神经管缺损诊断项目简介.doc

鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒
中国科学院孙曼霁院士

一、 项目名称：
《鉴别胆碱酯酶亚型的寡配体试剂盒》
二、立项背景
1、神经管缺损的发生
神经管缺陷症(Neural tube defects，NTDs)是胚胎在妊娠第24～28天期间因神经管闭合受阻所致的一系列严重畸形，是我国高危、高发畸形之一，也是围产儿死亡和致残的主要原因，约占我国先天畸形的20%～25%。神经管缺损儿出生素质差，围产期病死率高，预后不良。加强预防和产前诊断是降低发生率的有效措施。
2、神经管缺损诊断方法
1）现有的诊断方法
（1）B超检查法；
（2）母血及羊水甲胎蛋白（AFP）检查法；
（3）羊水AChE酶活性检测：正常羊水不含AChE，神经管缺陷胎儿的脊髓和脑组织暴露在羊水中时，羊水中则出现AChE，但羊膜穿刺时可能由于血样污染导致假阳性，所以NTD产前诊断迫切需要能区分突触型和红细胞型AChE的试剂。AChE的检测是神经管缺损的最特异性指标。
（4）绒毛膜AChE检测；
（5）其他辅助诊断的方法：人绒毛膜促性激素β亚基、游离雌三醇、妊娠相关血浆蛋白的检测。
2）各种方法的优缺点和比较
（1）甲胎蛋白的检测
母血及羊水甲胎蛋白（AFP）检查法：孕妇血清AFP是由胎儿肝脏产生的一种特殊蛋白， 胎血中浓度较高。在正常情况下，可通过胎儿尿液及胎儿上皮组织(如呼吸道上皮)进入羊水循环，至孕12～18周，羊水中AFP浓度逐渐升高达峰值，而后呈曲线下降，至妊娠晚期达很低水平。当发生NTDs时，胎儿的某些部位缺乏正常组织覆盖，导致大量AFP渗漏至羊水使其在羊水中的浓度明显升高，并进入母体循环。约90%的无脑儿，78%～88%的开放性脊柱裂胎儿的母血中AFP升高，孕中期母血AFP>2.5mmol/L被定为NTDs阳性。测定羊水AFP诊断NTDs时，亦可由于羊水被胎血污染、孕期计算错误及胎儿患有脐膨出等其他少见畸形而出现假阳性结果。
测定孕妇血AFP浓度来筛选NTDs，敏感性可达80%～90%。一般在妊娠15～23周进行，在此期间，血AFP浓度随孕期增加而增加。所以用这一生化指标来筛选NTDs时，孕期计算一定要准确。另外，多胎妊娠和一些少见的先天畸形(如胎儿脐膨出等)，也可导致AFP浓度升高。但由于这一方法的敏感性高，简单易行，无副作用，因而目前被认为是产前筛选开放性NTDs的有效方法。但是由于孕妇血AFP存在一定的假阳性，容易被错判为NTDs。

（2）B超检查
B超检查对NTDs有较高的准确性， 一般认为妊娠16～18周开始即可对NTDs进行详细的超声诊断，B超诊断无脑儿可早到孕12周～13周。无脑儿大部分可通过B超检出，显示胎儿颅骨穹隆缺如，结合AFP测定有所增高作出诊断。而诊断开放性脊柱裂则较难，主要发现软组织和骨特征。脑膨出检查时发现颅骨突出团块，最有价值的诊断依据是辨认颅骨缺陷。随着高分辨超声诊断仪的不断改进，诊断的准确性大为提高，然而即使是有经验的超声诊断者，仍有约15%的NTDs不能被检出。
（3） 羊水乙酰胆碱酯酶活性检测
正常羊水中的胆碱酯酶主要为丁酰胆碱酯酶，而且其活性(5-70U/L)远低于成人血清(1000U/L)，正常羊水中不含乙酰胆碱酯酶（AChE）活性。神经管缺陷胎儿的羊水AChE明显升高，约为正常羊水的3-4倍。同时测定羊水AChE和AFP对神经管缺陷诊断的准确率达99．4％。羊水AChE活性测定是产前诊断神经管缺陷的首选指标。脐疝(75％)、流产(47％)和其他先天性畸形有关的妊娠，AChE也增高可出现假阳性结果。此外，羊膜穿刺时也可能由于血样污染导致假阳性。
（4） 羊水乙酰胆碱酯酶免疫学检测
为了NTD产前诊断能区分突触型和红细胞型AChE，用抗人突触型AChE多克隆或单克隆抗体检测羊水中异常存在的突触型AChE，可以提高诊断的特异性，避免因羊膜穿刺时可能的血样污染而出现的假阳性。
（5） 其他
血清人绒毛膜促性激素β亚基(β-HCG)、游离雌三醇(E3)、妊娠相关血浆蛋白(PAPP—A)检测：一般认为人绒毛膜促性激素β亚基(β-HCG)、游离雌三醇(E3)主要在孕中期有筛查意义，血E3<0.7mmol/L为异常，妊娠相关血浆蛋白(PAPP-A)在妊娠早、中期均明显降低，因此这些血清标记物可在妊娠中期辅助AFP的检查，作为筛查胎儿NTDs异常的主要指标，亦可对胎儿染色体异常进行筛选。但血清标记物并不是一项直接诊断NTDs的依据。
（6） 突触型AChE寡配体检测法
本项目发明了能区分突触型与红细胞型AChE及丁酰胆碱酯酶的寡配体，并将之应用于神经管缺损的诊断。
三、 本发明的目的
针对胎儿神经管缺陷症市售诊断试剂的缺点及临床早期诊断的需要，本发明推出拥有自主知识产权的新型寡配体试剂盒。用于严格区分神经型与红细胞型AChE及丁酰胆碱酯酶，作为NTD产前检查及实验室研究之工具。
四、 此项目的优势和原创性
本项目所发明的突触型AChE寡核苷酸寡配体特异性地与人源突触型AChE结合，而不与人源红细胞型AChE及人源丁酰胆碱酯酶结合，完全避免了穿刺获取羊水时可能造成的血液污染的干扰，避免了由此

产生的假阳性结果的出现，提高了NTDs的确诊率。
（1） 抗人源性突触型AChE的特异性脱氧核苷酸寡配体（简称寡配体）用于突触型AChE特异性鉴别的构思新颖，有原创性。
（2） 此寡配体特异性地与人源性突触型AChE反应，而不与人源性红细胞型及人源性丁酰胆碱酯酶反应，为国内外独创。
（3） 此寡配体可大量合成、易于生产、纯度高、成本低、稳定性好、可常温下运输、长期保存。
（4） 根据实验需要还可连接巯基、氨基、荧光素、酶等功能基因，扩大延伸其用途。
五、国内外研究状况
目前还未见到能有效区分神经型和红细胞膜型AChE的特异性试剂盒上市。
六、实验研究
1、免疫印迹（western blotting）
将人脑匀浆、纯化的人红细胞AChE及人全血样品进行SDS-PAGE，转膜后与生物素化寡配体孵育，然后用链亲和素标记的HRP显色。实验结果显示，寡配体与人脑AChE特异性地结合，在66 kD处呈现一条带（ 图1泳道B），而与纯化人红细胞AChE（图1泳道A）及人全血（图1 泳道C）无结合。说明寡配体可区分的人突触型AChE和人红细胞型AChE。
图1寡核苷酸适配体的免疫共沉淀。A) 纯化人红细胞AChE; B) 人脑匀浆；C) 人全血；D)纯化的人脑AChE
2、点杂交
将胆碱酯酶点样于NC膜上，封闭后，然后加入生物素化单克隆寡配体，再用链亲和素连接的HRP显色。结果表明寡核苷酸寡配体和天然及变性的人脑AChE和电鳐AChE显示特异性结合，而与人及牛红细胞AChE及人BChE无结合能力（表 1）。
表 1. 单克隆寡核苷酸寡配体和不同来源的纯化胆碱酯酶的点杂交
来源
天然酶
变性酶
人脑 AChE
人红细胞 AChE
人BChE
+
-
-
+
-
-

3、酶蛋白结合测定（ECA）
链亲和素包板，BSA封闭后，生物素化单克隆寡核苷酸寡配体加入每孔孵育。加稀释的不同种属的AChE和底物显色液，在414 nm波长处测定消光值。
ECA显示针对人脑AChE的寡配体与人脑AChE显示明显的特异性结合反应，而与人红细胞AChE及人BChE无结合现象（图2）。进一步说明了寡配体对人突触AChE的特异性。
图 2. 寡配体和不同来源的纯化的胆碱酯酶的酶蛋白结合测定。
(■)，人脑AChE; (○)， 人红细胞 AChE; (▼)， 人 BChE. n = 3， Mean ± SD.

4、试剂盒组份和操作步骤
1）组份
7

a) 96微孔板
b) 乙酰胆碱酯酶多克隆抗体
c) 羊抗兔酶标二抗
d) 阳性对照
e) 阴性对照血清
f) 浓缩洗涤液
g) 底物A
h) 底物B
i) 终止液
j) 自封袋

9

2）操作步骤：
（1） 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。
（2） 加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50ul或待测血清样品50ul于相应孔中。
（3） 加抗体：分别在每孔中加入乙酰胆碱酯酶多克隆抗体50ul，轻拍混匀。
（4） 温育：置37℃温育60分钟，室温平衡5分钟。
（5） 洗涤：充分洗涤5次。
（6） 加二抗：分别在每孔中加入羊抗兔酶标二抗50ul，轻拍混匀。
（7） 温育：置37℃温育60分钟，室温平衡5分钟。
（8） 洗涤：充分洗涤5次。
（9） 显色：每孔加入底物A、B各50ul，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟。
（10） 终止：每孔加终止液50ul，混匀。
（11） 测定：酶联仪414nm测定各孔OD值。
六、 知识产权情况
本项目为拥有自主知识产权的新型NTD诊断试剂。已申请中国专利（200310103048.7）。
七、 市场价值和前景
1、中国出生缺陷监测网报道，1996年1月至2000年12月，5年期间我国围产儿神经管缺损症流行病学资料如下：

发生率（每万人）
畸形儿数
无脑儿
5．0
8450
脊柱裂
6．3
10547
脑膨出
1．6
2704
总发生率
12．9
21701
注：我国婴儿年出生数1690万人
世界婴儿年出生数1.3亿人
2、生命科学实验室的常用生化试剂，国内外有一定需求量。
从以上分析，可以看出寡配体试剂盒有广阔市场和巨大经济效益和社会效益。本试剂盒成本低廉、工艺成熟、易于批量生产，如能尽快投入生产并加强营销运作，有可能在短时间内取得收益。
九、投资意向
专利使用权转让费100万元。转让方负责全程技术指导。
十、联系方式
李前 010—66874609 ，13051806097 bjliqian@