国家重点研究疾病及医疗发展管理知识规划.docx

《国家重点基础研究发展规划》

项目结题总结报告

项目名称：心脑血管疾病发病和防治的基础研究
项目编号：G2000056900
起止年月：2000年9月——2005年9月
首席科学家：唐朝枢
联系地址：北京大学第一医院心血管病研究所
电话及传真: Tel：[phone]
Fax：[phone]
E-mail：tangchaoshu@.

主要承担单位：北京大学医学部 中国医学科学院
复旦大学 上海第二医科大学
第二军医大学

项目依托部门：卫生部 教育部

2005年9月

表一 973计划项目结题基本信息表
项目编号：2000056900
项目名称
心脑血管疾病发病和防治的基础研究
起止年月
2000年 9月至 2005年 9月
项目首席科学家
唐朝枢
单位
北京大学医学部
依托部门
卫生部，教育部
参加人员总数
??
第一承担单位
北京大学医学部
承担单位数
5
项目总经费
4851.9万元
其中973计划资助总额
2805.6万元
累计部门、单位匹配
1379.2万元
累计从研究单位获得的人员费
667.1万元
累计获得的其它资助
——
项目执行情况
01
01按期结题 02提前结题 03延期结题 04其他
课

题

设

置
课题编号
课题名称
课题
负责人
承担单位
起止年月
G2000056901
高血压易患脑卒中的分子机制
惠汝太
中国医学科学院心血管研究所
00.9-05.9
G2000056904
心血管细胞分化、表型转化及其在心脑血管再塑中的作用
高平进
上海第二医科大学
00.9-05.9
G2000056905
心血管活性物质功能多样性及其在高血压发病中的作用
唐朝枢
袁文俊
北京大学医学部

第二军医大学
00.9-05.9
G2000056906
高血压血管再塑时心血管活性物质受体和细胞内信号转导体系的调控与整合
张幼怡
肖瑞平
北京大学医学部
00.9-05.9
G2000056907
高血压和生物活性多肽生物信息库的建立
尚 彤
北京大学医学部
00.9-05.9
G2000056908
心血管细胞保护的分子机理
王 宪
北京大学医学部
00.9-05.9
G2000056909
心血管细胞内的分子运载体系的研究
马大龙
北京大学医学部
00.9-05.9
G2000056910
内外环境因素诱发心脑血管病的发病机理研究
刘德培

葛均波
中国医学科学院基础医学研究所
复旦大学
00.9-05.9

一、 项目主要研究内容和预期目标
研究的总体思路：以高血压及其并发症 [脑卒中，动脉粥样硬化, 心肌肥厚，心衰等] 为重点, 以心脏和血管的再塑为突破口, 以心血管活性物质为中心，上联基因下系功能---从病因、发病机制和防治基础等三个相互联系的层次研究 .
2000年任务书
研究内容 1. 内外环境致病因素诱发心血管病的分子学机理：通过分子流行病学调查和差异分析寻找出我国高血压易患脑卒中的靶分子和易感分子，研究这些靶分子和易感分子的功能及其作用途径，阐明我国高血压易发高血压脑卒中的遗传和分子学基础，为早期诊断、预防和治疗提供理论基础。主要选择我国最常见的和特有的心脑血管病的环境致病因子-高盐负荷，吸烟、高同型半胱氨酸血症、高凝状态、高脂血症和感染等，分析致病因素与机体相互作用和致病机理。分析不同环境执笔功能因素引起相同或相似的心脑血管损伤，以及同一致病因素在不同人群和个体引起不同损伤的机制。采用蛋白质组差异分析等方法分析和比较易感人群和非易感人群心血管活性物质结构、功能和调节的变异，寻找出不同环境致病因子作用的主要生物标记物（Biomarkers）和靶分子，及其作用的途径；
2. 高血压病时心脏和血管再塑的细胞和分子机理：提出和证明心血管活性蛋白分子内调控的理论；阐明我们“八五”“九五”期间新发现的HRG-1,hhLIM,Hcy-2等7种具有与心血管系统有关的具有明确功能的新基因和蛋白在心血管再塑中的作用与意义，分析心血管活性物质受体及其亚型在正常和心血管再塑时的变化，及其细胞和核内信号转导的途径，探索应用复杂体系综合研究心血管功能的新方法，逐步阐明心脑血管病心血管再塑的细胞和分子机理。计划分离、培养心血管干细胞，分析心血管成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞或心肌细胞的来源和分化的机制，寻找出调控心血管细胞分化和表型变化的关键生物活性分子和转录因子，提出心血管细胞定向分化和表型变化或相互衍变的实验证据和调控机理。分析高血压心血管再塑时，成熟（收缩）型和胚胎（合成）型心血管细胞内血管活性物质结构、功能和调节的变化，寻找出心血管再塑的始动因子、开关分子和关键分子，及其作用途径和产生心血管再塑的机制；分析高血压调控基因及其表达的生物活性物质的结构和功能的多态性，研究同一种血管功能调控蛋白不同片段的功能多样性及其在高血压心血管再塑中的作用，提出和证明心血管活性蛋白分子内调控的理论，寻找新的心血管细胞和器官的保护物质。
3. 心脑血管病防治的新技术、新方法和新药物的基础研究：建立我国心脑血管病的和生物活性物质的医学生物信息库，为全国心血管病研究、医疗提供服务；分析心血管组织细胞“预处理（preconditioning）”保护的机制，寻找和发现新的抗心脑血管病和逆转心血管再塑的生物活性分子及其作用途径，为心脑血管逼供内防治的药物开发提供新策略。发展心血管系统的细胞内基因和生物活性物质的运载体系。建立我国心脑血管病的和生物获悉功能物质的医学生物信息库。发展蛋白和核酸细胞内转移体系，使其达到安全、有效、可控、经济实用的目的，为心脑血管病的防治提供新技术、新方法和新药物。
预期目标 （1）在国际刊物上发表IF>3.0有代表性学术论文20-30篇。
（2）阐明我们在“八五”“九五”期间新发现的具有心血管功能的七种基因及其表达蛋白在心脑血管疾病种中的病理生理意义。再寻找出3-5种具有明确功能的新的心血管活性物质并阐明其在心脏和血管再塑发病中的意义。
（3）分离和培养出心脏与血管的干细胞，并明确它在心血管再塑和损伤修复中的意义。
（4）明确血管再塑内膜下细胞增生的细胞来源，阐明血管细胞（平滑肌细胞，内皮细胞，纤维母细胞等）表型改变在血管再塑中的意义及其活性物质的调节机制。
（5）以1-2种心血管生物活性多肽为例，阐明其基因和蛋白质功能的多样性及其在高血压发病中的意义，提出生物活性多肽功能多样性的模式和分子内调控的假说。
（6）寻找出2-3种我国高血压-脑卒中易感性的新的靶分子，明确其功能及临床意义，建立易感分子检测方法和脑卒中预警诊断指标。
（7）寻找出2-3种高血压易发心、肾等靶器官损伤的生物标记分子，明确其临床意义，提出相应预警指标和预期预防措施。
（8）以肾上腺素受体为例，明确不同肾上腺素受体亚型的细胞内信号转导和心脏和血管再塑发生中的网络调控，初步建立肾上腺素能受体功能复杂体系研究的模式。
（9）建立1-2种安全高效细胞内多肽或基因的转移体系，抑制细胞增殖和迁移，防治血管再塑或再狭窄，并申报临床试验。
（10）通过阐明心脑血管缺血预适应的损伤机制，明了心脑血管损伤发展过程中机体的内源性防御机制及其意义，寻找出2-3种新的抗心血管损伤和防治再塑的内源性细胞保护物质，申报1-2种防治心脑血管病的新药物。
项目后三年的任务书
研究内容 1. 内外环境致病因素诱发心血管病的分子学机理：通过病例对照找出3-5个常见的新的中国人脑卒中的遗传与环境危险因素（如HCY， Lp(a)等），确立这些危险因素在国人脑卒中的危险程度，并通过对危险因素的小规模试验干预使国人的脑卒中发病率下降。研究这些靶分子和易感分子的功能及其作用途径，阐明我国高血压易发高血压脑卒中的遗传和分子学基础，为早期诊断、预防和治疗提供理论基础。利用高同型半胱氨酸血症、高凝状态、高脂血症等对血管细胞的直接作用和感染因素对心血管系统的影响，进一步研究我们已筛选的相关基因的功能及多基因的相互作用，揭示这些危险因素导致心脑血管疾病的作用机制。分析不同环境致病因素引起相同或相似的心脑血管损伤，以及同一致病因素在不同人群和个体引起不同损伤的机制。采用蛋白质组差异分析等方法分析和比较易感人群和非易感人群心血管活性物质结构、功能和调节的变异，寻找出不同环境致病因子作用的主要生物标记物（Biomarkers）和靶分子，及其作用的途径。
2. 高血压病时心脏和血管再塑的细胞和分子机理：明确心血管活性物质相互作用在心脏血管重塑过程中的主要的调节网络关系，建立和完善心血管活性多肽功能多样性和分子内调控理论，并在实验动物和临床病人中进行初步验证。以心血管多种亚型肾上腺素受体及其细胞信号转导为重点，应用复杂体系综合研究心血管活性物质受体信号转导体系之间的相互作用以及网络调控整合，研究高血压心血管再塑时上述网络调控的改变及其病理意义，初步建立生物复杂体系初级模式。在前两年工作的基础上进一步研究细胞外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的分子机制，通过干预细胞外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，寻找出调控心血管细胞分化和表型变化的关键生物活性分子和转录因子，提出心血管细胞定向分化和表型变化或相互衍变的实验证据和研究其调控机理。分析高血压心血管再塑时，成熟（收缩）型和胚胎（合成）型心血管细胞内血管活性物质结构、功能和调节的变化，寻找出心血管再塑的始动因子、开关分子和关键分子，及其作用途径和产生心血管再塑的机制；继续寻找能阻断细胞外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的新的干预靶点。分析高血压调控基因及其表达的生物活性物质的结构和功能的多态性，研究同一种血管功能调控蛋白不同片段的功能多样性及其在高血压心血管再塑中的作用，探讨心脏血管疾病时内源性防御机制、尤其是细胞保护物质的抗炎免疫机制。在现有工作基础上进一步通过对缺氧保护和对再灌注损伤保护的分子机制研究，寻找新的心血管细胞和器官的保护物质，阐明他们再整体水平上对心血管的保护作用。
3. 心脑血管病防治的新技术、新方法和新药物的基础研究：建立、维护、扩展和完善心血管相关生物医学数据库，建立心血管活性多肽相关数据库，不断扩展和完善HeartNet，建成心血管生物医学专业网，为本项目各课题组和全国心血管病研究和医疗提供服务；分析心血管组织细胞“预处理（preconditioning）”保护的机制，寻找和发现新的抗心脑血管病和逆转心血管再塑的生物活性分子及其作用途径，为心脑血管病防治的药物开发提供新策略。在原有穿膜肽基因转移体系基础上发展壳聚糖和电脉冲基因导入体系，研究其在心血管系统中的作用特征，使其达到安全、有效、可控、经济实用的目的，为心脑血管病的研究、防治和应用提供新技术和新药物。
预期目标 1。阐明我国高血压易患脑卒中的分子遗传基础，寻找出我国高血压易患脑卒中的生物标记分子，提出预警诊断指标和早期预防的方法和措施。阐明高脂血症、高同型半胱氨酸血症和高凝状态损伤心脏血管的细胞分子机制和在心脑血管疾病发生发展中的作用；阐明我国特有的和常见的病原微生物及感染因素在心脑血管病发病中的作用，并提出预防和治疗措施。
2．研究环境-遗传多因素相互作用导致心脑血管疾病发生、发展及形成的机制，提出心血管疾病的早期诊断和预防危险因素的方法和措施，为国家医疗卫生政策的制订提供必要的理论依据。
3． 阐明高血压心血管再塑的细胞和分子机理，通过对血管干细胞分化特征研究和血管外膜成纤维细胞表型转化机制研究，分析和寻找心脑血管重塑的关键环节和细胞表型转化的关键分子与始动分子，提出防治及逆转心血管重塑的新思路与新措施。
4． 以肾上腺髓质素、心钠素为例，建立和完善心血管活性多肽功能多样性的研究模式和分子内调控的理论，并在动物实验和临床病人中获得初步验证；逐步阐明高血压时心脏和血管再塑的活性多肽网络调节机制。
5． 分析心血管再塑时肾上腺素不同受体信号转导途径的交互作用及其调控网络，阐明其网络调节关系在重塑发病中的作用与意义，初步建立受体作用的复杂体系研究的初级模式。
6． 阐明心脑血管重塑时适应性细胞保护机制，寻找出不同致病因素作用下，起主要作用的机体内源性保护分子，为开发防治心脑血管病的新药物提供基础。
7． 进一步建立、完善和扩展我国高血压和心血管生物活性物质的生物信息库。
8． 建立和发展核酸和蛋白质细胞内转移技术，为心脑血管病等重大疾病的细胞内干预治疗和研究提供新的技术支撑和基础。
在国际刊物上发表IF>3.0有代表性学术论文＞40篇。

二、 项目研究计划的完成情况
本项目组瞄准国际前沿, 积极进行源头创新, 5年来严格按照计划任务书要求不懈努力，圆满完成了预定任务，取得了一批自主创新的重要科研成果，并寻找到了一批能深入发展的、基础与临床相结合的新的支撑点，建立和发展了具有我国特色的心脑血管疾病基础研究的体系。以心血管活性物质功能和调节为中心，提出了心血管系统自身防御和保护机制的新观点。组建了国内最大规模的中国人脑卒中数据库，分析和确立了国人脑中风发病的遗传和环境危险因素，其中建立的对脑卒中和心肌梗塞的独立危险因素—血浆同型半胱氨酸的检测技术,已推广应用于临床。除对传统心脑血管疾病发病危险因素（高血脂，高血凝等）的研究外，对新确立的独立危险因素--高同型半胱氨酸血症的发病机制进行了系统研究，并提出了防治的新策略。通过临床和实验研究明确了炎症、感染和免疫因素在动脉粥样硬化发病中的作用。提出了血管外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化的新机制和防治血管重塑的新策略。通过生物活性分子功能多样性在心脑血管疾病中的发病学意义研究,提出了生物活性多肽功能多样性的‘分子内调控’模式。建立了心肌与血管平滑肌细胞肾上腺素受体（AR）及其信号转导复杂系统研究方法和数学分析的初级模型；揭示了心肌细胞β-肾上腺素受体在介导心肌细胞收缩、凋亡和肥大过程中的信号转导途径及其调控网络。明确了内源性细胞保护的活性多肽-降钙素基因相关肽（CGRP）、肾上腺髓质素（adrenomedullin）、生长素（ghrelin）等多种心血管细胞保护物质作用的分子机制，明确了诱导这些保护物质生成的免疫炎症调控机制，揭示了利用机体内源性防御机制作为防治心脑血管疾病的新途径。开展了建立大分子物质细胞内给药的新的运载体系统的探索，对心脑血管病的研究和治疗具有前瞻性意义。本项目还建立了一系列心血管专业的生物医学信息数据库和中国医学生物学信息重要门户网站--CMBI，为全国心血管学界提供服务和资源共享。
本项目组自主创新的工作以系列文章发表在国内外专业杂志上，共发表文章638篇，其中SCI收录265篇（其中A类、即完全为本项目独立完成的文章）220 篇，IF≥3<5分的89篇，IF>5分27篇，影响因子（IF）总和729.3，平均IF为2.75/篇SCI。个别文章发表在国际著名杂志如Nature Cell Biology、Cell、Circulation、J Clin Invest等杂志上，多数文章系列发表在Circulation Research、 J Hypertension, Atherosclerosis、 Stroke、J Cardiovasc Pharmacol、 Peptides、Regul Peptides 等专业杂志上，在国内心血管及其相关学术界具有重大影响，在国际心血管学术界也有了一定的影响和地位。本项目组平均投入产出比值为每十万元专项资助完成国内核心期刊文章1.33篇，SCI 0.94篇（IF值 2.60），产出的成本是比较低的。

三、 项目研究成果的水平与创新性、项目实施效果
(一) 对心脑血管疾病发病危险因子的研究----高同型半胱氨酸血症（hyperhomocystemia, HHcy）的流行病学、发病机制及防治的研究
心脑血管疾病是复杂性疾病，是遗传因素和多种内外环境因素共同作用的结果。除传统危险因子外，近年来确立了高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病发病的新的独立危险因子。高同型半胱氨酸血症在我国特别高发，这可能与国人的饮食高盐和熟食习惯有密切的关系，但与国人遗传易感性是否有关尚不清楚。我们建立了国内最大规模的脑卒中病例-对照（case-control）研究人群：包括脑中风患者2000例（其中脑出血503例，脑血栓形成1497例，这是目前国际上最大的一组病例）、以及对照2000例。建立了青岛心脑血管病防治基地的中老年人15,000人的队列，准备长期随访10-15年，通过前瞻性研究确定心脑血管病的遗传和环境危险因素。建立了以社区人群为基础的河南信阳高血压防治基地（7个乡镇60个自然村），开展6000例高血压的降压药物防治工作，通过药物基因组学和药物临床试验，寻找适合国人高血压脑中风的检查方法及防治方法。我们通过病例-对照研究，发现了血浆同型半胱氨酸(tHcy)水平、及其代谢调控基因--亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的C677T多态性与中国人脑中风发病相关（Stroke. 2003,34:1617-1622）。血浆增高（≧16.0 mmol/L）则增加总体脑卒中发病危险87%；并在国际上首次证实高同型半胱氨酸血症不仅是缺血性脑卒中、而且也是出血性脑中风的危险因素，增加脑出血发病危险94%。MTHFR基因C677T多态TT基因型与脑卒中相关（OR=1.27，95%CI:1.04-1.56），与脑血栓相关（OR=1.37，95%CI: 1.06-1.78）。MTHFR基因C677T多态与血浆同型半胱氨酸水平正相关（对照：β＝0.250，P<0.001；病例：β＝0.272，P<0.001）（Stroke,2003,34:2085-2090）。血浆同型半胱氨酸水平升高时还增加肺动脉栓塞的危险。我们建立的血浆同型半胱氨酸测定方法，作为心脑血管疾病的危险因素调查，已在全国10个省市、17家医院为5万余人进行了检测；并帮助新疆克孜勒苏州人民医院，及农一师医院建立了这种预测脑中风和心肌梗塞发病风险的网络，以期长期随访。在全国范围内建立一个由西安交通大学第一医院、天津心血管病研究所、武汉华中理工大学附属协和医院、武汉华中理工大学附属同济医院、第三军医大学大坪医院、山东兖州矿区医院、山东青岛港务局医院和河南信阳平桥七个乡镇60个自然村组成的多中心脑血管病防治网络。同型半胱氨酸是多功能损伤因子，高同型半胱氨酸血症诱发心脑血管病的机制还不完全清楚，目前国内外公认同型半胱氨酸在过渡金属离子（Fe3+或Cu2+）的存在下易发生自身氧化，生成多种强氧化产物如超氧化物、过氧化氢、过氧化物和.OH等氧自由基导致细胞结构和功能的损伤；此外，还可导致血管内皮细胞和平滑肌细胞发生内质网应激，通过内质网内蛋白错误折叠损害细胞功能。而我们的研究新发现: 同型半胱氨酸可通过自身氧化产物作为抗原刺激，激活体内多种免疫细胞,如直接刺激B细胞增殖和分泌，放大已激活的T细胞（Cardiovas Res, 2001, 52:328-336; Cardiovas Res, 2002, 53:1035-1042）,直接诱导人外周血单核细胞分泌CXC类趋化因子IL－8和CC类趋化因子MCP－1合成和分泌增加；其分子机制是通过PKC/CaM/ROS/Ref-1/p38- ERK1/2 MAPK/NF-kB 途径；PPAR-g激动剂可通过抑制ROS和NF-kB 途径，抑制刺激的趋化因子IL－8和MCP－1合成和分泌的增加。结论为同型半胱氨酸作为炎症原因子（proinflammatory factor）参与动脉粥样硬化等血管慢性炎症和血管损伤的早期发病(Circ Res, 2003 93:311-320 with Editorials:271-273)。这为揭示动脉粥样硬化的发病机制以及寻找新的防治措施，提供重要的新思路，上述部分成果在美国心血管领域的权威杂志之一‘Circulation Research’发表时, 同期该杂志编辑部为此文作了述评,盛赞该文取得的创新性成果具有潜在的重要的临床意义。进一步我们联系临床，在高同型半胱氨酸血症的动脉粥样硬化病人身上验证了离体研究的结果，证实了高同型半胱氨酸血症比已知的氧化应激损伤更为严重的危害，是其放大单核巨噬细胞对其它致病危险因素引起的炎症免疫反应性，加速动脉粥样硬化的发生和发展。小剂量叶酸降低血浆高同型半胱氨酸水平同时明显改善了单核巨噬细胞炎症免疫的高反应性(Atherosclerosis,2005，179：395-402)。
关于病人服用低剂量叶酸可明显降低血浆高同型半胱氨酸血症并逆转病人的单核细胞分泌趋化因子高反应性的成果，将对防治因高同型半胱氨酸血症引起的多种心脑血管并发症具有重要的指导意义。高同型半胱氨酸血症的治疗，目前主要通过干预代谢以降低血高同型半胱氨酸水平为主要措施。维生素B6、维生素B12和叶酸、是目前认为治疗高同型半胱氨酸血症最为常用的措施。但临床大规模试验的结果尚不一致，临床效果还有争议。尽管补充维生素可补充同型半胱氨酸代谢酶所需的辅因子，以降低血浆同型半胱氨酸水平，但维生素治疗存在两大问题：一是维生素治疗仅对因饮食习惯不良而缺乏维生素的患者有效，对遗传性因素如酶缺陷所致的高同型半胱氨酸血症治疗效果并不理想；而且长期大量服用维生素可导致神经变性等严重后果。二是低剂量维生素本身具有血管内皮保护功能，可以不通过影响血浆同型半胱氨酸水平发挥作用。寻找安全、有效、廉价的治疗手段仍然是防治高同型半胱氨酸血症所急需解决的重要问题。
机体本身具有强大的维持自稳态的能力，维持自稳态的不同的生物活性物质彼此间处于动态平衡的关系。我们注意到蛋氨酸代谢的中产物如S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等，以及其终产物如牛磺酸、硫化氢等，还有其合成的谷胱甘肽和金属硫蛋白等，形成庞大的蛋氨酸代谢‘家系’分子群（‘代谢同源’分子），各成员具有各自相对独立的生物学效应，彼此间又相互作用形成复杂的“网络”关系和动态平衡。S-腺苷蛋氨酸及S-腺苷同型半胱氨酸可活化同型半胱氨酸生成的酶--胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase CBS），并抑制同型半胱氨酸代谢的甲基四氢叶酸还原酶活性，导致同型半胱氨酸生成进一步增加。半胱氨酸在体内可加速同型半胱氨酸自身氧化，产生过量氧自由基导致氧化应激损伤。然而研究发现牛磺酸、金属硫蛋白、谷胱甘肽及硫化氢等则可通过膜稳定、清除自由基及维持钙稳态等多种生物学效应，在不同程度和不同水平上对抗同型半胱氨酸的细胞损伤作用。因此，利用蛋氨酸代谢‘家系’成员间的“网络”关系和动态平衡，探寻同型半胱氨酸生物学效应和代谢的机体内源性拮抗剂和抑制剂，可以是防治高半胱氨酸血症的新策略，可能具有临床应用前景。(Amino Acid,2004,27:37-48 ；Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2004,31:237-243；Metabolism, 2003,52(7): 827-833)

（二）心血管重塑的研究
1、血管重塑
高血压、动脉硬化、PTCA术后再狭窄、心肌肥大、心梗及血栓形成等多种与心脏和血管损伤有关的疾病，在发病过程中都具有心脏和血管的细胞迁移、肥大、增殖、坏死及凋亡等表现，细胞外基质的成份和量发生变化，以致心脏和血管的形态结构和功能代谢都发生了显著改变，称为重塑（Remodeling）。心血管重塑是高血压、动脉粥样硬化和心力衰竭等多种心血管疾病发生和发展的共同病理基础，也是目前心血管疾病防治的重要靶的。
（1）以血管外膜为重点的血管重塑机制研究
关于血管重塑的机制研究多年来都集中在血管内皮细胞(EC)和中膜平滑肌细胞(VSMC)，而忽略血管外膜的影响。我们从识别血管外膜成纤维细胞产生的血管活性因子及其功能入手，发现血管外膜成纤维细胞（adventitial fibroblasts,AF）产生和分泌骨桥蛋白（osteopontin, OPN）、肝细胞生长因子(HGF)、结缔组织生长因子（CTGF）、一氧化氮（nitric oxide, NO）和肾上腺髓质素（ADM）等许多种血管活性物质；并发现外膜成纤维细胞存在有肝细胞生长因子受体(C-Met)及内皮生长因子1型受体(VEGFR1)；这些血管活性物质通过自分泌和旁分泌作用，促使外膜成纤维细胞增殖、迁移和表型转化，胶原合成的量和质都发生改变。应用生物蛋白胶携带骨桥蛋白反义寡核苷酸经血管外膜途径给药，可以明显抑制球囊导管损伤引起的动脉新生内膜形成和再狭窄。成纤维细胞/肌性成纤维细胞（myofibroblast,MF）表型转化是血管外膜细胞参与血管重塑的始动环节,阐明其表型转化的细胞信号转导机制,将为干预血管重塑提供新的治疗靶点。迄今为止，尚未见血管外膜成纤维细胞表型转化的细胞内信号转导机制的研究报道。我们首先建立了血管外膜AF/MF表型转化的细胞模型。在此基础上,对血管外膜AF/MF表型转化的信号转导机制进行了较为系统的探索。我们的研究发现，血管紧张素II（Ang II）通过NADPH氧化酶产生ROS调节AF向MF表型分化；PKCa、和RhoA/ROKα通路参与了TGFb1诱导的AF向MF表型转化过程（JMCC,2003,35:1105-1112）。此外，TGFb1诱导AF向MF表型转化时出现一种快速瞬时激活和快速失活的外向钾电流(IA或A-type channels)，这一新型离子通道的出现可作为识别MF的新特征（BBRC,2003,301:17-23）。本工作对血管外膜成纤维细胞在血管重塑中的作用及机制的研究对于全面理解和阐明血管内皮细胞、VSMC、AF等血管壁细胞间的相互作用关系有重要意义，对高血压、动脉粥样硬化和再狭窄的发病机制提出了新的认识，并提出了干预血管外膜细胞表型转化作为防治血管重塑靶点的新观点。

（2）参与心肌重塑的新基因功能研究
新基因---hyperplasia suppressor gene（HRG）抑制血管平滑肌增殖
通过对自发性高血压大鼠（SHR）和正常血压大鼠（WKY）的平滑肌细胞进行基因差异筛选，发现并克隆了具有抑制细胞增生功能的增生抑制基因HRG（又称rat mitofusin-2）。我们在细胞和整体水平上研究了HSG对血管平滑肌细胞增殖的影响。发现高血压时HSG表达降低；而在血管平滑肌细胞中过表达HSG则抑制血清及生长因子所刺激的血管平滑肌细胞增殖。整体动物颈动脉球囊拉伤后，腺病毒介导HSG基因转入可以显著抑制再狭窄的发生。其作用机制是HSG通过抑制Ras-ERK/MAPK信号并将细胞周期阻断在G0/G1期，从而血管抑制平滑肌细胞增殖。HSG抑细胞增殖作用与基因上的ras结合位点相关，并不依赖于其线粒体融合位点。本工作是原‘攀登计划‘（八五和九五计划）的继续，历时十余年，在本项目研究中确认了该基因的功能，终于发表在Nature Cell Biology, 2004,6(9):872-883。杂志编辑部为本文撰写了评论员文章，指出中国科学家此次工作中发现的细胞增殖抑制基因，揭示了一条新的调节细胞增殖的信号传导通路，对动脉粥样硬化、高血压和血管再狭窄等心血管疾病的发病和防治可能具有重要意义。
新基因—hhLIM心肌肥大效应
我们明确了“八五”“九五”期间发现的、与心血管系统有关的新基因—LIM基因的新成员--hhLIM的生理功能。hhlim蛋白作为致心肌肥大因子的效应物，能反式激活心肌肥大标志基因脑钠素（BNP）和α-actin 表达，并与Nkx2.5具有协同作用。在致心肌肥大因素的持续作用下，胞质中hhlim蛋白和α-actin表达均显著增加，并使二者在细胞骨架中的比例改变而表现为细胞肥大表型，Hhlim可能成为防治心肌肥大的新的干预靶点。上述研究结果发表在在：Life Sciences 2002; 70: 799-807. Biochemistry(Moscow), 2003,68(6): 650-657; Biochim Biophys Acta,2004,1690(1):1-10; Fure Cardiol 1(#):319-329, 2005; Biochemistry(Moscow), 2005（in press）.
2、动脉粥样硬化血管重塑的发病机制研究
(1)雄激素缺陷可能参与动脉粥样硬化的发生和发展
在性激素与动脉粥样硬化的关系研究中，目前对女性与动脉粥样硬化发病以及雌激素的作用的研究较为清楚，但男性与动脉粥样硬化发病及雄激素的作用了解甚少。在高脂饮食复制雄性小鼠高胆固醇血症模型上，用双向电泳和质谱分析了小鼠肝脏激素调节蛋白的表达变化，发现主要尿蛋白系列、碳酸酐酶Ⅲ、谷胱甘肽S转移酶P2三个受雄激素调控的蛋白质在高胆固醇小鼠肝脏的表达都下调。进一步给小鼠肌肉注射人绒毛膜促性腺激素，发现高胆固醇血症小鼠血清、睾丸和肝脏里这三个蛋白表达量均降低，提示饮食引起的高胆固醇血症可能导致雄激素缺陷，而雄激素缺陷也可能参与动脉粥样硬化的发生和发展(J Nanosci Nanotechnol 2005,5:1273–1276)。在小规模的临床流行病学观察中也发现男性动脉粥样硬化发病与低血清雄激素水平相关。
(2)脂蛋白脂酶（LPL）为早期动脉粥样硬化病变的起始因素之一
建立家兔血管内皮的球囊损伤模型，在模型动物动脉壁上高表达活性型和非活性型LPL，结果发现，两种LPL均具有明显促进脂质沉积的作用，为早期动脉粥样硬化病变的起始因素之一。该工作论文被Atherosclerosis杂志接受待发表。
(3)血流动力学因素在动脉粥样硬化发生过程中可能起着更重要的作用
利用成功建立的、兔动脉-静脉互换移植合并高脂饮食的速发型动脉粥样硬化模型，观察了各种因素对动脉粥样硬化易感性的影响：结果发现，自体静脉移植后，可以模拟冠脉搭桥后血管壁的重构；血管移植合并高脂饮食后对高脂诱导动脉硬化的易感性高于对照血管，易发生不稳定斑块；移植动脉与对照动脉均发生了适应性重塑，细胞的凋亡和MMPs参与了血管的重塑；动脉移植于静脉后，其结构逐渐发生静脉化，对动脉硬化的易感性明显低于对照动脉。结果表明血流动力学与高脂血症两个因素中，前者在动脉粥样硬化发生的过程中可能起着更重要的作用（Atherosclerosis 2004,117: 37-41）。
（4）LOX-1在内皮和新生内膜的表达可能是动脉粥样硬化形成的早期事件，低剂量的洛沙坦可以抑制动脉粥样硬化的发生
将兔左侧颈外静脉移植到颈总动脉，结合高脂饲料喂养可成功建立兔自体静脉移植物粥样硬化模型，利用模型发现：1）在兔自体静脉移植物的内皮和新生内膜表面也有氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)受体1（LOX-1）的表达，LOX-1的表达和内膜厚度显著正相关；（2）高胆固醇血症引起的静脉移植物动脉粥样硬化病变部位LOX-1的表达更显著上调，LOX-1的表达和血清总胆固醇水平也显著正相关；（3）在静脉移植物新生内膜和动脉粥样硬化病灶中，管腔内皮细胞和泡沫细胞均表达LOX-1，其中表达最强的是在内皮细胞。高胆固醇血症可以通过上调内皮细胞和血管平滑肌细胞LOX-1的表达，从而促进静脉移植物动脉粥样硬化的发生和发展。推测LOX-1在内皮和新生内膜的表达可能是动脉粥样硬化形成的早期事件，并且LOX-1介导的内皮细胞活化或功能失调可以存在于非动脉粥样硬化部位，使这些部位成为易于发生动脉粥样硬化的区域。低剂量的洛沙坦（血管紧张素II的AT-1受体阻断剂）治疗在不影响血脂水平的情况下，可以减轻静脉移植物动脉粥样硬化的病变程度，抑制泡沫细胞的形成，减小动脉粥样硬化病灶范围，缩小斑块中脂核的面积，降低粥样斑块的不稳定程度，同时下调LOX-1的表达。说明洛沙坦可能通过下调LOX-1的表达，减少内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞对ox-LDL的摄取，从而抑制内皮细胞活化和泡沫细胞的形成，进而抑制动脉粥样硬化的发生发展，这可能是血管紧张素II受体阻断剂抗动脉粥样硬化的新机制(Atherosclerosis 2004,177: 263-268)。
(5)感染因素促动脉粥样硬化的临床流行病学及发病机制的研究
①感染因子与动脉粥样硬化发病关系的研究：感染因素在我国人群中非常普遍，临床血清流行病学大样本人群（上海和江苏）分析了我国常见病原体---巨细胞病毒（HCMV）、幽门螺旋菌、肺炎衣原体（Cpn）、EB病毒、B型柯萨奇病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、结核杆菌及乙肝病毒等多种感染与冠状动脉粥样硬化之间的相关性，并检测动脉粥样硬化病变部位各种病原体的相关抗原及基因表达。结果提示我国人群的人巨细胞病毒、肺炎衣原体慢性感染与冠状动脉动脉粥样硬化发生率正相关。在动脉粥样硬化病人血管组织中分别或同时检测出了HCMV、即刻早期反应基因（IE）及晚期反应基因（L），多见于血管内膜下平滑肌细胞的细胞核；并可检出肺炎衣原体抗原以及肺炎衣原体外膜蛋白基因。提示HCMV可能参与了动脉粥样硬化发生， HCMV基因片段的检出可能与动脉粥样硬化的转归有关；体外实验观察到 HCMV可能通过调节内皮细胞趋化因子的表达参与动脉粥样硬化的发生发展。人群肺炎衣原体慢性感染及血清C反应蛋白（CRP）水平均与冠状动脉粥样硬化发生率显著相关，其中血清C反应蛋白水平与冠状动脉粥样硬化病变程度呈正相关，而血清肺炎衣原体抗体水平与粥样硬化的病变程度无相关。这些结果提示炎症反应贯穿于动脉粥样硬化发生发展的全过程，而感染似乎在动脉粥样硬化发病中不起主要的作用，尤其是对动脉粥样硬化斑块进展不起重要影响。我们未发现所观察的其他病原体（包括国人高感染的乙肝病毒和流感病毒）与我国人群动脉粥样硬化发病的相关性。
我们还观察感染负荷与冠状动脉粥样硬化斑块稳定性及支架内再狭窄发病的关系，检测了患者血清巨细胞病毒、幽门螺旋菌、肺炎衣原体、EB病毒、B型柯萨奇病毒、A型流感病毒、B型流感病毒、结核杆菌抗体IgG/IgA及乙肝病毒表面抗原。结果显示冠状动脉动脉粥样硬化阳性率随感染负荷的增加持续升高，感染负荷与血清炎症标志物C反应蛋白的水平并不平行，但高C反应蛋白水平组冠状动脉硬化阳性率随既往感染微生物数目的增加而明显升高，提示高血清C反应蛋白加剧了感染负荷促冠状动脉动脉粥样硬化的作用。随访感染负荷对放置支架后6个月的再狭窄发生的影响，结果发现，不同单个感染原或是感染负荷组患者支架内再狭窄率均没有明显差别，由此推断Cpn, CMV, Hp, HSV1, HSV2 和 HBV感染及其负荷对冠状动脉支架内再狭窄发病没有明显影响；而血清C反应蛋白水平与支架内内膜增厚程度显著相关；提示炎症可能是支架内再狭窄的主要原因之一，但感染不是支架内再狭窄发生的重要危险因素，对再狭窄的发生无预测价值。这是首次用我国人群大样本资料对心血管学界目前最具争议问题之一的回答。
②感染因素与免疫机制参与动脉粥样硬化发病的机理研究：
感染因素： 人巨细胞病毒（HCMV）感染内皮细胞ECV-304发现单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、膜结合型趋化因子Fractalkine(ＦＫＮ)和炎症蛋白10（IP-10）、升高，而感染的单核细胞（THP-1）中的MCP-1和生长相关基因（GRO）的水平均有明显升高。同时利用MCMV感染的ApoE基因敲除小鼠模型研究发现，该小鼠在高脂饮食喂养合并感染后动脉粥样硬化斑块程