小鼠股骨临界骨缺损模型的构建及评估_靳慧勇.pdf

文章编号:1000-5404(2011)22-2331-04论著小鼠股骨临界骨缺损模型的构建及评估靳慧勇，侯天勇，罗飞，李志强，易绍萱，常正奇，边巴罗布，许建中(400038 重庆，第三军医大学西南医院骨科，全军矫形外科中心)摘要 目的建立一种骨组织工程研究中简便易行的标准化小鼠股骨临界骨缺损模型。方法测量小鼠股骨的解剖参数。将 30 只 2 3 月龄 FVB/N 品系的小鼠分成 3 组，每组 10 只，用我们自行设计的内固定物固定后分别制备长度为1、2 mm 和2 5 mm 的股骨干中段骨和骨膜缺损模型，通过影像学和组织学的方法来观察骨缺损的愈合进程。结果术后3 个月通过 X 线片和组织学检查证实1 mm 的缺损可以通过自身修复机制完成骨缺损的愈合，而2、2 5 mm 的缺损则无法自行愈合，建模成功率为 89 7%。结论通过自行设计的内固定物构建的小鼠股骨缺损模型，在不填充植骨材料的情况下，2 mm 以上的骨缺损不能自行愈合，符合临界骨缺损的标准。关键词 股骨;临界骨缺损;组织工程;动物模型;小鼠 中图法分类号 R-332;R681 1;R681 8 文献标志码 A基金项目国家高技术研究发展计划重大专项(863 计划，2006AA02A122);国家自然科学基金(30900312);第三军医大学青年创新人才基金(2009XQN23)通信作者许建中，电话:[phone]，E-mail:xjzslw163 comEstablishment and evaluation of mouse femur critical bone defect modelJin Huiyong，Hou Tianyong，Luo Fei，Li Zhiqiang，Yi Shaoxuan，Chang Zhengqi，Bian Baluobu，Xu Jianzhong(Centerof Orthopedics，Department of Orthopedics，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，400038，China)Abstract ObjectiveTo establish a simple，reproductive and standardized method for mouse femurcritical bone defect for research in tissue engineering MethodsAnatomic data of mouse femur were obtainedthrough measurement in order to guide the operation Thirty 2 to 3 months old FVB/N mice were randomly di-vided into 3 experimental groups，each group with 10 mice Their right femur were inflicted to make a defect insizes of for 1，2 and 2 5 mm respectively after the mice were fixed in our self-designed fixation equipmentBone defect healing process was assessed by plain X-ray filming and histological observation ResultsX-rayfilm and histological observation confirmed that the bone defect at the size of 1 mm was restored by the self-re-pairing mechanism in 3 months after operation，but no such repair were found in the defect of 2 and 2 5 mmgroups Satisfactory models were created in 89 7%experimental mice ConclusionMouse femur critical de-fect model can be established through our self-designed fixation equipment Bone defect in size of 2 mm andmore in mouse femur can not heal up spontaneously even in 3 months after operation This defect model hashigh repeatability and can be used for the related research in tissue engineering as standard animal models Key words femur;critical cize defect;tissue engineering;animal model;mouseSupported by the Major Project of National High Technology Research and Development Program of China(863 Program，2006AA02A122)，the National Natu-ral Science Foundation of China(30900312)and the Foundation of Young Innovative Talents of Third Military Medical University(2009XQN23)Correspond-ing author:Xu Jianzhong，Tel:[phone]，E-mail:xjzslw163 com组织工程骨(tissue-engineered bone，TEB)目前被公认为修复因创伤、炎症或骨病等导致的大段骨缺损行之有效的策略之一，组织工程的研究中，标准化的动物模型是不可缺少的，它是实验研究通往临床应用的桥梁1，因此，建立一种简便易行，重复性好的负重长骨骨缺损的实验动物模型十分必要，既往的动物模型主要集中在大型动物，着重观察成骨效果和推进临床前研究;对于观测骨组织工程作用机制的相关研究而言，上述模型成本高，护理不便。对比而言，小鼠模型具有护理简便、成本低的优势。本研究制造不同长度的小鼠股骨干缺损，运用自行设计的内固定物牢靠固定后，观察和评估小鼠股骨缺损的自行修复能力，着力于制备一种可用于骨组织工程机理研究的简便的小型实验动物模型。1材料与方法1 1实验动物选择2 3 月龄 FVB/N 品系近交系的健康成年小鼠(SPF1332第 33 卷第 22 期2011 年 11 月 30 日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol 33，No 22Nov 302011级)35 只，雌雄不限，体质量(380 25)g，饲养温度(21 2)，相对湿度30%70%，购自第三军医大学实验动物中心。1 2解剖参数分析和内固定物的制作将 5 只 2 3 月龄的小鼠脱颈处死后分离解剖双侧股骨，共收集 5 具小鼠股骨样本，用游标卡尺测量股骨长度，股骨干中部的矢状径和横径等数据，使用 MicroCT(华西口腔医院国家重点实验室)对上述样本进行三维重建，软件分析相关解剖参数，用于指导制备小鼠股骨钢板。1 3小鼠股骨缺损模型的构建将30 只2 3 月龄成年的 FVB/N 品系小鼠分为3 组，每组10 只，使用自行设计的内固定物固定后分别制备 1、2 mm 和2.5 mm 的股骨干中段骨和骨膜缺损。手术方法:用 0 5%戊巴比妥钠按照 15 mg/kg 剂量对实验小鼠进行腹腔注射麻醉，常规术区备皮、碘伏消毒，采取俯卧位，将小鼠固定在操作台上，右侧肢体屈膝 90，于右侧膝关节上偏外侧做一长约 1 cm 的纵行切口，切开皮肤、皮下组织，显露肌肉白线，沿着白线从股直肌和半腱肌肌间隙钝性分离进入，充分显露股骨中段(包括大转子)，注意尽量不要剥离大转子上附着的肌肉群，将设计好的内固定物紧密贴附在股骨表面，牢靠固定后分别按照实验设计在股骨干中部(钢板的中间2 孔之间)切除相应长度的骨干和骨膜，制备骨缺损。术毕生理盐水冲洗伤口后缝合肌膜和皮肤，术后连续 3 d 碘伏消毒切口;肌注青霉素 20 万 U，1 次/d。小鼠苏醒后同一条件单独置于笼中饲养，室温维持在(25 2)，右侧下肢呈保护性制动，不予固定，可进行自由活动以及进食和饮水。1 4X 线片观察全部实验小鼠于术后 7 d 拍摄 X 线片(德国西门子公司MAMMOMAT 3000 数字乳腺机)，判断建模成功与否。分别于术后 28、56、84 d 对活体实验小鼠进行术后观察，0 5%戊巴比妥钠按照 14 mg/kg 剂量对实验小鼠进行腹腔内注射至麻醉满意，采取俯卧位固定在拍摄台上，双侧下肢外展 60，稍外旋，膝关节屈曲 90，拍摄 X 线片观察骨缺损愈合进程。1 5组织学观察术后 84 d 拍摄的 X 线片见骨缺损为 1 mm 的实验小鼠骨缺损处见大量骨痂生长，骨塑形完成。而2 mm 和2 5 mm 缺损的实验小鼠未见明显骨痂生长，脱颈处死动物，取手术侧肢体股骨(注意保留骨痂纤维肉芽组织的完整性)，以 10%中性甲醛固定 48 h 后，以 8%EDTA 脱钙液置于 37 温箱脱钙 2 周后，石蜡包埋，10 m 厚度连续切片，用电吹风将切片上的石蜡吹融化后，放入 60 烤箱中烤 2 h，再进行 HE 染色。1 6统计学处理采用 SPSS 11 0 统计软件进行描述性统计分析。2结果2 1股骨标本测量结果5 具 2 3 月龄小鼠股骨标本测量结果:股骨长度(15 48 0 73)mm;股骨干中部横径(1 38 0 20)mm;矢状径(2 05 0 04)mm;髓腔直径(0 75 0 80)mm，除去股骨髁和小转子以上的部分，股骨干长度为 8 5 mm。2 2股骨 CT 重建和体外固定大体观使用华西口腔医院国家重点实验室 MicroCT(瑞士产 Scan-co uCT80)对5 只 FVB/N 品系的小鼠的股骨样本进行三维重建(图 1A)，根据图像结果分析出小鼠的股骨解剖参数，用于指导内固定物的构建，我们用自行设计的钢板在体外进行小鼠股骨的固定，正面和背面观可见钢板固定牢靠，长度和弧度适合小鼠股骨(图 1B、C)，侧面观可见在体外制造满足实验需要的骨缺损后内固定物仍能牢靠固定，钢板紧密贴附在小鼠股骨上(图 1D)。ABCD1 mmA:股骨 MicroCT 重建图像背面观;B:内固定物体外固定股骨正面观;C:内固定物体外固定股骨背面观;D:体外制造缺损后钢板固定大体观图 12 月龄小鼠股骨 MicroCT 重建和体外钢板固定大体观察2 3X 线片观察结果2 3 1X 线片观察以及造模成功率实验小鼠俯卧位固定，拍摄钼靶 X 线片显示清晰。30 只实验小鼠，2 例因术中伤及右侧下肢血管，改为左侧股骨造缺损。1 例因麻醉或手术创伤等原因在术后第 2 天死亡，后予以补齐外，其余均存活良好，小鼠麻醉复苏后即可在饲养笼内自由活动，但是由于疼痛、异物等因素小鼠术侧肢体呈保护性活动，术后小鼠进食情况良好，切口 5 7 d 缝线自行脱落，均1 期/甲愈合，无渗血、红肿等感染征象。考虑到小鼠手术创伤和麻醉的承受能力，术后第7 天才首次拍摄 X 线片观察骨缺损侧的股骨对位对线情况，确认建模成功与否。钢板移位与股骨成角 2 例，手术侧形成巨大血肿影响钢板位置 1 例，均之后予以补齐，其余内固定牢靠，对位对线情况良好，造模成功率 89 7%。2 3 2骨缺损愈合进程中的 X 线片观察术后第7、28、56、84 天分别对实验小鼠进行钼靶 X 线拍摄观察，可见骨缺损长度为 1 mm 的实验组:骨缺损术后第 7 天内固定位置良好，骨缺损两断端对位对线良好，缺损端清晰锐利;骨缺损术后第 28 天内固定物固定牢靠无移位，骨缺损端有纤维骨痂形成;第 56 天骨缺损处可见形成大量的骨痂，骨痂密度高;骨缺损术后第 84天骨缺损处已有连续性骨痂通过，达到临床愈合(图 2A)。骨缺损长度为 2 mm 的实验组:术后第 28 天内固定位置好，骨缺损端折线变得模糊;术后第 84 天骨缺损断端变得圆钝，骨痂生2332第 33 卷第 22 期2011 年 11 月 30 日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol 33，No 22Nov 302011长不明显(图 2B)。缺损长度为 2 5 mm 的实验组:骨缺损术后连续观察，内固定位置良好，骨断端无成角、短缩移位。术后84 d 缺损处无明显骨痂生长，断端折线显示较为锐利，可见类似软组织影充填(图 2C)。2 4组织学观察结果术后 84 d，HE 染色结果显示，骨缺损长度为 1 mm 的实验组缺损处可见大量的新生骨小梁组织填充，髓腔再通;骨缺损长度为 2 mm 的实验组可见在一侧的缺损骨端有少量成骨，缺损处纤维组织充填，纤维组织与骨端的边界清楚;骨缺损长度为 2 5 mm 的实验组可见缺损处充填着大量的纤维结缔组织，无骨组织生成(图 3)。3讨论3 1模型动物和骨缺损部位的选择在组织工程研究领域，标准化的动物模型是实验研究中不可或缺的部分，是评价生物材料性能、构建策略好坏以及观察种子细胞转归机制必要的载体2。临床应用前的体内实验研究选取的骨缺损动物模型按照动物大小可以分为羊 3、狗和猪等大动物 4 和鼠 5、兔小动物。我们在查阅近年来国内外动物模型相关文献后发现，随着动物个体的增大，样本量呈明显下降趋势，使得实验研究所要求的动物数量难以保障，这主要与羊、狗、猪等体积大的动物价格昂贵、来源困难、饲养条件要求高等因素有关。本研究选择 FVB/N 品系小鼠作为实验模型动物，来源广泛，价格低廉，易于围手术期的管理，耐受手术和抗感染能力较强，而且 FVB/N品系小鼠性成熟期短(4 5 周达到性成熟)，易于获得。本研究发现，小鼠性成熟后随着个体的逐渐增大，骨骼的长度和强度进一步增长，故本实验选择 2 3 月ABCDEFA、B:骨缺损长度为 1 mm 的实验组术后 28 d 和 84 d X 线表现;C、D:骨缺损长度为2 mm 的实验组术后28 d 和84 d X 线表现;E、F:骨缺损长度为 25 mm 的实验组术后 28 d 和 84 d X 线表现图 2小鼠骨缺损模型构建术后钼靶 X 线表现ABCA:骨缺损长度为1 mm 的实验组:新生骨小梁组织;B:骨缺损长度为2 mm 的实验组:纤维组织充填;C:骨缺损长度为25 mm 的实验组:大量纤维肉芽组织图 33 组股骨缺损术后 84 d 局部缺损处组织病理变化(HE 100)3332第 33 卷第 22 期2011 年 11 月 30 日第三军医大学学报JThirdMilMedUnivVol 33，No 22Nov 302011龄的小鼠，既不受鼠龄过小，股骨强度不够，且本身发育旺盛对骨移植物的影响，又避免了鼠龄过长，骨组织老化对研究的影响;组织工程骨修复非承重及小的骨缺损6 已被证明是行之有效的方法，但目前我们在临床上面临的挑战是用其来修复大的承重骨缺损7，胫骨虽作为承重骨，但是有腓骨支撑，一个骨的骨缺损所产生的病理影响和生物力学变化会部分地被另一骨的完整性所代偿，因此在本实验中我们选择股骨，也是为尝试建立单一负重长骨骨缺损8 11 动物模型。3 2骨缺损大小的选择当骨缺损超过一定长度，超出了骨自行修复的最大能力，缺损不会自行愈合，这个长度即为临界骨缺损长度(CSD)。Schmitz 等12 在 1986 年通过回顾动物实验中缺损不能自愈的骨缺损模型，把临界长度总结为其周径的 1 5 2 5 倍以上或为长度的 1/10 以上，具有一定指导意义。Hollinger 等13 在 1990 年将 CSD定义为在动物生命周期内愈合小于 10%的骨缺损。如果 1 年内未达此水平，便可以认为此模型符合 CSD的标准。本实验分别制备 1、2 mm 和 2 5 mm 的小鼠股骨缺损模型，在 84 d 的观察期内，通过大体、X 线片以及组织学观察其自行愈合的能力，可以看到 2 mm以上的股骨干缺损不能通过自身的修复愈合。3 3本模型制备手术要点影响骨缺损愈合的因素有很多，首先是由缺损的长度决定的，其他还有动物的种属、年龄，不稳定的固定等。小鼠的股骨尺寸较小，要求术者具备一定的显微外科手术基础，本实验的所有动物由同一术者来完成;选取 FVB/N 品系的 2 3 月龄的健康小鼠，运用我们自行设计的内固定物进行小鼠股骨的固定，制备缺损后通过 84 d 的连续观察，发现内固定物能够达到牢靠固定股骨的效果;本模型在解剖上有明显的肌性和骨性标志，手术入路选择“白线”肌间隙进入，分离容易且避免了血管损伤，此入路可充分显露术区，术中以股骨大转子作为参考标记，股骨远近端钢板固定的位置都可充分暴露，从而使术中定点变得简单可行，减少了软组织剥离，尽量避免干扰局部的血供。3 4本实验模型构建的意义随着组织工程研究的不断深入，对种子细胞机制的探讨需要可以批量制备、操作简便、成本低廉的小动物标准化模型。本实验动物模型在不填充任何材料的情况下，2 mm 以上的实验性骨缺损在术后 3 个月仍不能自行愈合，符合临界骨缺损的标准，可用于组织工程骨修复单一负重长骨骨缺损的实验研究。近年来种子细胞作为组织工程骨的要素之一，其转归和募集机制正在逐渐成为时下组织工程领域研究的热点7，为深入了解组织工程骨修复骨缺损的细胞机制，既往我们采取定期处死实验动物进行组织学切片等方法进行分析，这样既损失了样本量，同一动物又不能在不同时相点进行纵向动态观察，近年来随着转基因荧光小鼠和小动物活体成像系统广泛应用于科研，从而让我们能够实时动态观察种子细胞在小动物体内的迁移情况，更直观高效的进行种子细胞募集和迁移机制的研究14。基于以上本实验研究运用自行设计的内固定物构建小鼠的股骨缺损模型，以期建立一种能满足上述实验研究需求的小动物标准化骨缺损模型。参考文献:1 Drosse I，Volkmer E，Capanna R，et al Tissue engineering for bonedefect healing:an update on a multi-component approachJ Injury，2008，39(Suppl 2):S9 S20 2 吴雪晖，罗飞，谢肇，等 组织工程技术修复骨缺损的研究现状及进展 J 创伤外科杂志，2008，10(2):183 185 3 Hou T，Li Q，Luo F，et al Controlled 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