用加校正因子的主成分自身对照法测定前列地尔中有关物质的含量.pdf

学 报Journal of China PharmaceuticalUniversity?2010,41(5):462-466用加校正因子的主成分自身对照法测定注射用前列地尔中有关物质的含量丁?锐,纪?宏,陈?思,刘奕明,余?立*(北京市药品检验所,北京 100035)摘?要?建立用加校正因子的主成分自身对照法测定注射用前列地尔中有关物质的含量。采用 C18色谱柱(250mm?4?6mm,5?m),以 0?007mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6?50)?乙腈?甲醇(70 25 5)为流动相,流速为 1?5 mL/min,柱温为30!,检测波长为 196 nm,进样量为 20?L。测定前列腺素 A1、前列腺素 B1相对于前列地尔的相对保留时间及校正因子,并计算其含量;前列地尔、前列腺素 A1、前列腺素 B1的质量浓度在 0?125 50?0?g/mL 范围内线性关系良好,r 均达到0?999,杂质前列腺素 A1和前列腺素 B1相对于主成分前列地尔的相对保留时间分别为 2?70和 2?87,校正因子分别为2?296和 1?681。本方法操作简便,结果准确可靠,无需提供杂质对照品,能够准确测定注射用前列地尔的有关物质。关键词?前列地尔;前列腺素 A1;前列腺素 B1;校正因子中图分类号?TQ460?72?文献标识码?A?文章编号?1000-5048(2010)05-0462-05Assay of the related substances in alprostadil for injection with the correctionfactorDING Ru,i JIHong,CHEN S,i LIU Yi?m ing,YU L i*Beijing Institutefor Drug Control,Beijing 100035,ChinaAbstract?To establish a method using the correction factor for the deter m ination of the related substance inalprostadil for injection?The assay was carried out on a C18column(250 mm?4?6 mm,5?m)w ith themobilephase of 0?007 mol/L phosphate buffer solution(p H 6.50)?acetonitrile?methanol(70 25 5)at a flow rate of1?5mL/m in.The column te mperature,the detection wavelength and the injection volume were set at 30 C,196n m,and 20?L,respectively?The relative retention ti m e and the correction factor between prostaglandin A1andalprostadi,l prostaglandin B1and alprostadilwere deter m ined?The relative retention ti m e was used to determ inethe position of prostaglandin A1and prostaglandin B1,the correction factor was used to deter m ine the content ofprostaglandin A1and prostaglandin B1i mpurities in alprostadil?Good linear relationships of alprostadi,l prosta?glandin A1and prostaglandin B1were obtained over the concentration range of 0?125?50?0?g/mL(r=0?999).The relative retention ti me bet ween prostaglandinA1and alprostadilwas 2?70,the relative retention ti mebetween prostaglandinA1and alprostadilwas 2?87;the correction factor bet ween prostaglandinA1and alprostadilwas 2?296;the correction factor bet ween prostaglandin B1and alprostadilwas 1?681?Thism ethod was proved tobe si mple,accurate and reliable to deter m ine the related substance of alprostadil for injection w ithout standardsubstances of prostaglandin A1and prostaglandin B1?Key words?alprostadi;l prostaglandin A1;prostaglandin B1;correction factorThe study was spported by the Biochemical Phar maceuticsResearch Project forChinese Pharmacopoeia(2010,Vo.l II)ofChinesePhar macopoeia Comm ission462*收稿日期?2010?03?10?*通讯作者?T e:l 010-83222411?E?mai:l YuL iyy8716 vip?sina?com基金项目?国家药典委员会#中华人民共和国药典2010年版(二部)生化药品专业科研资助项目第 5期丁?锐等:用加校正因子的主成分自身对照法测定注射用前列地尔中有关物质的含量?前列地尔(alprostadil)主要成分为前列腺素E1,其化学名称为:11?,15(S)?二羟基?9?羰基?13?反前列烯酸 1,其临床适应证主要为改善心脑血管微循 环障碍,用 于脏器 移植术 后抗栓 治疗等 2-4。注射用前列地尔质量标准收载于#中国药典 2005年版二部 1。依据质量标准,在多次对国内厂家生产的注射用前列地尔进行有关物质的检验中发现:其两个主要已知杂质前列腺素 A1和前列腺素 B1的色谱峰几乎重叠。因前列腺素 A1与前列腺素 B1的化学结构极为类似(图 1),造成用现行质量标准所述色谱条件对上述 3组分进行洗脱时,前列腺素 A1和前列腺素 B1两色谱峰的分离度远远达不到基线分离的要求,从而不能对二者进行准确定量。本研究建立了新的色谱系统,不仅解决了上述问题,还省去了对价格高昂的前列腺素A1和前列腺素 B1杂质对照品的依赖。Figure 1?Str ucture of alprostadi,l prostaglandinA1and prostag landin B11?材?料1?1?试?剂前列地尔对照品(中国药品生物制品检定所,批号:140659?200702,纯度:99?1%)、前列腺素 A1对照品(美国药典对照品,批号:1578500,纯度:100%)、前列腺素 B1对照品(美国药典对照品,批号:1578554,纯度:100%);注射用前列地尔(北京赛生 药 业有 限 公 司,规格:0?1 mg/支,批 号:200806192、200807115、200809216);乙腈、甲醇、乙醇均为色谱纯(德国 Merck公司),水为超纯水,其余试剂均为市售分析纯。1?2?仪?器由 SPD?M20A型高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、色谱工作站(日本岛津公司)与 AlltechA llti ma C18色谱柱(250 mm?4?6 mm,5?m)组成仪器系统 1(System 1);由 1200 series型高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、色谱工作站(美国安捷伦公司)与W elchmaterialsC18色谱柱(250mm?4?6 mm,5?m)组 成仪 器系 统 2(System 2)。AG245电子天平(德国 M ettler公司)。2?方法与结果2?1?色谱条件C18色谱柱(250 mm?4?6 mm,5?m);流动相为 0?007 mol/L磷酸盐缓冲液(p H 6?50)?乙腈?甲醇(70 25 5);流速 1?5mL/m in。柱温为 30!;检测波长为 196 nm;进样量 20?L。2?2?供试品溶液的制备取注射用前列地尔样品,加 25%乙醇溶液制成每 1 mL中含前列地尔 0?1mg的溶液。2?3?检测波长的选择用 25%乙醇将前列地尔、前列腺素 A1和前列腺素 B1对照品分别制成浓度约为 0?1 mg/mL的溶液进行紫外扫描。结果显示,前列地尔、前列腺素 A1在 196 nm 波长附近有最大吸收,前列腺素B1在 196 nm波长处吸收度较高,因此选取 196 nm作为检测波长。2?4?专属性考察2?4?1?分离度?称取前列地尔、前列腺素 A1和前列腺素 B1对照品适量,用 25%乙醇溶液制成每1mL中各约含 10?g的混合溶液,按%2?1&所述色谱条件进样,记录色谱图,见图 2。结果表明,上述3种物质能达到基线分离。Figure 2?HPLC chromatograms of alprostadil(1),prostaglandin A1(2)and prostaglandin B1(3)2?4?2?破坏性试验?取注射用前列地尔样品,加25%乙醇溶液制成每 1 mL 中含前列地尔 0?1 mg的溶液,取上述溶液 2 mL,分别加 0?1 mol/L 盐酸溶液 1滴,0?1mol/L氢氧化钠溶液 1滴,30%过氧化氢溶液 1滴,摇匀、放置 1 h后,照%2?1&项下进行实验,记录色谱图。取注射用前列地尔样品分别置于 4 500 lx的灯光下照 24 h,60!烤箱中加热463学报?Journal of China Phar maceuticalUniversity第 41卷4 h,取光破坏和高温破坏样品适量,加 25%乙醇制成 0?1 mg/mL 的溶液,照%2?1&项下进行分析。结果显示,各种破坏条件下,前列地尔、前列腺素A1、前列腺素 B1及各降解产物色谱峰之间分离良好。色谱图见图 3(A?E)。经碱破坏试验后,样品色谱图中降解产物峰最多,采用二极管阵列检测器测定上述碱破坏试验所得的色谱图中前列地尔、前列腺素 A1峰与前列腺素 B1色谱峰纯度均为 100%。Figure 3?HPLC chromatograms of alprostadil for injection destroyed by acid(A),a lkali(B),ox idation(C),light(D)and heat(E)1:A lprostadi;l 2:Prostag landin A1;3:Prostaglandin B12?4?3?线性关系、相对保留时间、校正因子的考察?取前列地尔、前列腺素 A1和前列腺素 B1对照品各约 5mg,用 25%乙醇溶液制成 100?g/mL的溶液,作为母液,精密量取母液适量,用 25%乙醇溶液制成质量浓度分别为 50?0,35?0,25?0,12?5,5?00,1?25,0?50,0?25,0?125?g/mL 的溶液。按%2?1&项下所述色谱条件,精密量取上述溶液各20?L分别注入仪器系统 1与仪器系统 2,测定保留时间和各色谱峰面积。以各浓度点色谱峰的平均保留时间(tR)计算前列腺素 A1相对于前列地尔的相对保留时间 tA1,前列腺素 B1相对于前列地尔的相对保留时间 tB1;以溶液浓度(c)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,分别测定前列腺素 A1与前列地尔、前列腺素 B1与前列地尔的线性方程及回归系数 r,以前列腺素 A1与前列地尔线性方程的斜率计算前列腺素 A1相对于前列地尔的校正因子(f),f=(A前列腺素A1/c前列腺素A1)/(A前列地尔/c前列地尔);同理计算前列腺素 B1相对于前列地尔的校正因子。结果表明,前列地尔、前列腺素 A1、前列腺素 B1的质量浓度在 0?125 50?0?g/mL范围内线性关系良好,r均达到 0?999,杂质前列腺素 A1和前列腺素 B1相对于主成分前列地尔的相对保留时间分别为 2?70和 2?87,校正因子分别为 2?296和 1?681(见表 1)。Table 1?Relative retention ti me(RRT)and correction factor(f)of prostaglandinA1and prostag landin B1SystemCompd.?tR/minRRTLinear equationrf1Prostaglandin A137.402.70A=7 675.6c+4 023.50.999 52.300Prostaglandin B139.812.87A=5 617.5c+2 724.40.999 21.683A lprostadil13.85A=3 337.8c+2 310.80.999 22Prostaglandin A135.262.69A=7 635.2c+4 278.50.999 32.292Prostaglandin B137.492.86A=5 593.3c+3 034.10.999 61.679A lprostadil13.12A=3 331.6c+2 405.90.999 32?4?4?最低检测限和定量限?在选定的色谱条件下,按信噪比为 3和 10分别作为最低检测限和最低定量限,测得在上述两套仪器系统中前列地尔、前列腺素 A1和前列腺素 B1的最低检测限分别为1?2、1?1 ng;0?5、0?6 ng;0?8、0?7 ng。最低定量限分别为 6?0、5?8 ng;3?5、3?4 ng;4?6、4?4 ng。464第 5期丁?锐等:用加校正因子的主成分自身对照法测定注射用前列地尔中有关物质的含量2?4?5?精密度、重复性试验?取%2?2&项下供试品溶液,在仪器系统 1与仪器系统 2中各连续进样6次,测得,前列地尔峰面积的 RSD分别为 0?6%,0?5%。取同一批样品,平行制备 6份供试品溶液,测定含量,在仪器系统 1与仪器系统 2中前列地尔含量的平均值分别为 90?8%,RSD为 0?4%(n=6);91?0%,RSD为 0?4%(n=6)。2?4?6?稳定性试验?按%2?2&项下方法制备供试品溶液,分别于 0,2,4,6,8 h在仪器系统 1与仪器系统 2中各进样 1次,并记录色谱图,扣除溶剂与辅料峰,按面积归一化法计算前列地尔含量的RSD为 0?6%、0?4%,前列腺素 A1含量的 RSD为0?4%、0?3%,前列腺素 B1含量的 RSD为 0?5%、0?5%,其他杂质含量的 RSD为 0?7%、0?8%。2?4?7?回收率试验?按注射用前列地尔处方,精密称取前列地尔和辅料,参考#中华人民共和国药典 2005年版二部注射用前列地尔有关物质项下对前列腺素 A1不得过 10?0%的要求 1,精密称取前列腺素 A1、前列腺素 B1适量,配置成相当于供试品溶液浓度 1%、5%、10%的溶液,每个浓度配置 3份,前列腺素 A1的平均回收率为 100?5%,RSD为 0?8%,前列 腺素 B1的平均 回收 率为99?7%,RSD为 0?7%。2?5?有关物质的测定2?5?1?用加校正因子的主成分自身对照法对有关物质的测定结果?取注射用前列地尔样品,按%2?2&项下方法制备供试品溶液,精密量取供试品溶液 5mL,置 50 mL量瓶中,加 25%乙醇溶液稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。按%2?1&项下操作,取对照品溶液 20?L,注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高为满量程的 10%15%;再精密量取供试品溶液和对照品溶液各20?L,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至前列地尔峰保留时间的 4倍。根据所得峰面积、校正因子和 10%限度对照溶液主峰面积,分别得 3批样品中前列腺素 A1的含量(%)分别为:6?3、6?8和6?5;前列腺素 B1的含量(%)分别为:2?2、2?5和2?8;其他未知 杂质总量(%)分别为:1?1、1?4和 1?3。2?5?2?用外标法对有关物质的测定结果?取前列地尔、前列腺素 A1和前列腺素 B1对照品各适量,用 25%乙醇溶液制成每 1 mL 中分别含 10、10、5?g的混合溶液,作为对照品溶液。按%2?2&项下制备供试品溶液。按%2?1&项下操作,取对照品溶液与供试品溶液各 20?L分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法,计算前列腺素 A1和前列腺素B1的含量;供试品溶液色谱图,扣除溶剂与辅料峰,其他未知杂质峰面积的和与上述 10%限度对照溶液主峰面积进行比较,计算其他未知杂质的含量。测得 3批样品中前列腺素 A1的含量(%)分别为 6?2、6?7和 6?6;前列腺素 B1的含量(%)分别为 2?3、2?4和 2?7;其他未知杂质总量(%)分别为 1?1、1?5和 1?3。结果表明,两种方法对同批次样品有关物质的测定结果一致。3?讨?论前列地尔属于酸性化合物,通过破坏试验可知,在碱性条件下,前列地尔部分降解成前列腺素A1、前列腺素 B1及其他杂质;而在偏酸性条件下,前列地尔较稳定,本方法流动相中含有大量的偏酸性缓冲盐溶液,保障了样品的稳定性。笔者查阅了有关前列地尔、前列腺素 A1与前列腺素 B1检测的文献,按文献 5?12所述,先后采用多种流动相,均不能使前列地尔、前列腺素 A1与前列腺素 B1三者达到基线分离。文献 13采用荧光标记反相高效液相色谱法测定前列腺素的组成,对流动相比例进行适当调整,并更换不同品牌色谱柱,亦无法取得满意的分离效果,且其方法相对繁琐。国家药品标准采用柱前衍生,加内标,并用紫外光谱检测前列地尔注射液中前列地尔和前列腺素 A1的含量 14,方法较为繁琐且需要定制特殊的衍生管,不易于方法的普及。上述文献也均未对前列腺素 A1与前列腺素 B1的分离度及各自相邻杂质的分离度提出要求。#中华人民共和国药典 2005年版二部注射用前列地尔质量标准有关物质项检测波长为214 n m 1。而前列地尔、前列腺素 A1在 196 nm波长附近有最大吸收,前列腺素 B1在 196 nm波长处吸收值较高。参考日本药局方 2006年版中收录的前列地尔原料药质量标准(流动相中含甲醇和乙腈)15检测波长采用 196 nm,同时考虑到市售高效液相色谱仪均带有自动扣除流动相和溶剂背景的功能,本文最终将检测波长设定为 196 nm。465学报?Journal of China Phar maceuticalUniversity第 41卷除文中所述色谱柱外,本方法还考察了 W atersC18(250mm?4?6mm,5?m)、Extend C18(250mm?4?6 mm,5?m)、XDB C18(150 mm?4?6 mm,5?m)色谱柱,结果上述色谱柱试验的前列地尔、前列腺素 A1与前列腺素 B1及其他杂质均能很好的分离。使用杂质对照品的外标法能准确测定杂质含量。按照我国药品质量主管部门相关规定,一旦方法确定并上升为国家标准后,就只能使用我国法定权威部门颁布的相应工作对照品,而不能使用国外对照品。目前,我国法定权威部门只公开颁布并发售前列地尔对照品,暂时没有公开颁布并发售前列腺素 A1和前列腺素 B1对照品,如建立对照品外标法测定注射用前列地尔中的有关物质,则面临在日后的检测工作中不能从国家法定机构获得杂质对照品的窘境。基于上述原因,本研究建立了加校正因子的主成分自身对照法测定注射用前列地尔中的有关物质的方法,其结果与用杂质对照品外标法测定的结果一致。即使允许购买国外对照品对国内药品进行检验,但因其价格高昂(前列腺素 A1和前列腺素 B1每支对照品价值约数千美元),使得部分资金短缺的药检部门难于开展工作。加校正因子的主成分自身对照法省去了对前列腺素 A1与前列腺素 B1杂质对照品的依赖,使得其易于推广,在国内各级药检机构都能适用,尤其在国内较偏远地区药检机构易于普及,为各级药检机构提供了方法上的保障,同时也为其他药品在检验中遇到此类情况时提供了解决问题的思路。参 考 文 献 1?国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部 M.北京:化学工业出版社,2005:448?2?王?丽(W ang L).前列地尔的临床应用 J.天津药学(Tianjin Phar m),2006,18(2):52-54?3?胡?志(Hu Z),高?丽(Gao L),孙秀峰(Sun XF),等.前列地尔临床应用的综合评价 J.中国处方药(Chin J PresDrug),2005,37(4):73-77?4?FabbriA,M agalottiD,BriziM,et al.Prostaglandin E1infusionand functional hepatic flowin control subjects 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