SNAP原理--LEADMAN.pdf

SNAPSNAP双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术与与牛乳中抗生素牛乳中抗生素/抗生素酶、三聚氰胺、黄曲霉毒素抗生素酶、三聚氰胺、黄曲霉毒素M1M1快速检测快速检测美国爱德士生物科技公司美国爱德士生物科技公司IDEXX Laboratories IncIDEXX Laboratories IncIDEXX内容内容公司简介公司简介抗生素残留的来源，国家限量标准及检测抗生素残留的来源，国家限量标准及检测SNAPSNAP双流向酶联免疫技术介绍双流向酶联免疫技术介绍 内酰胺酶介绍及检测技术内酰胺酶介绍及检测技术牛乳中三聚氰胺残留限量及检测牛乳中三聚氰胺残留限量及检测美国爱德士生物科技公司美国爱德士生物科技公司IDEXX Laboratories IncIDEXX Laboratories Inc美国爱德士生物科技有限公司美国爱德士生物科技有限公司美国爱德士生物科技有限公司,总部设在美国缅因州总部设在美国缅因州,在研发及生产牛奶抗生素残在研发及生产牛奶抗生素残余快速检测领域处于世界领先地位余快速检测领域处于世界领先地位.1.1.CAGCAG宠物检测及管理软件宠物检测及管理软件2.2.PASPAS经济动物检测经济动物检测3.3.牛奶抗生素残余快速检牛奶抗生素残余快速检（中国：业务部中国：业务部，技术支持技术支持，研发研发）4.4.水质检测水质检测1991年纳斯达克年纳斯达克（NASDAQ）上市上市,年销售量近年销售量近10亿美元亿美元,拥有拥有4700名员工及名员工及 超过超过40家分公司及分部的跨国生物科技公司家分公司及分部的跨国生物科技公司.兽药/污染物限量标准及控制Page 5抗生素抗生素（Antibiotics）及分类及分类抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一抗生素指由细菌、霉菌或其它微生物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类物质。现抗生素的种类已达几千种类物质。现抗生素的种类已达几千种,在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培在临床上常用的亦有几百种。其主要是从微生物的培养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类养液中提取的或者用合成、半合成方法制造。其分类(作为兽药）有以下几种：作为兽药）有以下几种：（一）（一）-内酰胺类内酰胺类:包括青霉素类和头孢菌素类,分子结构中含有-内酰胺环（二）氨基糖甙类（二）氨基糖甙类:链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素（三）四环素类：（三）四环素类：:四环素、土霉素、金霉素及强力霉素（四）氯霉素类（四）氯霉素类:氯霉素、甲砜霉素等（五）大环内脂类（五）大环内脂类:红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等（六）作用于（六）作用于G+细菌的其它抗生素：细菌的其它抗生素：林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等（七）作用于（七）作用于G菌的其它抗生素：菌的其它抗生素：多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等（八）抗真菌抗生素（八）抗真菌抗生素:灰黄霉素（九）具有免疫抑制作用的抗生素（九）具有免疫抑制作用的抗生素:环孢霉素（十）喹诺酮类（十）喹诺酮类:环丙沙星 恩诺沙星 Enrofloxacin图2 头孢菌素结构Page 7牛乳中最高残留限量规定牛乳中最高残留限量规定（-内酰胺抗生素）-内酰胺类兽药内酰胺类兽药:包括青霉素类和头孢菌素类包括青霉素类和头孢菌素类,分子结构中含有分子结构中含有-内酰胺环内酰胺环类别类别药物药物限量（限量（ug/kg)青霉素类青霉素G Benzylpenicillin4阿莫西林 Amoxicillin10氨苄西林 Ampicillin10氯唑西林 Cloxacillin30苯唑西林(苯唑青霉素)Oxacillin 30头孢类头孢氨苄 Cefalexin100头孢喹肟 Cefquinome20头孢噻呋 Ceftiofur100农业部公告第235号 二00二年十二月二十四日Page 8种类种类药物药物限量（限量（ug/kg)四环素类四环素类总量 Total Tetracyclines100四环素 Tetracycline100金霉素 Chlortetracycline/100土霉素 Oxytetracycline100氨基糖甙庆大霉素Gentamycin200链霉素/双氢链霉素Streptomycin/Dihydrostreptomycin200新霉素Neomycin500氯霉素甲砜霉素Thiamphenicol50氯霉素Chloramphenicol及其盐、酯(包括：琥珀氯霉素)0氟苯尼考 Florfenicol0磺胺类磺胺类总量 Sulfonamides100磺胺二甲嘧啶Sulfadimidine/Sulfamethazine25大环内酯泰乐菌素Tylosin50红霉素Erythromycin40喹诺酮达氟沙星 Danofloxacin30恩诺沙星 Enrofloxacin100作用于G+细菌林可霉素Lincomycin150牛乳中最高残留限量规定牛乳中最高残留限量规定（其他抗生素）农业部公告第235号 二00二年十二月二十四日双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术BiBi-directional Flowdirectional FlowELISAELISASNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术EnzymeColorless Substrate酶反应底物酶反应底物+antibodyConjugate酶标抗体酶标抗体抗体抗体+有催化底物能力的酶有催化底物能力的酶酶底物促进颜色发展酶底物促进颜色发展显色反应显色反应SNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术+antigen抗原抗原Conjugate Pellet酶标抗体阴性奶Negative Milk阳性奶阳性奶样品点样品点SAMPLE SPOT 样品点样品点原理原理奶样中的-内酰胺抗生素与试管内的酶标抗体结合未结合的酶标抗体将与事先包被了青霉素类似物的样品点结合显色剂中的底物遇到已结合到样品点上的酶标抗体后，被酶催化而显色样品点样品点-内酰胺抗生素显色反应显色反应SNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术阴性奶阴性奶阳性奶Positive Milk样品点样品点样品点样品点SAMPLE SPOT 原理原理 奶样加入试管后，不含-内酰胺抗生素，试管中的酶标抗体游离于奶样中 游离的酶标抗体将与样品点结合 显色剂在已跟样品点结合的酶标抗体的催化下显色样品点样品点显色反应显色反应Conjugate Pellet酶标抗体SNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术样品点SAMPLE SPOT阴性奶阴性奶Negative Milk阳性奶阳性奶Positive Milk深蓝深蓝Dark Blue浅蓝浅蓝Light Blue样品点SAMPLE SPOT 对照点Control Spot原理原理对照点上事先包被标准对照蛋白酶标抗体中含有抗标准对照蛋白的酶标抗体，其与对照点的标准对照蛋白结合显色剂中的底物遇到已结合到对照点上的酶标抗体后，被酶催化而显色根据参比样品点与对照点所呈现蓝色深浅的对比，判定结果对照蓝对照蓝Control BlueSNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术奶样加入含有酶标抗体的试管反应数分钟后，加入试剂盒加样孔。1.正向流动正向流动样品从加样孔向前流动到样品点和对照点，酶联耦合反应压下反应键，勾刺穿的洗涤液池和酶底物池。2.反向流动反向流动洗涤液先反向流动洗去反应点和对照点上的杂质酶底物接着反向流动到反应点和对照点，颜色在此两点发展。试纸条试纸条勾勾 刺刺洗涤液池洗涤液池吸湿块吸湿块按鍵按鍵SNAPSNAP 试剂盒结构试剂盒结构样品点和样品点和对照点对照点对照点对照点（对照蛋白）（对照蛋白）样品点样品点（固相抗原）（固相抗原）加样孔加样孔酶底物液池酶底物液池SNAPSNAP 试剂盒中的反应过程试剂盒中的反应过程1.1.加热样品被加入样品孔（-内酰胺抗生素和酶标抗体反应后）3.3.样品流动,反应窗口深蓝色变成白色5.洗涤液6.酶反应底物2 2.未结合的酶标抗体和样品点抗原结合4.4.按下反应键7.7.控制点显色控制点显色7.7.样品点显色样品点显色加热器读数仪SNAP快速检测操作过程耗材及设备快速检测操作过程耗材及设备SNAP试剂盒SNAP-内酰胺类ST试剂盒（货号：99-19338）SNAPduo-内酰胺-四环素试剂盒（99-27108）SNAPduo ST-内酰胺-四环素试剂盒（99-27421）-内酰胺SNAP四环素类试剂盒（99-11470）SNAPduo-内酰胺-四环素试剂盒（99-27108）SNAPduo ST-内酰胺-四环素试剂盒（00-27421）四环素SNAP庆大霉素检测试剂盒（99-09321）氨基糖甙类SNAP磺胺二甲嘧啶试剂盒（99-13380）磺胺类药物SNAP AFM1试剂盒（99-24964）天然毒素SNAP三聚氰胺试剂盒（99-18390）污染物SNAP产品分类按照检测内容SNAP产品分类按照检测方法需使用加热器 SNAPduo-内酰胺-四环素试剂盒 SNAP四环素试剂盒 SNAP AFM1试剂盒 SNAP磺胺二甲嘧啶试剂盒 SNAP三聚氰胺试剂盒 SNAP庆大霉素试剂盒常温操作 SNAP-内酰胺类ST试剂盒 SNAPduo ST-内酰胺-四环素试剂盒将样品加入样品试管将样品加入样品试管摇均混合摇均混合加热样品和试剂盒加热样品和试剂盒三聚氰胺，磺胺，庆大霉素、AFM12分钟 内酰胺，四环素5分钟需加热试剂盒的检测步骤需加热试剂盒的检测步骤第1步：准备将样品加入加样孔将样品加入加样孔加样孔加样孔激活环激活环激活环褪色激活环褪色一半一半时，按下时，按下Snap键，继续保温：键，继续保温：三聚氰胺，磺胺，庆大霉素、AFM7分钟 内酰胺，四环素4分钟需加热试剂盒的检测步骤需加热试剂盒的检测步骤第第2 2步：加样和按键步：加样和按键需加热试剂盒的操作步骤需加热试剂盒的操作步骤目测判断目测判断1.样品点深于对照点：阴性2.样品点浅于对照点：阳性读数仪判断读数仪判断（将试剂盒插入判读仪）（将试剂盒插入判读仪）1.1.05阳性2.1.05阴性第3步：判读结果常温操作试剂盒的使用步骤1.1.牛奶加入试管混匀牛奶加入试管混匀4.4.读数或目测读数或目测样品点对照点2.2.将牛奶加入样品孔将牛奶加入样品孔样品孔激活环3.3.激活试剂盒激活试剂盒等待等待6 6分钟分钟结果判定结果判定目测判断：目测判断：阴性/阳性读数仪判断读数仪判断:1.05阳性/1.05阴性SNAP SNAP -内酰胺类试剂盒内酰胺类试剂盒药物药物检出限检出限(ugug/kg)/kg)青霉素类青霉素G Benzylpenicillin3阿莫西林 Amoxicillin7-8氨苄西林 Ampicillin4-6双氯青霉素(双氯西林）Dicloxacillin20-25萘夫西林(新青霉素)Naficillin 70头孢类头孢氨苄 Cefalexin20-25头孢喹肟 Cefquinome20头孢噻呋Ceftiofur5-7头孢匹林Cephapirin10-12头孢洛宁Cephalonium3-5先锋5号(头孢唑啉)Cefazolin15-20头孢乙氰Cefacetril50头孢哌酮Cefaperazone 10-15第第3 3步：判断结果步：判断结果目测判断：目测判断：阴性/阳性读数仪判断读数仪判断:1.05阳性/1.05阴性SNAP SNAP 试剂试剂盒盒药物药物检出险检出险(ugug/kg)/kg)四环素类试剂盒四环素类试剂盒四环素 Tetracycline50金霉素 Chlortetracycline/100土霉素 Oxytetracycline50磺胺类试剂盒磺胺类试剂盒磺胺二甲嘧啶Sulfadimidine/Sulfamethazine10磺胺甲嘧啶Sulfamerazine100庆大霉素试剂盒庆大霉素试剂盒庆大霉素Gentamycin30SNAPshot DSR读数仪立刻判读触控式屏幕中文界面连接电脑，数据保存及分析软件批号样品号技朮人员编号日期及时间-内酰胺试剂盒：选择“beta-lactam(青霉素类)”其他试剂盒：选择“other(其他）”二合一试剂盒：选择“3-spot（三个点）”SNAP试剂盒使用要点复原乳还原复原乳还原还原用水温：建议45C5C,不要70C蛋白质变性、美拉德反应复原乳降温：建议至4C-8C,模拟生鲜乳,奶粉水合、排气复原乳还原要充分，奶样中的不溶颗粒会影响流动速度，很大程度上会影响结果吸取奶样吸取奶样伸入奶样中吸取，不要吸取表面的奶样预热和保温：预热和保温：试剂盒始终放置于加热器上激活的时机：读数：读数：1分钟之内读数，若呈色反应不完全（对照点颜色）可以继续放置于加热器上15秒-30秒后，立即读数Activation CircleEarlySNAPLate试剂盒储存温度:2C-8C检测样品要求:混合的生鲜乳试验开始之前:SNAP*Beta-Lactam ST 试剂盒可在正常的检测环境中进行(15C30C).当天使用的试剂盒需提前15分钟从冰箱中取出回温.未使用的试剂盒需放回冰箱冷藏样品必须低温储存0C10C，收集3天内检测常温操作试剂盒的注意事项不要让样品在试管中保留超过15秒.当样品流经激活环，但蓝色激活圈还未完全褪色，按下激活键激活后，显色6分钟，立即读数-内酰胺酶来源及检测技术-内酰胺酶检测-内酰胺酶内酰胺酶（-lactamase）来源分析：来源分析：细菌对细菌对 内酰胺类抗菌药物耐药最常见的机制内酰胺类抗菌药物耐药最常见的机制 一般存在于动物体内的耐药细菌内部一般存在于动物体内的耐药细菌内部 由多种酶组成的酶家族，数量超过由多种酶组成的酶家族，数量超过200200种，种，（其中超广谱其中超广谱-内酰胺酶内酰胺酶(extended spectrum(extended spectrum-lactamaselactamase，ESBL)ESBL)超过超过5050种）种）能水解能水解-内酰胺类抗生素内酰胺类抗生素这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中这些酶的基因存在于细菌的染色体或质粒中抗生素治疗抗生素治疗 生存于细菌内，水解方式使进入菌体内的-内酰胺类抗生素失活。产生-内酰胺酶的耐药菌需保持结构完整，几乎不会将自身的-内酰胺酶释放至宿主（动物）体内的 当耐药菌被宿主细胞（如白细胞或淋巴细胞）吞噬后，细菌内的-内酰胺酶会释放至动物体细胞内（如白细胞或淋巴细胞），动物细胞内部的蛋白酶会自动识别作为异体蛋白的-内酰胺酶，将其水解破坏。因此，在动物体内存在完整的-内酰胺酶的可能性小，即便有也会绝大部分经肝脏解毒分解或经肾脏排出体外，正常乳汁中存在完整的-内酰胺酶的可能性更小。1.05):-内酰胺酶阴性读数阴性(Negative,ratio1.05):-内酰胺酶阳性2.2.目测：目测：SNAP试剂盒阳性：-内酰胺酶阴性。SNAP试剂盒阴性：-内酰胺酶阳性.-内酰胺酶快速检测 SNAP 间接法三聚氰胺及检测三聚氰胺及检测其他潜在来源其他潜在来源 经饲料污染，生奶中可达0.3ppm以上三聚氰胺是一种常见的重要有机化工中间体，分子量126.12，用于建材、灭火剂、纺织、皮革、造纸等行业。含氮量高达66%，在“凯氏定氮法”中可以表现出“高蛋白质含量”的假象，换算成粗蛋白含量为416.27%。三聚氰胺及检测限量值限量值 婴幼儿配方乳粉：1mg/kg(1 ppm)液态奶（包括原料乳）、奶粉、其他配方乳粉：2.5mg/kg(2.5ppm)含乳15%以上的其他食品：2.5mg/kg液态原奶液态原料奶要求限量液态原料奶要求限量成品成品成品限量成品限量0.125婴儿奶粉10.310奶粉及配方奶粉2.52.5UHT2.5三聚氰胺及检测标准检测方法标准检测方法GB/T22388 高效液相色谱法：2毫克/千克 气相色谱-质谱联用法：0.05毫克/千克 液相色谱-质谱/质谱法：0.01毫克/千克其他方法其他方法 传统酶连免疫法 双流向酶连免疫法 胶体金法LOQLOQ样品前处理样品前处理检出检出/确认确认时间时间大型仪器大型仪器专业人员专业人员LCLC-MS/MSMS/MS0.01-0.05mg/kg需要两者均可2-2.5 h/样品需要需要GCGC-MS or MS or GCGC-MS/MSMS/MS0.01-0.1mg/kg需要两者均可2.5-3 h/样品需要需要HPLCHPLC-UVUV0.1-1mg/kg需要检出1.5 h/样品需要需要ELISAELISA0.01-1mg/kg(LOD)需要检出1-1.5 h/样品无需需要SNAPSNAP0.1mg0.1mg/kg/kg（LOD)LOD)无需无需检出检出9 9 分钟分钟/样品样品无需无需无需无需SNAPSNAP 技朮与其它常用方法检测奶样中三聚氰胺的比较技朮与其它常用方法检测奶样中三聚氰胺的比较EnzymeColorless Substrate酶反应底物酶反应底物+antibodyConjugate酶标抗体酶标抗体抗体抗体+有催化底物能力的酶有催化底物能力的酶酶底物促进颜色发展酶底物促进颜色发展显色反应显色反应SNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术+antigen抗原抗原Conjugate Pellet酶标抗体阴性奶Negative Milk阳性奶阳性奶样品点样品点SAMPLE SPOT 样品点样品点原理原理奶样中的三聚氰胺与试管内的酶标抗体结合未结合的酶标抗体将与事先包被了三聚氰胺的样品点结合显色剂中的底物遇到已结合到样品点上的酶标抗体后，被酶催化而显色样品点样品点三聚氰胺显色反应显色反应SNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术阴性奶阴性奶阳性奶Positive Milk样品点样品点样品点样品点SAMPLE SPOT 原理原理 奶样加入试管后，不含三聚氰胺，试管中的酶标抗体游离于奶样中 游离的酶标抗体将与样品点结合 显色剂在已跟样品点结合的酶标抗体的催化下显色样品点样品点显色反应显色反应Conjugate Pellet酶标抗体SNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术样品点SAMPLE SPOT阴性奶阴性奶Negative Milk阳性奶阳性奶Positive Milk深蓝深蓝Dark Blue浅蓝浅蓝Light Blue样品点SAMPLE SPOT 对照点Control Spot原理原理对照点上事先包被标准对照蛋白酶标抗体中含有抗标准对照蛋白的酶标抗体，其与对照点的标准对照蛋白结合显色剂中的底物遇到已结合到对照点上的酶标抗体后，被酶催化而显色根据参比样品点与对照点所呈现蓝色深浅的对比，判定结果对照蓝对照蓝Control BlueSNAPSNAP:双流向酶联免疫技术双流向酶联免疫技术第第3 3步：判断结果步：判断结果（三聚氰胺试剂盒）（三聚氰胺试剂盒）试剂盒特点：试剂盒特点：1.灵敏度高;检出限 0.3ppm 2.浓度和读数呈正相关性目测判断目测判断1.阴性：浓度 0.3ppm2.阳性：定量法确认读数仪判读读数仪判读读数0.800.901.051.501.95 2.00半定量判断0.05ppm0.1ppm0.3ppm1.0ppm2.0ppm2.5ppm认证及标准SNAPSNAP试剂盒试剂盒认证及符合标准认证及符合标准内酰胺类内酰胺类美国FDAAOAC 全美化学工程师协会NY50452008无公害食品生鲜牛乳中国农业部兽药残留检测试剂盒备案（农业部公告1387号）四环素类四环素类NY50452008无公害食品生鲜牛乳庆大霉素庆大霉素磺胺类磺胺类黄曲霉毒素黄曲霉毒素M1M1NY50452008无公害食品生鲜牛乳NY/T 1664牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测GB5413.37-2010食品安全国家标准乳与乳制品中黄曲霉毒素M1的测定三聚氰胺三聚氰胺 中国检验检疫科学研究院 农业部食品监督检验测试中心（上海）内酰胺酶内酰胺酶DSR 读数仪读数仪美国FDAAOAC加热器加热器仪器仪器SNAP操作视频演示谢谢 谢谢