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副溶血性弧菌检验.doc

上传人:xrp****65 文档编号:6111347 上传时间:2024-11-28 格式:DOC 页数:9 大小:194.50KB 下载积分:10 金币
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资源描述
副溶血性弧菌检验 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌,为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一,尤其是在夏秋季节的沿海地区,经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品,引起爆发性食物中毒。在非沿海地区,因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全,根据副溶血性弧菌的特性,进行下列检验,以便鉴别诊断。 第一节 副溶血性弧菌标准的检验方法 一、检验方法 (一)操作步骤 1. 分离培养:首先称取样品25g,加225mL3.5%灭菌盐水,用均质器打碎或用乳钵磨碎,接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个,同时取10mL加入100mL增菌液中,放37℃8~16h培养后,涂上述平板进行分离,37℃培养18~24h取出观察,挑取可疑菌落,转种3.5%氯化钠三糖铁斜面,37℃、24h观察结果。 2. 涂片镜检:将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄(葡萄糖产酸不产气)、上层斜面不变(乳糖、蔗糖不分解)、有动力、不产生硫化氢,进行革兰氏染色镜检形态。 3. 嗜盐性试验:将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水(0%,3%,7%,10%)于37℃24h培养后观察生长情况,在无盐和10%盐的胨水中不生长,在3%和7%盐的胨水中生长良好者,继续进行下列有关试验。 4. 生化试验:分别接种下列各类生化培养基,葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P,赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验,放37℃培养,除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外,其他均在24h观察结果。 5. 动物试验:将上述符合各类反应的副溶血性弧菌,接种3.5%氯化钠胨水,经37℃、16~18h培养后,小鼠腹腔注射0.3mL,观察2~3d,将死亡小鼠进行解剖作分离培养。 (二)检验程序 图6-1 副溶血性弧菌检验程序 二、结果分析判定及注意事项 (一)样品处理 采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器,以无菌手续取有代表性的样品,样品必须尽快送检,不宜存放时间过长,副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快,但不适于低温生存,在寒冷的情况下容易死亡,防止待检材料冷冻,以免影响检验结果。 对采取的样品有时因受存放条件的影响(如低温冷冻或干燥时间过长等原因),使菌体处于受伤状态,故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养,但应注意为有利于细菌恢复,不宜选用抑制性较强的培养基,否则影响细菌生长。 样品经增菌8~16h后,转种平板进行分离,挑选可疑菌落,接种于含有3.5%盐的三糖铁培养基,此时挑选数目不应少于5个,尤其夏季海产食品混放,相互污染严重,时有不同型别的大量细菌存在,以防漏检。 (二)形态与染色 为革兰氏阴性无芽胞杆菌,易呈多形态,有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等,排列不规则,多数散在,偶而有成对排列,一般大小为0.3~0.7um×1~2um,单端一根鞭毛,有动力,运动活泼,两端浓染,在固体培养条件下能生长周鞭毛。 (三)培养特性 在普通琼脂培养基和普通液体培养基中都可生长,在无盐的条件下不生长,在含2%~3%氯化钠的培养基中生长最旺盛,氯化钠溶液浓度到达10%以上时不繁殖。 在肉汤和胨水等液体培养基中混浊生长,需氧性强,常在液体表面形成菌膜,在液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛,运行活泼。在固体培养基上,菌落常为隆起,圆形,稍混浊不透明,表面光滑,湿润,不产生色素。在比较新鲜湿润或软琼脂培养基上,有些副溶血性弧菌可形成不规则菌落或片状扩散生长,在0.7%以上琼脂的培养基上能生长周鞭毛(侧毛)。一般在20~25℃培养生长的周鞭毛较为稳定,而在37℃培养或24h以上的培养物,周鞭毛易于由菌体自发脱落,具有周鞭毛的菌株,在固体培养基上多表现扩散生长,单鞭毛的菌株在固体培养基上呈典型菌落,不表现扩散生长。 培养基的成分、种类、温度、湿度等条件的不同,都能对扩散生长有所影响,菌落形态也容易受条件的影响有所改变,如在嗜盐性平板上一般生长良好,而在SS琼脂平板上多呈较小的扁平菌落,不易挑起。在血平反上生长快可出现溶血环,在BCBS(硫代硫酸盐,柠檬酸盐,胆盐,蔗糖)和氯化钠蔗糖琼脂平板上,呈淡蓝或蓝绿色菌落。一般由腹泻病人初期分离者多为典型菌落,长期保存的细菌或条件不适宜时,常有菌落变粗糙,形状不整齐或菌落出现解离,有的在液体培养时呈沉淀生长现象。 pH生长范围为5~10,最适pH为7.2~8.2,发育最适温度为30~37℃。 (四)生化特性 本菌对葡萄糖产酸不产气,不分解乳糖和蔗糖,能分解甘露醇,产生靛基质,不产生硫化氢,甲基红阳性,V-P阴性,赖氨酸阳性,精氨酸阴性,鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性,溶血性多数阳性,有少数不溶血,主要生物化学性状见表6-1。 近年来由于细菌学基础研究的深入和检验技术的进步,逐渐对一些海水来源的嗜盐性弧菌有所认识,对其主要生化学性状与副溶血性弧菌的比较见表6-2。 表6-1 副溶血性弧菌的主要生物化学性状 项  目 项  目   耐盐性0%   -   甲基红   +    7% + v ╟ p -    10% - 靛基质 + 葡萄糖产酸 + 赖氨酸 + 葡萄糖产气 - 鸟氨酸 +/- 蔗糖 - 精氨酸 - 甘露醇 + 溶血性 +/- 硫化氢 -     注:+阳性;-阴性;+/-多数阳性,少数阴性。 表6-2 副溶血性弧菌与其他弧菌的鉴别 菌名 氧 化 酶 葡 萄 糖 产 气 赖 氨 酸 精 氨 酸 鸟 氨 酸 靛 基 质 明 胶 液 化 v ! p 乳 糖 蔗 糖 甘 露 醇 肌 醇 阿 拉 伯 糖 甘 露 糖 鼠 李 糖 β 半乳 糖 苷 硝 酸 盐 泳 动 盐胨水,% 0 6 8 10 副溶血性弧菌 v.parahaemoly-ticus + - + - + + + - - - + - d + - - + d - + + - 溶藻弧菌 v.alginolyicus + - + - + + + + - + + - - + - - + + - + + d o1霍乱弧菌 v.choleraeo1 + - + - + + + d (d) + + - - + - + + - d - -   非o1霍乱弧菌 v.cholerae nono1 + - + - + + + d (d) + + - - d - + + d + d - - 拟态弧菌 v.mimicus + - + - + + + - (d) - + - - + - + + - + d - - 河弧菌 v.fluialis + d - + - d + - - + + - + d d + + -   + + d 创伤弧菌 v.vulnificus + - + - + + + - + d d - - + - + + - - d - - 梅氏弧菌 v.metschnikouii - - d + - d + + d + + d - d - d - - - d - - 霍利斯弧菌 v.hollisae + - - - - + - - - - - - + + - - + - - d - - v.damsela - - d + - - - + - - - - - + - - + - - d - - 注:+90%以上为阳性;-90%以上为阴性;(+)迟缓阳性;d 11%~89%为阳性;(d) 11~89%迟缓阳性。 (五)溶血性试验 我妻氏用高盐血琼脂培养基,在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应,称此溶血性能为“神奈川现象”。 此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板,经37℃、24h培养,如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者,为“神奈川现象”阳性,若不出现透明溶血环或无明显溶血者,为“神奈川现象”阴性。 有致病性的副溶血性弧菌,多数为神奈川现象阳性,但亦有少数为阴性。 (六)动物试验 经上述检验的可疑菌株,用小鼠测定毒力,将16~18h的蛋白胨水或肉汤培养物,注射小鼠腹腔0.3~0.5mL,有毒力者可在5~10h发病死亡,长者有24h左右发病死亡。发病时有竖毛、运动不活泼,腹部紧贴罐底,呼吸困难,四肢抽搐、尾部痉挛震颤等症状。将死亡小鼠解剖后,取心血等内脏进行分离,可检出试验菌的纯培养。对照动物观察2~3d无异常现象。 但应注意,尚有一些溶藻弧菌也可引起小鼠死亡,有时不易区别,需要上述毓的检验后,进行毒力证实,综合判定结果。 三、培养基   (一)氯化钠结晶紫增菌液   成分:蛋白胨 20g      氯化钠 40g      0.01%结晶紫溶液 5mL      蒸馏水 1000mL              pH9.0   制法:除结晶紫外其他按上述成分配好,加热溶解,约加3%氢氧化钾溶液4.5mL,校正pH,加热煮沸,过滤,再加入结晶紫溶液,混合分装试管,121℃高压灭菌15min。 (二)氯化钠蔗糖琼脂   成分:蛋白胨 10g      牛肉膏 10g      氯化钠 50g      蔗糖 10g      琼脂 18g      0.2%溴麝香草酚蓝溶液 20mL      蒸馏水 1000mL              pH7.8   制法:将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂,加热溶解,过滤,加入指示剂,分装烧瓶100mL,121℃高压灭菌15min备用。临用前在100mL培养基内加入蔗糖1g,加热溶化,冷至50℃倾注平板。 (三)嗜盐菌选择性培养基   成分:蛋白胨 20g      氯化钠 40g      琼脂 17g      0.01%结晶紫溶液 5mL      蒸馏水 1000mL              pH8.7   制法:除结晶紫和琼脂外,其他按上述成分配好,校正pH,加入琼脂,加热溶解,再加结晶紫溶液,分装烧瓶,每瓶100mL。 (四)3.5%氯化钠三糖铁琼脂   成分:蛋白胨 20g      牛肉膏 5g      乳糖 10g      蔗糖 10g      葡萄糖 1g      氯化钠 35g      硫酸亚铁铵 0.2g      硫代硫酸钠 0.2g      琼脂 12g      酚红 0.025g      蒸馏水 1000mL              pH7.4   制法:将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH,加入琼脂,加热煮沸使琼脂溶化,加入0.2%酚红溶液12.5mL,摇匀,分装试管,121℃高压灭菌15min,放置高层斜面备用。 (五)氯化钠血琼脂(我妻氏培养基)   成分:酵母膏 3g      蛋白胨 10g      氯化钠 70g      磷酸氢二钠 5g      甘露醇 10g      结晶紫 0.001g      琼脂 15g      蒸馏水 1000mL 制法:调pH8.0,加热30min(不必高压),待冷至45℃左右时,加入新鲜人或兔血(5%~10%),混合均匀,倾注平皿。 (六)嗜盐性试验培养基   成分:蛋白胨 2g      氯化钠 按不同量加入      蒸馏水 100mL              pH7.7   (七)3.5%氯化钠生化试验培养基   成分:牛肉膏 5g      蛋白胨 10g      氯化钠 35g      磷酸氢二钠 2g      0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL      蒸馏水 1000mL              pH7.7   制法:将上述成分配好后,根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类,葡萄糖发酵管可按0.5%葡萄糖加入后,分装有小倒管的试管内,121℃高压灭菌15min。其他培养基可分装为每瓶100mL,121℃高压灭菌15min,另将各糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌后,取5mL糖液,加入100mL培养基内,以无菌操作分装小试管。 (八)葡萄糖食盐胨水(MR-VP试验用)   成分:多胨 5g      葡萄糖 5g      磷酸氢二钾 5g      氯化钠 30g 制法:加入1000mL蒸馏水,振摇加热,使全部溶解,冷却后分装小试管,121℃高压灭菌15min。 (九)食盐胨水(靛基质试验用)   成分:蛋白胨 20g      氯化钠 30g      蒸馏水 1000mL              pH7.4   制法:按上述分配制,分装小试管,121℃高压灭菌15min。 (十)运动性试验培养基   成分:牛肉膏 3g      蛋白胨 10g      氯化钠 30g      琼脂 4g 制法:将全部成分加入1000mL蒸馏水,加热溶解,分装试管,121℃15min高压灭菌,最终pH7.4。 第二节 副溶血性弧菌参考检验方法 一、日本食品微生物检验方法 (一)分离、菌数测定 图6-2 分离、菌数测定程序 (二)鉴定 将TCBS平板上生长典型或可疑的菌落挑取2个以上,接种以下培养基: 图6-3 鉴定程序 (三)检查用培养基 1. 3%氯化钠蛋白胨稀释液:蛋白胨10g、氯化钠30g溶于1000mL蒸馏水中,校正pH7.0,121℃15min高压灭菌。 2. TCBS     成分:酵母膏 5g      蛋白胨 10g      蔗糖 20g      硫代硫酸钠 10g      柠檬酸钠 10g      牛胆酸钠 3g      牛胆汁粉 5g      氯化钠 10g      柠檬酸铁 1g      溴麝香草酚蓝(2%溶液) 20mL      草酚蓝(1%溶液) 4mL      琼脂 15g              pH8.6   制法:将上述成分加蒸馏水至1000mL,混合,使全部溶解,校正pH为8.6,加热煮沸,不需高压灭菌,倾注平皿15~20mL。 不分解蔗糖的副溶血性弧菌,在此培养基上生长呈蓝绿色菌落,分解蔗糖的细菌呈黄色菌落。 3. 我妻氏琼脂(改良)培养基   成分:酵母膏 5g      蛋白胨 10g      氯化钠 70g      甘露醇 5g      结晶紫(0.1%酒精溶液) 1mL      琼脂 15g 制法:将全部成分溶于1000mL蒸馏水中,调正pH为7.5,至完全溶解后,加热煮沸数分钟,不需高压灭菌,冷却至50℃时,加入洗净的20%浓度的人红血球悬液100mL,混合均匀后倾注平皿。 红血球悬液的制备:将人的脱纤维血液,离心沉淀的血球,用0.85%灭菌生理盐水洗3次,最后沉淀的红血球,用生理盐水制成1:4的悬液。 4. 亚硫酸铋肉汤   成分:蛋白胨 10g      氯化钠 25g      氯化钾 0.7g      氯化镁 5g 制法:加蒸馏水950mL溶解,调pH为9.1,121℃高压灭菌15min,室温冷却,加亚硫酸铋溶液100mL及95%酒精1mL,混匀,无菌手续加入灭菌试管,每管100mL,不需加热。 亚硫酸铋溶液配制:①热水100mL,加亚硫酸钠20g;②热水100mL加柠檬酸铋铵0.1g;③将①加②溶解甘露醇20g,煮沸1min,最终成白色混浊的混合物,使用前摇匀。于冷库贮存,可使用1个月。 5. 食盐碳水化合物肉汤基础液   成分:蛋白胨 2g      硫酸钠 2.5g      氯化铵 5g      磷酸二氢钠 0.5g      磷酸氢二钠 1.5g      0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL 制法:将全部成分溶于1000人工海水中,分装试管,每管5mL,121℃15min高压灭菌,冷却后分别加碳水化合物10%灭菌溶液0.5mL。碳水化合物溶液需过滤或115℃10min高压灭菌。 人工海水的配制:氯化钠23.4g,氯化钾0.66g,硫酸钠3.91g,重碳酸钠0.19g,氯化镁4.96g,将上述全部成分溶于1000mL蒸馏水。 6.Hugh-Leifson食盐培养基   成分:蛋白胨 2g      氯酸钠 30g      磷酸氢二钾 0.3g      葡萄糖 10g      琼脂 4g      0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL      蒸馏水 1000mL              pH7.4   制法:将上述成分溶解,调pH后加指示剂,分装试管,每管3mL,121℃高压灭菌15min。 试验方法:穿刺接种两种,一管加矿物油覆盖表面,于35~37℃培养,两管同时变黄为葡萄糖发酵,只有不加矿物油的培养管变黄时为葡萄氧化。 二、耐热溶血毒检验方法 根据试验证明,神奈川现象阳性菌株,多数对人的致病性有密切关系,神奈川现象的阳性物质称“耐热性溶血素”,检验副溶血性弧菌是否产生耐热性溶血毒,可参考下述方法: (一)Sahuria(樱井氏)法 用副溶血性弧菌肉汤培养物上清液为抗原,与制备的精制耐热性溶血毒的抗血清进行琼脂扩散试验,观察沉淀线。 (二)Elek法(本田改良法) 以微研No.1琼脂(Difco胨30g,磷酸氢二钠30g,氯化钠40g,葡萄糖5g,琼脂15g,蒸馏水1000mL,pH7.3)培养37℃过夜,在平板上菌落旁约为5mm处放一小滤纸片(上吸有抗血清),室温放一夜,观察滤纸旁有无沉淀红。 (三)液体培养检验法(饭田民) 用2%氯化钠肉汤,加入少量新鲜红血球,倾斜培养,神奈川现象阳性菌株能引起溶血,而阴性菌株不溶血。 (四)反相被动血球凝集法(太田氏) 用吸附抗体的红血球测定抗原(溶血毒),此方法极为敏感,可查出微量耐热性溶血毒。并发现神奈川现象阴性的菌株也产生少量的耐热性溶血毒。 三、至病性试验方法   (一)兔肠袢结扎试验 选用正常健康家兔,首选使家兔断食24h,用乙醚麻醉,将腹壁切口,露出小肠,选取肠段约5cm左右,于两端结扎,注入检菌的肉汤培养物,同时另选两段作阳性和阴性对照,然后迅速缝合,24h后由耳静脉注入空气杀死,开腹检查,有致病性者注菌肠段可见肿胀积液,出现坏死现象。 一般认为神奈川现象阳性菌株,兔肠袢结扎试验多数为阳性反应,神奈川现象阴性菌株多数为阴性,但亦有少数为阳性者。 (二)新生兔经口试验 选用1~2日龄的新生家兔,将检菌的培养物经口喂入1~2mL,有致病性者一般可在10~20h发病,初期症状蜷缩不动,随后呈极度疼痛状,翻滚嚎叫,呼吸急促,痉挛,多数在24h左右死亡,解剖可见内脏充血现象。 无毒株不发病,可对致病性副溶血性弧菌与非致病性溶藻弧菌进行鉴别。 四、血清学检验   进行副溶血性弧菌血清学鉴定时,可用O抗原分群,将18-24h的培养物,用3%食盐水作成较浓的菌悬液,121℃高压1h或100℃煮沸 后,用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集试验,同时用无菌生理盐水作对照,如O凝集反应阳性时,可用不经加热的菌悬液进行K抗血清玻片凝集反应分型判定。 副溶血性弧菌有三种抗原,即O抗原(菌体抗原),K抗原(荚膜抗原)及H抗原(鞭毛抗原),日本泷川氏和坂崎氏,根据对本菌血清学特性的研究,经逐年的进展,将副溶血性弧菌分出11个O群,60个K型,63个血清型。关于H抗原,因与其他弧菌有共同性,至今在血清型别的分类上没有利用。副溶血性弧菌的抗原组合见表6-3。 表6-3 副溶血性弧菌的抗原组合 o群 k     型 1 1,25,26,32,38,41,56,58a,64 2 3,28 3 4a,5,6,7,29,30 a,31,33,37,43,45,48,54,57,58 a,59 4 4 a,8,9,10,11,12,13,34,42,49,53,55,63 5 15,17,30 a,47,60,61 6 18,46 7 19 8 20,21,22,39,62 9 23,44 10 19,24,53 11 36,40,50,51 总计11 60k型/63血清型
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