电泳配方.doc

SDS-PAGE配方

1. 30% Acry溶液(4摄氏度)
丙烯酰胺 29.2g
N,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g
定容至100ml

2. 10% SDS（W/V）（室温）
SDS 10g 定容至100ml

3. 1.5M Tris-HCl pH 8.8(分离胶缓冲溶液)（4摄氏度）
Tris 18.15g 用6N HCl 调制pH 8.8 定容至100ml

4. 0.5M Tris-HCl, pH 6.8(浓缩胶缓冲溶液)（4摄氏度）
Tris 6g 用6N HCl 调制pH 6.8 定容至100ml

5.上样缓冲液（室温）
A液：（A液总量9.5ml） 超纯水 3.55 ml
0.5M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 ml
甘油（即丙三醇） 2.5ml
10% SDS 2.0ml
0.5%(W/V)溴酚蓝 0.2ml
用时取A液950ul,加入50ul β-巯基乙醇（即巯基乙醇）
样品：上样缓冲液为1：2 95℃ 加热 4 min

6. 10×电极缓冲液 pH8.3 (4摄氏度)
Tris 30.3g
甘氨酸 144.0g
SDS 10.0g
定容至1000ml（即1L）
注意！！不调pH!! 用时，稀释10倍，在室温下使用

7.10%（W/V） APS (过硫酸铵)
100mg 过硫酸铵 加入1ml的超纯水
明胶酶谱配方

1. 1%明胶溶液
1g明胶60℃溶于水中定容至100ml，4℃下贮存
2. 5×上样缓冲溶液
50%甘油、5%SDS、0.05%溴酚蓝、250mM Tris-Hcl pH 6.8
3. 10×电极缓冲液
Tris 30.3g、甘氨酸 144g、SDS 10g定容至1000ml pH 8.3）；
4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳贮液：
①30%丙烯酰胺溶液 丙烯酰胺29.2g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.8g避光定容到100ml
②分离胶缓冲溶液 1.5M Tris-HCl pH 8.8
③浓缩胶缓冲溶液 0.5M Tris-HCl, pH 6.8
④10%SDS溶液；
⑤10%过硫酸铵溶液；
5. 2.5% Triton X-100溶液；
6. 染色液
90mL 等体积甲醇(45ml)与水(45ml)混合液加入10ml冰乙酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R-250
7. 脱色液
300ml甲醇，100ml冰乙酸加水定容至1000ml
8. 明胶酶谱孵育液
50mM Tris-HCl，10mM CaCl2 pH 7.0
9. 考马斯亮蓝G-250染液
0.1g考马斯亮蓝G-250溶于95%乙醇中，加入100ml 85%浓磷酸加水定容至1000ml
10. 10Mm EDTA二钠溶液
分离胶配方（10ml）

浓度（%）
水（ml）
缓冲液
30%Acry
10%SDS
4
6.1
2.5
1.3
0.1
5
5.7
2.5
1.7
0.1
6
5.4
2.5
2.0
0.1
7
5.1
2.5
2.3
0.1
8
4.7
2.5
2.7
0.1
9
4.4
2.5
3.0
0.1
10
4.1
2.5
3.3
0.1
11
3.7
2.5
3.7
0.1
12
3.4
2.5
4.0
0.1
13
3.1
2.5
4.3
0.1
14
2.7
2.5
4.7
0.1
15
2.4
2.5
5.0
0.1
16
2.1
2.5
5.3
0.1
17
1.7
2.5
5.7
0.1
注：分离胶缓冲溶液为1.5M Tris-HCl pH 8.8
分离胶： 50ul 10%APS 和 5ul TEMED

浓缩胶配方（10ml）

浓度（%）
水（ml）
缓冲液
30%Acry
10%SDS
5
5.7
2.5
1.7
0.1
注：浓缩胶缓冲溶液为0.5M Tris-HCl, pH 6.8
浓缩胶： 50ul 10%APS 和 10ul TEMED

2.2.1.1 SDS-PAGE电泳试剂的配制
1）30% Acry（m/V）溶液(4℃)：
称取丙烯酰胺29.2g ，N,N-亚甲基双丙烯酰胺 0.8g ，超纯水定容至100mL，溶解过程应注意避光，配制完成的溶液倒入试剂瓶中，外套黑色塑料袋避光，4℃冰箱保存备用。
2）10% SDS（m/V）（室温）：
称取SDS 10g ,采用超纯水溶解定容至100mL，室温放置。
3）1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8(分离胶缓冲溶液)（4℃）：
称取Tris 18.15g，加入80mL左右超纯水溶解Tris，用6mol/L HCl将溶液调至pH 8.8，后用超纯水定容至100mL，4℃冰箱保存备用。
4)0.5mol/L Tris-HCl，pH 6.8(浓缩胶缓冲溶液)（4℃）：
称取Tris 6g ，加入约80mL左右超纯水溶解，用6mol/L HCl 调至pH 6.8，后用超纯水定容至100mL，4℃冰箱保存备用。
5）5×上样缓冲液：
8mol/L尿素，5% SDS，5%巯基乙醇，250mmol/L Tris-HCl(pH7.5)。
6） 10×电极缓冲液 pH8.3：
称量Tris 30.3g，甘氨酸144.0g，SDS 10.0g用超纯水定容至1000ml（即1L），用时稀释10倍，在室温下使用。
7）10%（w/V）过硫酸铵（APS）：
称量0.1g 过硫酸铵，加入1mL的超纯水，震荡混匀，现用现配。
8）SDS-PAGE脱色液：
SDS-PAGE脱色液中含50%的乙醇，9%的冰乙酸。配制试剂的水选用去离子水。配制时应在通风橱下，冰乙酸有强烈的刺鼻气味。
9）SDS-PAGE染色液：
量取454mL的50%的乙醇和46mL的冰乙酸，将两者混合均匀即为固定液。称量0.25g考马斯亮蓝R-250将其溶解于上述500mL的固定液中，完成配制后将染色液放入棕色瓶中保存，防止其见光失效，室温保存。
10）8%分离胶配方（10mL）：
添加顺序为4.7mL的超纯水，2.5mL的pH 8.8的缓冲液，2.7mL的30% Acry溶液，0.1mL的10%SDS，震荡混匀，后添加50μL 10% APS 和 5μL TEMED，震荡混匀。
11）5%浓缩胶配方（10mL）：
添加顺序为5.7mL的超纯水，2.5mL的pH 8.8的缓冲液，1.7mL的30% Acry溶液，0.1mL的10%SDS，震荡混匀，后添加50μL 10% APS和10μL TEMED，震荡混匀。
12）20mmol/L pH 9 Tris-HCl缓冲溶液（含10 mmol/L CaCl2）的配置：
准确称取2.42g Tris，1.11g无水CaCl2，溶于约800ml的去离子水中，用6mol/L的HCl调溶液pH至9，再用去离子水将溶液定容至1L。
2.2.1.2 明胶酶谱配方
1）1%明胶溶液：
称取0.1g明胶，在60℃的水浴条件下溶于超纯水中，定容至10mL。4℃下贮存，放置时间不超过一周。
2）2.5% Triton X-100溶液：
称量25g Triton X-100，溶解于离子水中，最后定容至1L。
3）明胶酶谱染色液：
量取90mL 等体积甲醇(45mL)与水(45mL)混合液加入10mL冰乙酸中溶解0.25g考马斯亮蓝R-250。试剂配好后倒入棕色瓶中室温保存。
4）明胶酶谱脱色液：
量取300mL甲醇，100mL冰乙酸加水定容至1000mL。