蛋白质翻译后脂修饰.pdf

中国科学:化学 2013 年 第 43 卷 第 1 期:35 48 SCIENTIA SINICA Chimica 中国科学杂志社SCIENCE CHINA PRESS自然科学基金项目进展专栏 自然科学基金项目进展专栏 评 述 蛋白质翻译后脂修饰的结构和功能分析:靶向 细胞脂信号 钟鸿英*,杨光富*华中师范大学化学学院;教育部农药与化学生物学重点实验室,武汉 430079*通讯作者,E-mail:; 收稿日期:2012-07-02;接收日期:2012-07-30;网络版发表日期:2012-09-04 doi:10.1360/032012-361 摘要 蛋白质翻译后脂修饰是指蛋白质在核糖体合成后与疏水脂质分子的共价结合.在已知共价化学修饰中,脂质分子独特的物理化学性质赋予了蛋白质特殊的结构和功能,并极大地影响蛋白质的膜锚定能力、转运和定位途径、信号转导以及蛋白质相互作用等.多样化的脂质结构和结合方式决定了脂修饰蛋白功能的复杂性,这些脂修饰蛋白与其他已知或未知修饰蛋白一起,在细胞多层次交叉调控信号转导通路中互相影响,协同作用,从而实现对生理 活动的精细调控.开展蛋白质翻译后脂修饰结构与功能分析是揭示微生物感染、免疫调节、肿瘤发生发展等机制的重要途径,对发现和筛选疾病标志物以及挖掘新型药物靶标具有重要意义.关键词 蛋白质 脂质 翻译后脂修饰 结构 功能 1 引言 真核细胞与原核细胞的显著结构区别在于其发达的膜系统.除质膜、核膜外,真核细胞的内膜系统将细胞质分隔成不同功能区域,形成具有不同膜结构的各种亚细胞器包括内质网、高尔基体、线粒体等,从而实现不同层次生化反应的时空调控,保证各种生理活动有条不紊地正常进行1.强疏水性脂质小分子与蛋白质的共价结合对真核细胞具有特别的意义,这种修饰明显增强蛋白质与膜的亲和性,因此其激活与去激活直接影响蛋白质在膜不同微区的锚定、不同亚细胞器之间的转运以及信号转导.脂修饰蛋白广泛存在于细胞不同区域,到目前为止,利用现代分析技术在细胞膜、细胞质、细胞核、细胞骨架,甚至胞外基质中均检测到了与脂质共价结合的蛋白27.脂质是广泛存在于生物体的一大类活性分子,主要包括脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂、孕烯醇酮脂、糖脂、多聚乙烯等八种类型8.不同结构的脂质以不同的方式参与细胞重要信号转导通路的调控,影响细胞中能量的转换和运输、信息的识别与传递、以及细胞的发育与分化等.尽管目前已经证实有 1000 多种结构各异的脂质存在于生物体中,但是其结合状态大部分未知.现有分析技术仅检测到了极少部分与蛋白质结合的脂质,其中脂肪酸、异戊烯类脂质、胆固醇以及糖基磷脂酰肌醇(GPI)是四类常见的可与蛋白共价结合的脂质分子9,表 1 和图 1 列出了这些脂质分子的结构、与蛋白质的结合方式、稳定性、修饰位点和修饰酶,这四种脂质分子与蛋白质的共价结合主要有 N,S,和 O三种连接方式.N连接主要发生在 N末端甘氨酸残基,这种脂修饰由特异性豆蔻转移酶(N-myristoyltransferase,NMT)催化完成,豆蔻酸、月桂酸以及其他具有相似 钟鸿英等:蛋白质翻译后脂修饰的结构和功能分析:靶向细胞脂信号 36 表表 1 典型蛋白质翻译后脂修饰 连接方式 共价键类型 脂质类型 修饰位点 修饰酶 N连接 稳定酰胺键(不可逆)脂肪酸(豆蔻酸、月桂酸等)N端甘氨酸 NMT N端半胱氨酸 Hhat GPI C端游离羧基 GPI-转氨酶 S连接 不稳定硫酯键(可逆)脂肪酸(棕榈酸、豆蔻酸、硬脂酸、花生四烯酸等)半胱氨酸 PATs 稳定硫醚键(不可逆)异戊烯类脂质(法尼烯、牻牛儿酰牻牛儿烯)FTase GGTase-I GGTase-II O连接 较稳定醚氧键(不可逆)脂肪酸(棕榈酸、油酸等)丝氨酸、苏氨酸 Porcn(MBOATs)胆固醇 C-端游离羧基 HHAT(MBOATs)图图 1 典型蛋白质翻译后脂修饰的结构特征.(a)N连接豆蔻修饰;(b)N连接棕榈化修饰;(c)N连接 GPI 修饰;(d)S连接棕榈化修饰;(e)S连接法尼基修饰;(f)S连接牻牛儿酰牻牛儿烯修饰;(g)O连接胆固醇修饰;(h)O连接棕榈油酸脂链长度的脂肪酸都可发生此类修饰10.N-豆蔻修饰是研究得相对较为清楚的一种翻译后脂修饰,大约 5%真核细胞蛋白在核糖体合成过程中会发生这种修饰.当新生蛋白的起始蛋氨酸在氨肽酶作用下被切除后,这些长链脂肪酸就与新生的甘氨酸末端氨基发生不可逆共价结合,形成稳定的酰胺键.棕榈酸中国科学:化学 2013 年 第 43 卷 第 1 期 37 也可在 Rasp 酶作用下以 N-连接方式与蛋白发生不可逆共价结合,已知可发生这类修饰的蛋白包括分泌信号蛋白Hedgehog11和Spitz12.另一种以N-连接方式与蛋白质结合的脂质是GPI13,其甘露糖磷酸基团上的乙醇胺基可与膜蛋白 C-端游离羧基发生不可逆共价结合,形成稳定酰胺键.许多细胞表面蛋白都是通过GPI锚定在细胞外膜,已知的GPI锚定蛋白包括细胞粘附分子、细胞表面受体和细胞表面水解酶等.与其他疏水性膜蛋白不同,GPI 锚定蛋白与富含胆固醇和鞘脂的脂筏区密切相关,对膜信号传导产生极大影响.GPI 与其他脂修饰也不同,它是迄今为止发现的唯一能独自将蛋白质锚定在膜上的脂质,而其他脂质如豆蔻酸、棕榈酸以及异戊烯类脂质等都不足以单独将蛋白质锚定在细胞膜,它们必须借助几种脂质的协同作用,或者蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-细胞膜相互作用才能使蛋白质与细胞膜稳定结合.S-连接是指脂质与半胱氨酸残基中SH 基团的共价结合,脂肪酸与SH 可发生可逆共价结合,生成不稳定的硫酯键,而异戊烯类脂质则与SH 发生不可逆共价结合,生成稳定的硫醚键.能够与半胱氨酸形成可逆硫酯键的脂肪酸包括棕榈酸14、豆蔻酸15、硬脂酸16和花生四烯酸17等,其中,以棕榈酸最为常见,因此这类翻译后脂修饰又称为棕榈化修饰.棕榈化修饰的分子酶学机制还很不清楚,到目前为止,相应的硫酯水解酶还没有被发现,但是已发现几十种棕榈转移酶(Palmitoyl acyltransferases,PATs)18,这些酶含共同保守氨基酸序列 Asp-His-His-Cys(DHHC),细胞内蛋白在其催化下发生可逆 S-棕榈化修饰.由于棕榈转移酶为膜结合蛋白,因此难以采用常规方法进行分离纯化.异戊烯类脂质主要包括法尼烯和牻牛儿酰牻牛儿烯,与之相关的酶分别被称为法尼基转移酶(Farnesyl transferase,FTase)19和牻牛儿酰牻 牛 儿 基 转 移 酶(Geranylgernayl transferase I/II,GGTase I/II)20,在这两种转移酶作用下,法尼烯或牻牛儿酰牻牛儿烯可与C末端或接近C末端的半胱氨酸残基中-SH 发生不可逆共价结合,形成稳定的硫醚键.发生异戊烯类脂修饰的蛋白其 C-末端一般含有 CAAX(Cys-aliphatic-aliphatic-X)保守氨基酸序列,其中 A 可为任意亲脂性氨基酸,而 X 氨基酸的种类可能与脂修饰类型有关.研究发现,蛋白质的异戊烯类脂修饰主要在细胞质中进行,而随后发生的 AAX切除和半胱氨酸残基的进一步修饰则可能与膜相关.O连接是脂质与丝氨酸或苏氨酸残基中OH 的不可逆共价结合,生成醚氧键,其稳定性介于酰胺键和硫醚键之间.这种脂修饰相对报道较少,已知饱和棕榈酸、不饱和棕榈油酸以及胆固醇均可在膜结合O 脂 转 移 酶(Membrane-Bound O-acyltransferases,MBOATs)2123作用下使一些分泌信号蛋白发生此类翻 译 后 脂 修 饰,比 如Wnt,Hedgehog(Hh)等.Porcupine 酶24是 MBOATs 中的一种,它与 O连接饱和棕榈化修饰或不饱和棕榈油酸修饰有关.Hh 脂转 移 酶(Hedgehog acyltransferase,HHAT)25是MBOATs家族的另一种O连接修饰酶,分泌蛋白Hh在生物合成过程中发生 C端自催化水解后,新生成的 C端可在 HHAT 作用下与胆固醇共价结合,这种修饰可增强蛋白与细胞膜上富含胆固醇的小窝区域的亲和性,并为 Hh 在膜的聚集和信号转导提供了一种可能途径.尽管如此,人们对蛋白质翻译后脂修饰的认识还非常有限,大部分脂修饰蛋白的结构和功能未知或知之不多,水解酶还一直没有被发现,不同类型脂转移酶虽有报道,但其酶活性产生的结构基础未知,而这个庞大的未知蛋白家族正以不同形式出现在细胞复杂的生理活动中,并向世人昭示着一个全新的研究领域.越来越多的实验数据和临床事实显示,脂修饰在微生物感染、免疫调控和肿瘤发生发展过程中起着重要作用,分析技术的不断发展是全面系统地解析脂修饰蛋白结构和功能的关键,并成为制约这一领域发展的首要技术难关.2 蛋白质翻译后脂修饰的分析方法 1951年Folch和Lee26首次发现蛋白质的翻译后脂修饰,但由于缺乏有效的分析手段,此后半个多世纪以来的相关研究进展缓慢.脂修饰蛋白具有三个特点:(1)低溶解度.可以预计,脂修饰主要发生在难溶于水的膜蛋白和膜相关蛋白,与强疏水性脂质的结合使其更加难溶于水,因此,常规用于水溶性蛋白鉴定及定量分析的方法不再适合于此类蛋白的分析;(2)低丰度.与蛋白质的磷酸化修饰和糖基化修饰相比,脂修饰没有特定的官能团,无法进行亲和富集,再加上其疏水特点,其准确定性、定量和定位分析难以进行;(3)可逆性.许多脂修饰具有动态可逆钟鸿英等:蛋白质翻译后脂修饰的结构和功能分析:靶向细胞脂信号 38 的特点,其激活或去激活状态直接与其生物功能相关,因此,用于脂修饰研究的分析方法要求很高,不仅要有快速响应的能力,而且还要能及时灵敏地监测细胞和组织中脂质的迁移和变化.在过去几十年里,放射性同位素标记曾是一种主要的研究手段,但是因其放射性危害和繁琐的操作步骤而逐渐放弃.目前主要有三种脂修饰分析方法(如图 1 所示),包括 ABE 法(Acyl-Biotinyl Exch-ange)2729、CR 法(Chemical Reporter)3032和 iFAT 法(Stable Isotope-Coded Fatty Acid Transmethylation)33,34.这三种方法与质谱技术联用,可实现脂修饰蛋白及修饰位点的鉴定、脂质的结构鉴定,以及不同细胞状态下脂修饰程度变化的定量分析,CR 法还可进行脂修饰蛋白的荧光成像分析,监测脂修饰的动态变化和脂修饰蛋白的周转变化.2.1 ABE 法的原理和分析流程 ABE 法是由 Drisdel 和 Green 发明的一种 in vitro分析方法2729,该法包括以下步骤:第一,N-乙基马来酰亚胺或其他能与巯基反应的试剂封闭蛋白的游离巯基;第二,羟胺选择性水解硫酯键;第三,利用巯基特异性的生物素试剂与新暴露的巯基结合;第四,利用链亲和素选择性富集并分离与生物素结合的蛋白.如果使用巯基特异性的 ICAT(Isotope-Coded Affinity Tag)试剂并结合质谱分析方法,不仅可鉴定脂修饰的蛋白和氨基酸修饰位点,还可定量分析不同样品中脂修饰蛋白的表达差异.2.2 CR 法的原理和分析流程 CR 法是新近发展的一种 in vivo 代谢标记法3032,能检测脂修饰激活或去激活的时空动态变化过程.在这种方法中,首先将具有叠氮基(azido)或炔基(alkynyl)的脂肪酸类似物加入细胞培养基中,由于这些脂肪酸与天然脂肪酸具有非常相似的结构,因此可对细胞中脂修饰蛋白进行 in vivo 代谢标记;其次,将培养的细胞收集并破碎后,利用叠氮基或炔基的反应活性,通过点击化学或 Staudinger 偶联反应使脂修饰蛋白与荧光基团或生物素结合;最后,脂修饰蛋白可进行直接荧光成像分析或用链亲和素富集分离.CR 法也可与质谱技术联用,进行脂修饰蛋白和修饰位点的鉴定.图图 2 蛋白质翻译后脂修饰的三种主要分析方法 2.3 iFAT 法的原理和分析流程 iFAT法是新近发展的一种in vitro稳定同位素标记质谱分析方法33,34,主要包括以下步骤:首先提取 细 胞 或 组织 蛋 白,并 进 行 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)分离;将对照组和样品组蛋白胶条切下,清洗除去非共价结合脂质并用丙酮脱水,然后分别与 d0-和 d3-甲醇进行超声辅助碱催化转酯化反应.超声波不仅促进异相反应的进行,而且使生成的 d0-和 d3-脂肪酸甲酯同步转移富集于正己烷相;最后合并 d0-和 d3-脂肪酸甲酯,采用气相色谱-质谱联用技术进行分离、鉴定和定量分析,对照组和样品组脂修饰程度的变化由 d0-和 d-标记碎片离子的强度变化来确定.利用酰胺键、氧(硫)醚键和硫酯键在碱性条件下的稳定性差异,iFAT 法可区分 N-,O-,S-不同脂修饰类型.此外,由于脂修饰蛋白通常发生在丰度较低的膜蛋白或膜相关蛋白,iFAT 法还发展了聚丙烯酰胺凝胶的Nile Red 荧光染色技术,提高了方法的检测灵敏度.结合现代质谱(Mass Spectrometry,MS)分析技术,ABE-MS、CR-MS 和 iFAT-MS 三种方法互补,前两者可实现脂修饰蛋白和修饰氨基酸位点的鉴定并能定量分析不同生理条件下脂修饰蛋白的变化,但是不能确定脂质结构.而 iFAT 法可鉴定脂质类型,并定量分析不同生理条件下与蛋白质共价结合的总脂质变化,但是 iFAT 法不能区分这种变化是由脂修饰程度变化引起的,还是由脂修饰蛋白的表达变化所引起.中国科学:化学 2013 年 第 43 卷 第 1 期 39 3 蛋白质翻译后脂修饰的功能分析 随着分析技术的不断发展,蛋白质翻译后脂修饰的功能也逐渐被认识.研究表明,脂质与蛋白质的共价结合对膜锚定、蛋白质转运、胞内定位、信号转导、蛋白质-蛋白质相互作用和酶活性等都有着重要作用.3.1 蛋白质翻译后脂修饰的“双信号假说(Two-Signal Hypothesis)”与膜锚定 在细胞信号转导中,几乎所有脂修饰蛋白都需与膜结合.由于脂肪酸、异戊烯类脂质和胆固醇都具有强疏水性,因此人们曾认为蛋白质与这些脂质的共价结合足以使被修饰的蛋白定位于细胞膜,然而热力学和动力学研究表明,单一豆蔻酸或异戊烯类脂质修饰均不能提供足够的能量使被修饰蛋白稳定地锚定于细胞膜磷脂双分子层.“双信号假说”提出,第二个信号单元的存在是稳定膜锚定的必要条件,这第二个信号可以是棕榈酸修饰单元,也可以是一个碱性氨基酸结构域,或是一个疏水结构域.“双信号假说”35,36最先描述的蛋白是 Ras,实验表明,异戊烯类脂质修饰的 H-Ras 和 N-Ras 只具有微弱的膜亲和性以维持与高尔基体膜的相互作用,在这种弱相互作用下,膜结合棕榈转移酶得以使CAAX 附近的半胱氨酸残基发生棕榈化修饰,从而促使 H-和 N-Ras 异构体离开高尔基体,并锚定于质膜,其中H-Ras先短暂定位于脂筏区后,在GTP作用下转移至非脂筏区.碱性氨基酸结构域是另一种第二信号单元.K-Ras 4B 与 H-和 N-Ras 不同之处在于其 N-端附近的碱性氨基酸结构域,生理条件下这些碱性氨基酸残基所携带的正电荷能与带负电荷的磷脂双分子层通过静电相互作用,因而有效增强与膜的亲和性37.Src 家族激酶和 G 各亚基在核糖体新合成后随即发生 N-豆蔻修饰,虽然含 14 个碳的疏水长链可插入疏水膜,但仅仅如此他们还不能稳定地锚定于质膜,正是因为其 N-端附近带正电荷的碱性氨基酸结构域与质膜的静电吸引以及疏水相互作用的协同影响,Src家族激酶和 G 各亚基才能与质膜亲和,进一步在棕榈转移酶作用下发生棕榈酰化修饰,从而稳定地锚定在质膜38.Src家族激酶Fyn与Lck相比,其7,9,13位点含有碱性赖氨酸残基,而 Lck 在 N-端缺乏这样的碱性氨基酸残基,实验测得 Fyn 比 Lck 具有更快更强的膜锚定能力.其他在脂修饰位点附近含有碱性 氨基酸结构域的蛋白还包括 GAP43、MARCKS、Retroviral Gag 以及 Lamin B3 等,这些蛋白都具有 N-豆蔻修饰或异戊烯类脂质修饰.脂修饰位点附近的疏水结构域也有助于提高蛋白的膜亲和性.eNOS(Endothelial nitric oxide synthases)是重要细胞信号分子NO的合成酶,其准确亚细胞定位对 NO 的产生至关重要39.具有催化活性的 eNOS 一般定位于内皮细胞的高尔基体和胞瞙小 窝,在 这 个 蛋 白 的 N-端 含 有 氨 基 酸 序 列 MGNLKSVAQEPGPPCGLGLGLGLGLCGKQGPA,其中 Gly2 为 N-豆蔻修饰位点,而 Cys15 和 Cys26 则为棕榈化修饰位点.值得注意的是存在于 Cys15 和Cys26 之间的五个重复 GL 片段,将疏水性亮氨酸 L定点突变为亲水性丝氨酸 S 后,eNOS 蛋白的膜定位能力几乎完全被破坏,在细胞膜上仅能检测到8%eNOS 蛋白活性.3.2 脂修饰蛋白的可逆膜结合能力及调控机制 研究表明,许多脂修饰蛋白与膜的结合都是动态可逆的.这种可逆性对 Ras 蛋白在质膜和高尔基体之间的循环比较容易理解,因为 S-棕榈化修饰是可逆的,所以质膜结合态 Ras蛋白可在硫酯水解酶作用下发生去脂化反应,并回到高尔基体.然而,其他通过酰胺键、硫醚键或醚氧键与蛋白质共价结合的脂质则难以这种方式从蛋白释放,因为这些化学键都比较稳定.这些不能发生去脂化反应的蛋白与细胞膜磷脂双分子层的可逆结合主要通过以下途径实现.3.2.1 豆蔻开关 N-豆蔻修饰蛋白与膜的可逆结合主要通过两种迥然不同的蛋白构象来实现.在其中一种构象中,长脂链暴露在外,可促进与膜的结合;而在另一种构象中,长脂链则被包埋于一个疏水空腔中,从而失去与膜的结合.脂修饰蛋白在这两种构象之间的转变由所谓“豆蔻开关”来实现,配体与蛋白的结合可触发脂质翻转,进而导致 N-豆蔻修饰蛋白从膜释放出来.许多蛋白与膜的可逆结合都受这种“豆蔻开关”调控,比如钙传感蛋白就是以这种机制来实现与膜的可逆结合,配体钙离子或钙调蛋白为“豆蔻开关”的激活剂40.钟鸿英等:蛋白质翻译后脂修饰的结构和功能分析:靶向细胞脂信号 40“豆蔻开关”的调控也可通过静电相互作用来实现,这种调控机制一般与蛋白质的磷酸化修饰协同作用.位于碱性氨基酸结构域中的磷酸化修饰引入带负电荷的磷酸基团,这些负电荷基团与携带正电荷的碱性氨基酸结构域相互作用,因而削弱脂修饰蛋白与膜的亲和性,MARCKS 正是通过这种机制从细胞膜释放41.3.2.2 法尼烯和牻牛儿酰牻牛儿烯开关 与法尼烯或牻牛儿酰牻牛儿烯共价结合的蛋白则通过另外一种不同的机制与膜发生可逆亲和.在没有外来配体的情况下,异戊烯类脂质单元可被脂修饰蛋白自身掩蔽,因此异戊烯类脂质也可像豆蔻开关一样调控蛋白与膜的可逆结合.小 GTP 酶如Rho 和Rab 的活性由这种“异戊烯类脂质开关”调控42,当位于 Rho GTPase 酶 C-端的异戊烯类脂质基团与RhoGDI 内部的疏水空腔结合,Rho(GDP)-RhoGDI 复合物则从细胞膜释放,回到细胞质中.Rab 蛋白 C-端的两个半胱氨酸残基均可被牻牛儿酰牻牛儿烯修饰,当其中一个牻牛儿酰牻牛儿烯插入RabGDI中狭长的疏水空腔时,蛋白质构象发生翻转,并将 Rab 从膜释放出来.与“豆蔻开关”相似的是,“异戊烯类脂质开关”也可与蛋白质的磷酸化修饰协同作用,并被静电相互作用激活.K-Ras 4B 是一个典型例子,PKC 激酶使Ser181 发生磷酸化修饰,从而使 K-Ras 4B 从膜脱落,转移至线粒体,并与 Bcl-XL 相互作用引发细胞凋 亡43.3.3 脂修饰蛋白的选择性膜定位及调控机制 不同亚细胞器具有不同的膜结构,而细胞膜又具有不同结构的功能微区,因此,信号蛋白的膜定位必须具有选择性才能接近目标蛋白,从而调控上下游生理活动.脂修饰蛋白在膜的选择性定位主要包括以下两种模式:3.3.1 “动力学捕获”膜定位模式“动力学捕获模式”最早用于解释 H-Ras、N-Ras、Src 家族激酶以及 G 亚基在质膜和高尔基体的定 位44.研究发现,单一豆蔻酸或异戊烯类脂质与蛋白质的共价结合并不能使其膜定位具有选择性,然而,当第二个脂修饰比如棕榈化修饰存在时,被脂修饰蛋白则可选择性定位于高尔基体或细胞膜.按照“动力学捕获定位模式”,强疏水性双脂链的存在极大地增强了脂修饰蛋白与膜的亲和性,因此大大降低了蛋白质从膜脱附的动力学速率,并将其牢牢地捕获并定位于细胞膜.可见,第二棕榈化修饰位置决定了蛋白质的选择性膜定位.3.3.2 双脂修饰蛋白在脂筏的选择性定位模式 脂筏是具有特殊功能的细胞膜微区,富含胆固醇、鞘糖脂以及磷脂,尽管其大小、形状和动态变化特征还非常不明确,但是目前已经清楚的是,信号蛋白与脂筏的选择性结合会增强蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用,并在特定信号转导中起着重要作用.比如,被饱和长脂链修饰的蛋白 SFKs 能与脂筏发生有效相互作用,但是被不饱和长脂链修饰的蛋白 SFKs 则表现出异常信号转导,这是因为顺式不饱和脂质形成了一个弯曲结构,不能有效插入脂筏微区45.3.4 脂修饰蛋白的转运 真核细胞中,蛋白质在位于内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)的核糖体上被合成后,不仅需要通过一系列翻译后修饰加工来赋予蛋白质完成特定功能所需的特定结构,而且还要转运到细胞不同功能区域,定位于具有不同膜结构的亚细胞器,才能最终完成特定的生理活动.3.4.1 ER 输出调控 ER 是细胞重要的质量控制场所,蛋白质在这里合成后,通过适当的修饰、折叠和组装后,再转运到不同亚细胞器.许多疾病的发生都与蛋白质,特别是膜蛋白在 ER 的异常输出有关.酵母几丁质合成酶 Chs3 是一种跨膜蛋白,它在细胞内的转运机制已被大量研究.几丁质在细胞膜的沉积受胞内蛋白转运严格调控,Chs3 在细胞内的含量通常比较稳定,当 BCL1-SLT2 信号通路被激活时,Chs3 即转运至细胞膜参与几丁质的合成.研究发现,Chs3 的棕榈化修饰是其从 ER 输出的必要条件,不能发生棕榈化修饰的 Chs3 突变体明显堆积于ER46.其他由脂修饰调控ER输出的蛋白还包括Wnt信号蛋白 LRP6、半胱氨酸字符串蛋白 CSP(Cysteine String Protein)等.值得注意的是,由于 S-棕榈化修饰中国科学:化学 2013 年 第 43 卷 第 1 期 41 大部分发生在膜上,因此被修饰蛋白在膜的锚定是其接近膜结合棕榈转移酶并发生 S-棕榈化修饰的前提条件.然而CSP并没有明显的这种膜锚定模体,它主要依靠一个包含 14 个半胱氨酸残基在内的疏水结构域与 ER 膜结合,并使半胱氨酸残基进一步发生棕榈化修饰,从而离开 ER47.CCR5(C-C Chemokine receptor type 5)是一种跨膜蛋白,属-趋化因子受体家族,主要表达于 T 细胞、巨噬细胞以及树突细胞,在感染引发的炎症反应中起着重要作用,许多 HIV 病毒变体均利用 CCR5进入并感染宿主细胞.研究证明,CCR5 在核糖体被合成后,其 C-端三个半胱氨酸残基的棕榈化修饰促使 CCR5 从核糖体转运并定位于细胞膜.将这三个半胱氨酸残基定点突变为丙氨酸后,缺乏棕榈化修饰的 CCR5 在内质网内异常扩散,失去从 ER 输出的能力,从而既不能偶联由趋化因子拮抗剂所激活的信号转导,也不能参与胞吞作用48.3.4.2 分泌通路和内吞运载途径的调控 脂修饰蛋白可以利用分泌通路转运至质膜,这些蛋白包括 Src 激酶家族 Lck 和 Lyn,以及 H-Ras和 N-Ras.Lck(Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)是免疫系统中淋巴细胞内的一种蛋白,它属于酪氨酸激酶 Src 家族,可催化淋巴细胞中信号转导相关蛋白的酪氨酸残基发生磷酸化修饰.Lck 蛋白的N-端氨基酸序列为 MGCGCSSHPEDDWMEN,当起始蛋氨酸 M 在氨肽酶作用下被切除后,N-端甘氨酸随即发生 N-豆蔻修饰,并且从 ER 转运至高尔基体.当相邻 5-和 3-半胱氨酸残基在高尔基体发生棕榈化修饰后,Lck 蛋白转运并定位于质膜,并诱导酪氨酸的磷酸化修饰.在 NIH-3T3 细胞中,将 5-半胱氨酸突变为赖氨酸后,因不能发生 5-氨基酸棕榈化修饰,结果导致Lck蛋白集聚在高尔基体,而不能有效转运定位于质膜49.非常相似的是,H-Ras 和 N-Ras 也是通过在高尔基体发生棕榈化修饰后,再转运至质膜50.研究发现,一些脂修饰蛋白的转运可不通过分泌 途 径,而 是 与 内 吞 运 载 途 径 的 内 体 有 关(Endosome).如前所述的小 GTP 酶,RhoB 主要以异戊烯类脂质修饰和牻牛儿酰牻牛儿烯修饰两种形式存在.其中,异戊烯类脂质修饰的 RhoB 定位于质膜,而牻牛儿酰牻牛儿烯修饰的 RhoB 则定位于次级内体;双牻牛儿酰牻牛儿烯修饰的Rab定位于内体,而单牻牛儿酰牻牛儿烯修饰的 Rab 则存在于 ER51.4 脂修饰蛋白与信号转导 信号转导是细胞针对外源信息所发生的应答反应.目前研究较多的信号转导分子主要包括蛋白激酶、磷酯酶以及 GTP 结合蛋白(或 G 蛋白)三类,它们是许多关键蛋白的活性开关,这些蛋白的激活/去激活分别控制不同的信号转导途径,共同实现不同层次细胞生理活动的精细时空调控.非常有趣的是,越来越多的实验事实表明,不仅这些已知信号转导分子发生大量翻译后脂修饰,在复杂信号转导网络中相互影响,协同作用,而且脂质与蛋白的共价结合在细胞信号转导还有以下独特作用:4.1 病态豆蔻修饰与细胞凋亡信号 因为蛋白质在核糖体被翻译合成并去除启动蛋氨酸后随即以新生成的 N-端与豆蔻酸共价结合,所以 N-豆蔻修饰一般被称为共翻译修饰(co-transl-ational modification).目前已经证实,有些蛋白比如促凋亡蛋白 BID 在细胞凋亡过程中可发生翻译后 N-豆蔻修饰5254,由于这种修饰使蛋白定位于线粒体并激活凋亡信号通路,诱发细胞凋亡,因此把这种N-豆蔻修饰叫做病态豆蔻修饰55.除 BID 外,其他与凋亡相关的蛋白如 actin,gelsolin,p21Pak2 等在凋亡过程中都可在半胱天冬酶作用下被剪切,使得新生成的 N-端甘氨酸与豆蔻酸共价结合56.4.2 脂修饰与免疫应答反应 T 细胞的激活在免疫应答反应中起着重要作用.研究表明,由 T 细胞受体(T-cell receptor,TCR)介导的信号通路与一系列关键蛋白的翻译后脂修饰有关,这些已知蛋白包括 CD4 和 CD8 受体、Src 激酶家族蛋白 Lck 和 Fyn,以及衔接蛋白 LAT.CD4 表达于 T细胞和巨噬细胞表面,在抗原识别过程中起着细胞粘附和信号传递的作用,它也是 HIV 病毒感染的受体分子.CD4 的棕榈化修饰虽然不影响 CD4-P56lck复合物的形成以及 HIV 感染,但是它改变 CD4 的横向扩散速度,并影响与 TCR 的相互作用57.CD8 的棕榈化修饰则促使CD8与脂筏区结合并与P56lck偶联,进而激活 T 细胞.衔接蛋白 LAT 的异常棕榈化修饰则导致T细胞无能,对抗原的再刺激失去发生增殖反钟鸿英等:蛋白质翻译后脂修饰的结构和功能分析:靶向细胞脂信号 42 应的能力,从而抑制免疫应答反应58.不仅如此,在与免疫相关的树突细胞中也检测到 150 多种功能各异的脂修饰蛋白.其中,IFITM3 属人干扰素诱导的跨膜蛋白,与免疫细胞信号转导和细胞粘附有关.研究发现,S-棕榈化修饰是IFITM3抗流感病毒能力的必要条件,它增强了蛋白在质膜的集聚59.4.3 脂修饰与分泌信号蛋白 分泌蛋白是指在核糖体上合成后,经内质网和高尔基体分泌到细胞外起作用的蛋白.分泌蛋白主要有三大类:Wnt、Hedgehog 以及上皮细胞生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)配体家族蛋白.这些蛋白在邻近细胞中诱发浓度依赖型响应,与疏水性脂质的共价结合直接影响这些蛋白在细胞外的浓差扩散运动和信号转导.4.3.1 棕榈化修饰是分泌 Wnt 的必要条件 研究发现,当缺乏棕榈化修饰位点或 MBOAT脂转移酶 Porcupine 时,Wnt 会集聚于合成细胞中,不能有效分泌到细胞外60.通过棕榈化修饰,Wnt 蛋白得以定位于高尔基体的脂筏微区,再转运至质膜.而不具有棕榈化修饰的 Wnt 蛋白因不能形成正确的构象,而滞留于内质网.值得注意的是,有一些蛋白的棕榈化修饰并不是其分泌的必要条件.比如,将Wnt3a 的棕榈化修饰位点进行定点突变,不能阻止其分泌,只能降低其活性,这就意味着 Wnt 蛋白的棕榈化修饰可能还有其他功能.棕榈化修饰对其他分泌蛋白 Hedgehog 和 EGFR配体 Spi 的影响则刚好相反,棕榈化修饰的发生降低这两个蛋白的分泌61.当这两种蛋白,特别是 Spi 蛋白的棕榈化修饰被抑制时,在细胞培养液中可提取到更多这两种蛋白.4.3.2 棕榈化修饰和胆固醇修饰是 Hedgehog 调控细胞间远程信号转导的必要条件 Hedgehog 家族蛋白可发生多种脂修饰,其相关信号转导通路是控制胚胎发育的经典途径,在细胞生长和分化中起着重要作用,其异常激活与肿瘤发生密切相关.成熟的 Hedgehog C-端与胆固醇共价结合,而 N-端半胱氨酸则在 Rasp 酶作用下形成 N-棕榈化修饰,这两种脂修饰在调控细胞-细胞间远程信号转导中起着重要作用62.Hedgehog 蛋白在细胞之间的转运是通过脂蛋白颗粒(Lipoprotein Particles)的运载来实现的,由于脂蛋白颗粒中富含胆固醇和甘油三酯等疏水成分,与 Hedgehog 蛋白共价结合的棕榈酸和胆固醇可通过疏水相互作用插入脂蛋白颗粒,从而使脂修饰蛋白随脂蛋白颗粒在细胞之间运动.4.3.3 棕榈化修饰是 EGFR 配体蛋白 Spi 调控短程信号转导的必要条件 EGFR 信号转导通路在细胞-细胞通讯中起着关键作用,它决定许多细胞命运,影响细胞的分化和增殖,与人类肿瘤的发生发展密切相关.EGFR 蛋白结构由三部分组成,即膜外区,跨膜区和胞内区,其中胞外区是伸出膜外与配体结合的氨基酸区域.在Drosophila 的四种 EGFR 配体蛋白(Spi、Grk、Vein以及 Km)中,Spi可在 Rasp酶作用下发生 N-棕榈化修饰,这种修饰是 EGFR 信号转导的必要条件63.在这种情况下,N-棕榈化修饰可降低 Spi 的扩散速度,促使其与质膜结合,使该蛋白在细胞间的分泌减少,结果造成局部 Spi 浓度升高,便于其有效地调控短程信号转导.4.4 脂修饰调控蛋白质-蛋白质相互作用和酶活性 疏水长链与蛋白质的结合不仅改变蛋白质构象,而且影响蛋白质与蛋白质复合物的形成和酶活性,异源三聚体 G 蛋白是证明脂修饰调控蛋白质相互作用的一个经典例子64.比如 亚基与 亚基的相互作用受亚基豆蔻修饰和亚基异戊烯类脂质修饰的协同影响,这两个亚基的相互作用是抑制腺苷酸环化酶活性的关键.此外,RGS(Regulators of G protein Signaling)是 多 功 能 GTP 酶 激 活 蛋 白(GTPase-Accelerating Proteins,GAP),在它的作用下可使 GTP被 G 蛋白 亚基水解,从而使 G 蛋白失活,并迅速关闭 G 蛋白偶联受体信号转导通路65.研究发现,RGS16 的棕榈化修饰修饰直接降低 GTP 酶激活蛋白GAP 的活性,达到调控其信号输出的目的.5 蛋白质翻译后脂修饰与人类重大疾病 如上所述,大量不同性质和功能的蛋白质都可发生与脂质共价结合的翻译后修饰,这些疏水脂质独特的物理化学性质成为调控蛋白质结构和功能的中国科学:化学 2013 年 第 43 卷 第 1 期 43 基础,并在人类疾病发生发展和控制中起着重要作用,可作为潜在疾病早期诊断标志物6669.5.1 病原生物的感染和控制 豆蔻酸、棕榈酸和异戊烯类脂质和蛋白质的结合与病原生物感染密切相关.其中,豆蔻修饰是 HIV-1病毒中 Gag 多聚蛋白与宿主细胞质膜结合的必要条件,当豆蔻修饰被抑制时,不能形成 HIV-1 病毒粒 子70.而其他一些病毒(Sindbis,Semliki Forest,SIV,Rous sarcoma 等)的被膜蛋白 Env 也可发生棕榈化修饰,这种修饰促进其与脂筏区的结合,并使病毒蛋白在此区域集聚和组装,是病毒复制的必要条件.除病毒组装与脂修饰有关外,棕榈化修饰在病毒进入宿主细胞过程中也起着一定作用.比如,在流感病毒感染过程中,血凝素 HA 诱发病毒膜与宿主内膜融合,而不具有脂修饰的血凝素 HA 则不能有效形成融合孔道71.N-豆蔻修饰也是许多真菌和寄生虫(Candida albicans,Trypanosoma brucei,Leishmania major 等)正常生长的必要条件72.尽管豆蔻转移酶在不同物种如人类、真菌和寄生虫之间具有较高的氨基酸序列保守性,但是研究发现,这些物种中豆蔻转移酶修饰底物的结合位点迥然不同73,这就为设计具有专一性的 N-豆蔻修饰抑制剂提供了结构基础.异戊烯类脂修饰主要包括含 15 个碳的法尼烯和含 20 个碳的牻牛儿酰牻牛儿烯与蛋白质的共价结合,许多原虫蛋白均发生此类修饰.目前已发现三种异戊烯类脂转移酶:(1)蛋白法尼烯转移酶(Protein Farnesyltransferase,PFT)74;(2)I 型蛋白牻牛儿酰牻牛儿烯转移酶(Protein Geranylgeranyltransferase type I,PGGT-I)75;(3)II 型蛋白牻牛儿酰牻牛儿烯转移酶(Protein Geranylgeranyltransferase type II,PGGT-II)76.PFT 能识别蛋白 C-端 CAAX 模体,并将法尼基转移至 C-端半胱氨酸残基.PGGT-I 与 PFT 具有相同的 亚基,当 CAAX 模体中 X 为 Leu 或 Phe 时,PGGT-I可催化牻牛儿酰牻牛儿烯与蛋白 C-端半胱氨酸残基的结合.PGGT-II 与前两者不同,它可催化双牻牛儿酰牻牛儿烯与具有 CC、CCXX 或 CXC 模体的蛋白共价结合.目前为止,已经开展针对这些脂转移酶的小分子抑制剂研究,并尝试用于寄生虫病的控制.5.2 肿瘤的发生发展和控制 Ras是第一个被鉴定的人类癌基因,属GTP结合蛋白,它通过 GTP 与 GDP 的相互转化来实现信息的传递.Ras 家族的三个成员 H-,N-,和 K-Ras 与人类15%恶性肿瘤的发生发展有关,其三种主要异构体均可发生法尼基修饰,这种修饰是 Ras与膜结合并诱导肿瘤生长的必要条件77.法尼烯转移酶抑制剂是目前研究较多的分子水平抗癌药物,然而,研究发现,这种抑制剂虽然能抑制多种人类癌细胞培养物的H-Ras 法尼基修饰及其与膜的亲和性,并阻断 MAP激酶和 PI3/Akt 信号通路,抑制癌细胞生长78,但是临床实验进展缓慢,没有明显的治疗效果,主要原因如下:(1)当 H-和 N-Ras 的法尼基修饰被抑制时,K-Ras可发生牻牛儿酰牻牛儿烯修饰,因此得以维持与膜的结合79.所以,目前研究重点又转向牻牛儿酰牻牛儿烯转移酶抑制剂,这种抑制剂预期可阻断 RalA 和RalB 的脂修饰,并诱导细胞凋亡,抑制癌细胞生长.(2)生物体中,多层次信号通路交叉调控.预测至少有 50100 种蛋白可发生法尼基修饰,但是只有很少一部分被鉴定,因此不能明确这些蛋白质之间的相互作用80.Src 激酶家族(SFKs)是又一个与肿瘤生长密切相关的蛋白,它被两个饱和脂肪酸(如豆蔻酸和棕榈酸,或两个均为棕榈酸)修饰后,可与脂筏区结合.在肿瘤细胞中,当SFK进入脂筏区后,会随即与一个棕榈化修饰的衔接蛋白 Cbp 结合,进而使 SFKs 的活性受到抑制.因此,如果 Cbp 过表达,则 C-Src 诱导的肿瘤生长将被抑制81.在肺癌细胞和大肠癌细胞中,可检测到 Cbp 表达水平下降或 C-