重要糖蛋白激素,在抵抗外界因素对动物机体红细胞的损伤过程中发挥着重要作用7,8,目前有关氟中毒对肉鸡EPO 含量的影响尚未见报道,本试验通过构建肉鸡氟中毒模型,观察氟中毒对肉鸡的血液学相关指标的影响,探讨氟中毒对肉鸡红细胞的毒性以及 EPO在其致肉鸡贫血中的作用。1 材料与方法1.1 试验动物与主要试剂1 日龄健康萨索肉鸡购自郑州雪霞农业科技有限公司;分析纯氟化钠(NaF)购自于 Sigma 公司;煌焦油蓝染液、Ca2+-Mg2+-ATPase 试剂盒、Na+-K+-ATPase 试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所;EPO 检测试剂盒购自于美国 ADL 公司;全自动血细胞分析仪购自深圳迈瑞医疗器械有限公司。1.2 试验方案选取 240 只 1 日龄健康萨索肉鸡,试验方法参考黄俊祥等6方法进行,随机分为 4 组,每组 60 只。对照组饲喂基础日粮(F,11 mg/kg,以实际氟含量计,下同),试验组分别在基础日粮中添加不同剂量的 NaF:高氟 1 组(F,300 mg/kg)、高氟 2 组(F,600 mg/kg)、高氟 3 组(F,900 mg/kg),常规雏鸡饲养管理,自由采食与饮水,分别于试验第 14 天、28 天和42 天进行心脏采血用于检测。1.3 指标测定1.3.1 血液学指标检测采用全自动血细胞分析仪测定血液中血红蛋白(Hb)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)等指标。1.3.2 网织红细胞数目检测心脏采血后,取一滴全血加入含有煌焦油蓝染液的玻片上,混匀,室温静置 510 min。取适量的混匀液制备血涂片,置于油镜下观察。选取红细胞分布均匀且染色质量较好的部分进行计数,统计每1000 个红细胞中网织红细胞的数目。1.3.3 红细胞膜的 ATP 酶活性检测采用无机磷比色法进行红细胞膜的 ATP 酶活性检测。按照试剂盒说明书进行操作,分别检测红细胞膜的 Na+-K+-ATPase 和 Ca2+-Mg2+-ATPase活性。1.3.4 红细胞渗透脆性的检测采用浓度梯度法测定红细胞对不同浓度的低渗氯化钠溶血的抵抗力,即红细胞渗透脆性。取30 L 肝素抗凝血,分别加入到不同浓度(0.65%、0.60%、0.55%、0.50%、0.45%、0.40%、0.35%、0.30%、0.25%)的低渗氯化钠溶液试管中,室温静置 2 h 后,于分光光度计 510 nm 波长处比色,与完全溶血管进行比较,计算溶血度。溶血的判定标准如表 1 所示。表 1 红细胞渗透脆性试验溶血的判定标准溶血类型观察现象指示结果无溶血上清液无色,管底为混浊红色或有沉淀的红细胞。不完全溶血上清液呈淡红色,管底为混浊红色。红细胞的最大脆性完全溶血管内液体完全变成透明的红色,管底无细胞沉积。红细胞的最小脆性1.3.5 促红细胞生成素(EPO)含量的检测分离血清后,参考 EPO 检测试剂盒说明书进行操作,将酶标仪的波长设置为 450 nm,该条件下测定标准品和样品的吸光度(OD)值,标准品浓度及 OD 值绘制标准曲线,计算出样品中 EPO 的含量。2刘玲玲,等:氟中毒对肉鸡促红细胞生成素和红细胞膜 ATP 酶的影响1.4 数据统计与分析试验数据以平均值标准差表示,采用 SPSS 22.0统计学软件 One way-ANOVA 分析比较各组数据间的差异显著性,并用 LSD 法进行多重比较,P0.05为差异显著,P0.05),HCT、MCV和 MCHC 降低,无显著差异(P0.05),MCH 显著降低(P0.05);高氟 2 组 HCT 和 MCHC 显著降低(P0.05),Hb 和 MCH极显著降低(P0.05)外,高氟 1 组和高氟 2 组其余血液学指标与对照组相比显著或极显著降低(P0.05 或 P0.01);试验期间,试验组血液学指标与对照组相比极显著降低(P0.01)。表 2 氟中毒后血液学指标的变化指标组别14 天28 天42 天对照组117.6257.103136.6755.283141.0586.360Hb/(g/L)高氟 1 组118.1736.459127.0038.241115.00610.592 高氟 2 组104.51710.412 113.0195.625 95.4346.096 高氟 3 组102.2857.326 93.4087.634 89.6898.755 对照组29.3171.96627.0412.56327.7432.329HCT/(%)高氟 1 组28.8312.21524.4301.94222.2012.145 高氟 2 组27.5162.157 21.5192.383 20.0051.601 高氟 3 组24.3892.562 20.7332.149 17.5022.548 对照组122.3023.913120.5062.360123.2121.225MCV/(fL)高氟 1 组122.0472.675114.1101.848112.2011.232高氟 2 组120.5161.672 111.0323.531102.7543.133 高氟 3 组113.8352.855104.2262.089 88.8951.995 对照组54.0671.50251.2440.56352.5454.109MCH/(pg)高氟 1 组51.2001.71747.8003.946 44.2171.454 高氟 2 组48.1112.157 44.3203.422 40.0663.660 高氟 3 组47.3874.562 42.0554.367 37.5493.583 对照组432.0024.964431.6068.286434.57110.477MCHC/(g/L)高氟 1 组429.3306.778412.3747.492397.6118.145 高氟 2 组410.1607.730388.7377.903 380.60811.541 高氟 3 组389.00910.533 373.9025.448 357.8196.510 注:肩标表示与对照组相比差异显著(P0.05),表示差异极显著(P0.01),下表同2.2 氟中毒后血液中网织红细胞的变化如表 3 所示,与对照组相比,试验第 14 天时高氟 1 组血液网织红细胞数显著升高(P0.05),高氟2 组和高氟 3 组血液网织红细胞数降低,差异显著或极显著(P0.05 或 P0.01);试验第 28 天和 42天,各试验组血液网织红细胞数与对照组相比显著或极显著降低(P0.01)。2.3 氟中毒后红细胞膜 ATP 酶活性的变化如表 4 所示,整个试验期间,与对照组相比,高氟 1 组红细胞膜 Na+-K+-ATPase 活性显著降低(P0.05),高氟 2 组和高氟 3 组红细胞膜 Na+-K+-ATPase 活性显著降低(P0.05),高氟 2 组红细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性显著降低(P0.05),高氟3 组红细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性显著降低(P0.01)。试验第 28 天,高氟 1 组红细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性显著降低(P0.05),高氟 2 组和高氟 3 组红细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性显著降低(P0.01);试验第 42天,各试验组红细胞膜 Ca2+-Mg2+-ATPase 活性显著降低(P0.05),高氟 2组红细胞渗透脆性显著升高(P0.05),高氟 3 组红细胞渗透脆性显著升高(P0.01)。试验第 28 天,与对照组相比,高氟 1 组红细胞渗透脆性显著升高(P0.05),高氟 2 组和高氟 3 组红细胞渗透脆性显著升高(P0.01);试验第 42 天,各试验组红细胞渗透脆性与对照组相比显著升高(P0.01)。表 5 氟中毒后红细胞渗透脆性的变化g/L组别14 天28 天42 天对照组0.340.090.330.070.340.05高氟 1 组0.340.060.390.090.440.10 高氟 2 组0.390.10 0.470.12 0.490.11 高氟 3 组0.440.09 0.500.08 0.510.09 2.5 氟中毒后促红细胞生成素(EPO)含量的变化如表 6 所示,试验第 14 天,与对照组相比,高氟1 组血清 EPO 含量显著升高(P0.05),高氟 2 组和高氟 3 组血清 EPO 含量显著降低(P0.05 或 P0.01);试验第 28 天和 42 天,各试验组血清 EPO 含量显著降低(P0.01)。3 讨论 研究证实,氟在体内的蓄积是引起机体代谢性贫血的原因之一9,10。本试验结果显示,氟中毒导致 Hb 含量显著降低,结合王美玲等11报道的氟中毒会导致肉鸡血液红细胞数目的降低,表明氟中毒会引起肉鸡发生贫血。高氟 1 组在染毒后第 14 天时,引起肉鸡血液红细胞数目和网织红细胞数目的上升,推测可能是由于过量氟的摄入,导致机体动员其它血液储备器官释放红细胞,同时骨髓新生成的网织红细胞数会暂时升高。随着染毒剂量的加大及持续时间延长,毒性作用超过了机体自身代偿能力,导致机体红细胞数、血红蛋白含量以及网织红细胞数目会表现明显降低,直接影响到机体的造血功能。表 6 氟中毒后促红细胞生成素(EPO)含量的变化mIU/mL组别14 天28 天42 天对照组16.812.0318.924.3718.061.65高氟 1 组18.032.2414.551.86 14.333.59 高氟 2 组15.773.49 9.912.78 10.202.18 高氟 3 组11.803.12 7.112.62 7.962.32 本研究数据表明,肉鸡氟中毒降低了红细胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase 和 Na+-K+-ATPase 活性,增加了红细胞的渗透脆性,与多项研究结果一致12-14。细胞膜 ATP 酶活性受到抑制,一方面改变细胞膜的抗氧化酶系统,引起机体细胞的 ATP 活力明显下4刘玲玲,等:氟中毒对肉鸡促红细胞生成素和红细胞膜 ATP 酶的影响降;另一方面会导致细胞内外离子与水分的调控失衡、膜电位的改变,最终红细胞膜脆性明显增大,加剧肉鸡贫血的发生15,16,这与本试验中 Hb 及渗透脆性的变化结果相一致。EPO 是一种由肾脏产生的调控红细胞生成的糖蛋白激素,它能够刺激并加快肉鸡各发育阶段的幼红细胞分裂,促进红细胞成熟。另外,EPO 还具有抗氧化,稳定红细胞膜的功能等作用17。氟中毒严重损伤了动物机体的肾脏功能,从而影响了 EPO的生成18-20。本试验中高氟 1 组随着染毒时间的延长,肉鸡血清 EPO 含量先略微增加后又降低,而高氟 2 组和 3 组血清 EPO 含量显著降低,说明肉鸡血清 EPO 含量与染毒的剂量和中毒时间有密切关系,且氟在动物机体内有较强的蓄积毒性。此外,EPO 能够平衡细胞膜内外的正常渗透压,血清中EPO 减少会导致机体的红细胞膜流动性降低,完整性被破坏,从而影响红细胞的生成,加重肉鸡的溶血性贫血症状。参考文献:1 Dvoclkovcl-Hortovcl K,Andera M,Jursovcl M,et al.The influence of fluorides on mouse sperm 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