大肠杆菌DH5a感受态的制备,质粒验证.doc

大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备，质粒的转化及提取

一 实验目的
1， 了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作技术。
2， 了解和掌握质粒转化的原理和操作步骤。
3， 掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法，以及提取过程中各试剂的作用。
二 实验原理
1， 大肠杆菌感受态细胞制备的原理
感受态是细菌细胞具有的能接受外源DNA的一种特殊生理状态，将正在生长的大肠杆菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，此时的细胞呈现出感受态。
2， 质粒转化原理
在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激可诱导细胞吸收DNA。转化了质粒DNA的大肠杆菌经培养可以使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可以在含有相应抗生素的培养基上涂布生长，而没有转化的细胞则无法生长。
3， 质粒提取原理
质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
三 仪器，材料及试剂
仪器：恒温培养箱，离心机，恒温摇床，超净工作台，高压灭菌锅，电泳仪，水浴锅等
材料：大肠杆菌DH5α菌株，大肠杆菌BL21菌株，pCMV质粒
试剂：Solution I，Solution II，Solution III，1 mol/L CaCl2，TE缓冲液，70%乙醇，酚：氯仿（1:1）等。
四 实验步骤
1，试剂的准备
Solution I: 1，量取下列溶液，置于1L烧杯中。
1MTris-HCL(pH8.0) 25 mL
0.5 M EDTA(pH8.0) 20 mL
20％Glucose（1.11M） 45 mL
dH2O 910 ml
2，高温高压灭菌后，4℃保存。
Solution II：1，量取下列溶液，置于500mL烧杯中。
10％SDS 50mL
2N NaOH 50mL
2，加灭菌水定容至500 mL，充分混匀。
Solution III：1，量取下列溶液，置于500mL烧杯中。
KOAc 147g
CH3COOH 57.5 g
2，加入300ml去离子水后搅拌溶解。
3，加去离子水将溶液定容至500。
4，高温高压灭菌后，4℃保存。
LB培养基： 1，称取下列试剂，置于1L烧杯中。
Tryptone 10g
Yeast Extract 5g
NaCl 10g
2，加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3，滴加5NNaOH（约0.2ml），调节pH值至7.0。
4，加去离子水将培养基定容至1L。
5，高温高压灭菌后，4℃保存。
10×TE Buffer：1，量取下列溶液，置于1L烧杯中。
1 M Tris-HCl Buffer（pH8.0） 100ml
500mM EDTA（pH8.0） 20ml
2，向烧杯中加入约800ml去离子水，均匀混合。
3，将溶液定容至1L后，高温高压灭菌。
4，室温保存。
2感受态细胞制备
1）从-80℃冰柜中取出一支冻存的大肠杆菌DH5α菌株，在冰块上解冻后，于事先照过紫外的超净台中，用无菌接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板上分区划线，将菌种迅速放回-80℃保存。平板做好标记后，于37℃培养约16小时,该细菌菌落在LB培养基上为1-2mm的透明的淡黄色菌落，有特殊的臭味。
2)在照过紫外的超净台中，用灭菌的牙签挑取单个菌落，接种入装有1mlLB培养液的1.5mlEP管中，封口膜封好，于37℃恒温摇床培养10-12小时，直至对数生长期。
3）将该时期的细菌悬液转接于100mlLB液体培养液中，37℃，220rpm，震荡扩大培养约3h，测细菌OD600，以0.3-0.4之间最佳。
4）将扩大培养后的培养物在冰上冷却10min，转入50ml离心管，4℃,4000rmp离心10min。
5）倒净上清液，流尽残余液体，加入10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液（使细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面）轻轻悬浮细胞，冰浴30min。
6）4℃,4000rmp离心10min。
7）弃去上清，加入2ml预冷的15％甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液再次悬浮细胞，即制成了感受态细胞悬液。
8）每个1.5mlEP管分装200μl的感受态细胞，-70℃保存。
3转化
1）将感受态细胞从-70℃拿出，放冰块上解冻。
2）在超净工作台中，取空质粒1μl加去离子水9μl稀释，加入到100μl感受态细胞中，冰上放置30min。
3）42℃,热激60s（促进细胞对DNA的吸收），迅速再在冰上放置3min。
4）加入不含Amp的LB培养液890μl，37℃振摇1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因（Amp）。
5）从每管中取100μl培养液铺至LBAmp培养板，并涂布均匀。
6）室温放置20min，使液体吸收，37℃倒置培养16h。
7）挑取单个菌落，接种于加有Amp的2mlLB培养液中，37℃，220rpm，震荡培养约16h。
4质粒提取（碱裂解法）
1）加1.5ml培养物于离心管中，4℃,12000rmp/min离心30s。
2）倒去上清液，倒置于吸水纸上干燥。
3）加入100μl4℃预冷的Solution I重悬，用手剧烈震荡15s。（低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞膨胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围）。
4）缓慢加入200μl新配制的Solution II，上下颠倒5次。（SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH(pH>12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性）。
5）加入150μl用冰预冷的Solution III，盖紧管口，上下颠倒10次，放冰上3-5分钟。（：由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。能中和溶液II的碱性，使DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离）。
6）4℃,12000rmp/min离心5min，吸上清400μl移到另一离心管中。
7）加等量酚:氯仿(各200μl）（使蛋白质变性，并使液相和有机相分离），震荡15min。
8）4℃,12000rmp/min离心2min，将上清液移到另一离心管，切勿吸到下层溶液，取300μl即可。
9）加入2倍体积的无水乙醇（夺取DNA外的水合层使DNA聚合而沉淀），室温放置2min，4℃,12000rmp/min离心5min，上下颠倒5次使其反应充分。
10）弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上。
11）加入1ml70％乙醇（与无水乙醇的作用类似，同时可以清洗DNA，溶解与DNA一起沉淀下来的离子。），用枪头把沉淀吸起来，4℃,12000rmp/min离心2min。
12）弃上清，倒置于吸水纸上。
13）各加入1μlRNase（降解RNA污染物），30μlTE。
14）封口膜封上，37℃孵育1h。
5琼脂糖凝胶电泳结果
用微量分光光度计测质粒浓度，浓度在2000ng/μl时进行琼脂糖凝胶电泳。
1）制备琼脂糖凝胶：称取0.8g琼脂糖，加入100ml1×TAE缓冲液，置微波炉中加热至完全融化，取出摇匀，即为琼脂糖凝胶液，冷却至50-60℃后倒入到放有梳子的有机玻璃内槽中，形成一层均匀的胶面，凝固后，拔出梳子，放入加有电泳缓冲液的电泳槽中。
2）加样：第一孔加入6μlMarker，其余几孔加入混有loading buffer的质粒。
3）电流80mA，电压110V，电泳40min。
4）电泳结束后看结果。
五 结果分析

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

M：2000 DNA marker
2,5,8孔为转化入BL21细菌的质粒。
1,3,4,6,7,9,10孔为转化入DH5α细胞的质粒。
正常质粒是闭合的双链DNA。在提取过程或电泳过程中可能使质粒发生开环，或者由开环解开螺旋变成线形。这三种形态电泳时的分离率不同，分离速度不同，分成三带。闭环（超螺旋），开环，线形的螺旋率依次降低。
另外，质粒提取过程中可能被外源DNA污染，出现其他条带。
本实验结果中2,5,8孔为转化入BL21细菌的质粒。BL21细菌为表达型的细菌，表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题，可能为没有条带的部分原因。