藻菌生物膜处理含镍废水及其胞外聚合物变化研究_任芸芸.pdf

第 3 期收稿日期：2021-12-08基金项目：陕西省职业技术教育学会科研规划课题（SZJYB19-288）；铜川市有突出贡献拔尖人才专项资金项目作者简介：任芸芸（1985-），女，河北枣强人，讲师，硕士，主要从事重金属废水的微生物植物联合修复的研究，（电话）13700292590（电子信箱）。第 62 卷第 3 期2023 年 3 月湖北农业科学Hubei Agricultural SciencesVol.62 No.3Mar.，2023任芸芸，张莎，裴挫萍，等.藻菌生物膜处理含镍废水及其胞外聚合物变化研究 J.湖北农业科学，2023，62（3）：135-140随着中国工业化的日益进步，由于资源开采及产业排放等原因，所造成的的环境污染也日益增加，其中最引人担忧的便是各种重金属污染1。而镍（Ni）作为重金属污染的八大元素之一，已经引起了各界广泛的关注2。由于镍被普遍应用于电子行业中，不仅导致制造业产生的镍污染严重，同时也伴随藻菌生物膜处理含镍废水及其胞外聚合物变化研究任芸芸1，张莎2，裴挫萍1，张志林1（1.铜川职业技术学院，陕西 铜川727031；2.陕西科技大学，西安710021）摘要：为探究藻菌生物膜处理含镍废水的可行性，对自然城市水体的藻菌富集挂膜得到藻菌生物膜，并在不同运行参数下对含镍溶液进行处理，研究镍的吸附量及藻菌生物膜胞外聚合物（EPS）含量在不同条件下的变化。结果表明，经富集挂膜的藻类属于绿藻门小球藻属，其对含镍废水有较高的处理效果，在pH为8、温度为35 时处理效果最佳；且能在3 d内达到镍吸附平衡，去除率达70%以上，同时，藻菌生物膜多聚糖含量随时间的变化与镍吸附量呈一定的正相关，证明其为镍吸附中的主要作用物质，而ATP含量则更能反映藻菌生物膜受胁迫的过程。藻菌生物膜在镍的胁迫下，胞外聚合物含量随胁迫程度升高而减少；从吸附量来看，其对镍的耐受值为10 mg/L，在此范围内，吸附量随镍浓度的升高而升高，最高达2.358 mg，继续升高镍浓度则吸附量明显下降。关键词：藻菌生物膜；胞外聚合物（EPS）；镍（Ni）；吸附量；去除率中图分类号：X703文献标识码：A文章编号：0439-8114（2023）03-0135-06DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2023.03.022开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Study on treatment of nickel-containing wastewater by alga-bacteria biofilm and changes ofthe extracellular polymeric substancesREN Yun-yun1，ZHANG Sha2，PEI Cuo-ping1，ZHANG Zhi-lin1（1.Tongchuan Vocational and Technical College，Tongchuan 727031，Shaanxi，China；2.Shaanxi University of Science and Technology，Xi an 710021，China）Abstract：To explore the feasibility of algal-bacteria biofilm s treatment for nickel-containing wastewater，alga-bacteria biofilm wasobtained by filming algae and bacteria enrichment in natural urban water，and nickel-containing solution was treated under differentoperating parameters to study the adsorption amount of nickel and the change of extracellular polymer substance（EPS）content of algalbacteria biofilm under different conditions.The results showed that the algas after enrichment and filming belonged to Chlorella，whichhad a higher treatment effect on nickel-containing wastewater.The treatment effect was best when pH was 8 and the temperature was35.Nickel adsorption equilibrium was reached within 3 days and the removal rate was more than 70%.At the same time，the contentof polysaccharides in alga-bacteria biofilm with time was positively correlated with nickel adsorption amount，which proved that it wasthe main substance in nickel adsorption，while ATP content could reflect the stress process of alga-bacteria biofilm.Under the stress ofnickel，the content of extracellular polymer substances in alga-bacteria biofilm decreased with the increase of stress.From the perspective of adsorption amount，its tolerance to nickel was 10 mg/L.Within this range，adsorption amount increased with the increase of thenickel concentration，up to 2.358 mg.However，adsorption amount decreased significantly when the nickel concentration continued toincrease.Key words：algae biofilm；extracellular polymer substance（EPS）；nickel（Ni）；adsorption amount；removal rate湖北农业科学2023 年镍矿开采对水体的污染3，这些镍污染物通过地表水流冲刷及地下水渗透等方式进入地球水循环，并最终在生物链的作用下超量累积于生物体内，并对生物体形成长期毒害作用4。因此，对镍污染水体的处理成为重金属修复领域的研究重点。通常使用的重金属污染水体修复方法包括生物法、化学法及物理法。生物修复法由于其本身环境友好性、无二次污染的优点而受到广泛关注5。其中，利用藻类修复重金属比植物修复具有繁殖快、回收方便及吸附量大等优点，因此在此领域被寄予厚望6，7。范彩彩8利用鼠尾藻（Sargassum thunbergii）对重金属 Pb2+、Cd2+、Cu2+及 Zn2+进行吸附，发现鼠尾藻对几种重金属都具有较好的吸附效果。Mata等9使用墨角藻（Fucus vesiculosus）对 Pb2+、Cu2+及 Cd2+进行吸附，发现其吸附能力表现为 Pb2+Cu2+Cd2+，且吸附能力主要来自于墨角藻细胞壁上的岩藻聚糖。马艳等10利用藻菌生物膜处理铅锌尾矿渣中的重金属，结果表明藻菌生物膜可以通过胞外聚合物（EPS）与重金属的络合来吸附重金属，其中对Pb2+的作用能力最强。以上研究已证明了藻类及藻菌生物膜对部分重金属的去除效果，但目前使用藻菌生物膜处理镍的报道仍较为鲜见。本研究拟利用城市自然水体，通过富集培养及挂膜制备藻菌生物膜，并对含镍溶液进行处理，以验证藻菌生物膜对镍的处理效果及其胞外聚合物的变化，以期对镍污染水体的生物修复提供一定的参考。1材料与方法1.1材料试验所用包含藻菌的水样取自西安市长乐公园芙蓉湖。液体培养基成分：每升培养基包含灭菌米汤水100 mL，Ca（NO3）24H2O 0.25 g，NaCl 0.3 g，MgSO47H2O 0.05 g，KH2PO40.05 g，ZnSO47H2O 0.05 g，NaHCO30.02 g，FeCl3、MnCl2、Na2MoOH2O、CuSO45H2O痕量。1.2处理设计背景重金属的浓度过高将对微生物产生较强的胁迫毒害作用，因此研究中普遍采用的重金属浓度为0.530.0 mg/L11，12。本试验中采用的镍浓度及运行参数根据需要具体设计如下。1.2.1pH 对镍处理效果的影响镍处理浓度为1 mg/L，温度为室温，pH设计为5、6、7、8、9共5个梯度，在运行后2 d取样，并测定镍浓度。1.2.2温度对镍处理效果的影响镍处理浓度为1 mg/L，pH 自然，温度设计为 25、30、35、40、45 共5个梯度，在运行后2 d取样，并测定镍浓度。1.2.3镍初始浓度对其处理效果的影响镍处理浓度设计为1、5、10、15、20 mg/L共5个梯度，pH自然，温度为室温，在运行后3 d取样，并测定镍浓度、多聚糖及ATP含量。1.2.4生物膜处理含镍废水随时间的变化镍处理浓度设计为8 mg/L，pH自然，温度为室温，在运行前取样，并在之后每隔1 d取样，测定镍浓度、多聚糖及ATP含量。并设置空白对照（不添加镍）。以上试验中每个处理设置3次重复。1.3试验设计1.3.1藻菌富集培养及挂膜取回一定量水样后，在容积为 20 L 的有机玻璃圆桶中进行培养。培养条件：自然光照下室温（夏季）培养，用空压机进行曝气，同时加入灭菌的液体培养基16 L用于培养生物膜，之后每10 d加1次培养基至原水位线。培养30 d后，用半软性填料挂膜15 d，得到藻菌生物膜备用。1.3.2藻类鉴别用压滴法13制作藻类的标本片，通过显微镜（CX41RF 型，奥林帕斯有限公司）放大1 000倍观察。载玻片经洗涤剂浸泡 24 h后用去离子水清洗再放入 15%的硝酸溶液中浸泡 24 h，重复2次后用去离子水洗净备用。为便于采集生物膜样品，每片填料上平行悬置2片预处理的载玻片。1.3.3镍处理试验根据处理设计，配制含镍溶液及调节相关参数。含镍溶液使用 NiCl26H2O（分析纯），配制浓度为1 000 mg/L的浓缩液，在500 mL培养所得菌液中加入相应量的浓缩液，得到不同镍初始浓度溶液。用 1 mol/L NaOH（分析纯）和 HCl（分析纯）调节 pH，采用精密 pH计（PHS-3C型，北京普析通用仪器有限公司）测定 pH，使用水浴加热锅调节运行温度。开始运行时每个处理组加入1片已挂膜且长势相似的藻菌生物膜。1.3.4镍浓度及胞外聚合物含量测定从反应器中取 100 mL 水样，并用镊子刮取载玻片上约 2 cm3生物膜，将二者一起放入离心机中6 000 r/min、20 条件下离心10 min，取上清液，测定水样中重金属离子含量，并将离心后的生物膜分成2份，分别称取重量并测定生物膜中多聚糖和ATP含量。镍浓度测定采用火焰法14，取100.0 mL水样放入 150 mL锥形烧杯中，加入硝酸 5 mL，在电热板上加热消解（不要沸腾），蒸发至 10 mL左右，再加入 5mL硝酸和2 mL高氯酸继续消解，至1 mL左右，取下冷却，并用水稀释至 100 mL标线，样品经过针头过滤器过滤后，用原子吸收光谱仪（AnaLyst 800型，珀金埃尔默仪器有限公司）测定镍浓度。取0.2%硝酸100 mL，按上述相同的程序操作，以此为空白样。136第 3 期多聚糖的测定根据苯酚-硫酸法测定15，将离心后的 1份生物膜放入 10 mL试管中，加入 1 mL去离子水并充分混合，加入质量分数为 5%的苯酚溶液 1 mL，摇匀后迅速加入 5 mL 质量分数为 95%的硫酸溶液，在黑暗中反应10 min，再振荡10 s。将试管置于 30 水浴 10 min 后，使用紫外分光光度计（Tu-1901 型，肇 庆 市 高 能 达 化 工 有 限 公 司）在490 nm处比色测定吸光度，并根据标准曲线得出多聚糖浓度。ATP的测定采用间接测定法16，即用含磷量测ATP。将离心后的1份生物膜加入装有1 mL去离子水的试管中，完全混合后加入 2.5 mL 95%的硫酸，然后盖上纱布，用绳扎紧，置于高压锅加压，温度128，15 min后取出，室温下冷却后，加12滴30%过氧化氢溶液，摇匀，用2 mL去离子水稀释，然后各试管加定磷试剂 3 mL，置于 45 水浴 25 min，取出冷却至室温，在紫外分光光度计上660 nm处比色测定，并根据标准曲线得出ATP浓度。1.4数据处理吸附量=（初始浓度-吸附后浓度）容量去除率=吸附量/初始总量100%利用 DPS 7.5 软件进行数据分析，采用 OriginPro 8.5软件作图。2结果与分析2.1藻菌生物膜的培养及鉴别藻菌富集及挂膜流程如图1a所示，随着富集时间的增加，水样逐渐转变为深绿色，藻类含量增加明显，随后在有机玻璃圆筒中用半软性填料挂膜，挂膜15 d后，水样颜色为黄绿色，挂膜 30 d后，水样呈深绿色，此时填料上已明显附着一层藻菌生物膜。填料挂膜过程如图1b所示，取有机玻璃圆筒中水样，显微镜下放大1 000倍，可观察到淡绿色、球形或椭圆形、单细胞或无一定细胞数目的群体，对比微生物的鉴别与图谱，此类微生物符合绿藻门小球藻属微生物的典型特征，是一种较为常见的可从溶液中吸附重金属的微生物。2.2处理参数对生物膜处理镍效果的影响藻菌生物膜在不同处理条件下对镍的处理效果如图2所示，3种参数中，pH对镍处理效果影响较为明显，而温度对镍处理效果影响较小，生物膜处理Ni2+的效果受Ni2+初始浓度影响明显。随着3种参数的升高，镍处理效果皆表现为先升高后降低的趋势。由图2a可以看出，当Ni2+初始浓度为1 mg/L、温度为35 的条件下处理1 d时，随着pH的升高，Ni2+的去除率增大；当 pH 为 8 时，Ni2+的去除率达到最大，为 38.07%，吸附量为 0.190 mg；当 pH 为 9 时，其去除率迅速下降到31.01%。当pH为68时，去除效果较好。由图2b可以看出，在Ni2+初始浓度为1 mg/L，pH为7的条件下处理1 d，随着温度的升高，去除率缓慢升高，并在温度为 35 时达到最高值，为36.43%，吸附量为0.182 mg，之后随着温度的升高而迅速降低。由图2c可以看出，处理2 d后，去除率随着Ni2+初始浓度的升高，由Ni2+初始浓度为1 mg/L时的71.26%下降至Ni2+初始浓度为20 mg/L时的5.62%；但吸附量却由 Ni2+初始浓度为 1 mg/L时的 0.356 mg升高至 Ni2+初始浓度为 10 mg/L时的 2.358 mg，并最终在Ni2+初始浓度为20 mg/L时下降至0.562 mg。2.3生物膜处理含镍废水的动力学拟合由图3可以看出，废水中镍含量持续减少，去除率持续增加。废水中镍浓度在反应器运行后1 d达4.879 mg/L，去除率达 39.01%；在运行后 3 d 基本达到稳定，镍浓度达 2.308 mg/L，去除率达 71.15%；在运行后 6 d 镍浓度降至最低，为 1.802 mg/L，去除率达最高，为77.48%。对藻菌生物膜处理含镍废水的过程进行动力学拟合，结果如图4所示，一级动力学模型和二级动力学模型都能较好地验证数据。动力学模型用方程式表示，如表1所示，一级动力学模型和二级动力学模（a）0 d15 d30 d富集培养软性填料挂膜挂膜15 d（b）图1藻菌生物膜富集培养（a）及挂膜过程中的显微特征（b）任芸芸等：藻菌生物膜处理含镍废水及其胞外聚合物变化研究137湖北农业科学2023 年型的回归系数（R2）分别为0.955 2和0.955 0，拟合效果较好。结果表明，藻菌生物膜在反应器运行后3 d能较高效地处理含镍废水。2.4含镍废水对生物膜胞外聚合物的影响由图5a可以看出，处理含镍废水的反应器中生物膜多聚糖含量比空白水样中高，空白水样中的多聚糖随时间的延长而稳步上升，而处理含镍废水的反应器中生物膜多聚糖含量从0 d的0.53 mg/（mLg）增加到 4 d 的 1.42 mg/（mLg）（最大值），并最终在6 d下降至0.87 mg/（mLg）。生物膜 ATP 的变化如图 5b 所示，与多聚糖不同，处理含镍废水的反应器中生物膜ATP含量总是低于空白水样，并在 24 h内从 2.81 mg/（mLg）急剧下降至 1.23 mg/（mLg），并最终上升，在 4 d 时达5.16 mg/（mLg），随后趋于稳定。不同镍初始浓度对藻菌生物膜胞外聚合物含量的影响如图 6 所示，随着镍初始浓度的增加，生物膜多聚糖含量和 ATP 含量都呈下降的趋势。分别 从 镍 初 始 浓 度 1 mg/L 时 的 1.20 mg/（mLg）和4.03 mg/（mLg），下降至镍初始浓度为20 mg/L时的0.56 mg/（mLg）和0.37 mg/（mLg）。纵观藻菌生物膜处理含镍废水中生物膜胞外聚合物含量的变化，整体而言，随处理含镍废水时间的延长，多聚糖含量和 ATP 含量都呈升高的趋势，而随着处理镍初始浓度的增加，二者都呈下降的趋势。3小结与讨论运行参数如pH、温度及离子浓度都会对藻菌生物膜处理重金属的效果造成明显的影响17。研究（a）0.20.10.0镍吸附量/mg56789pH50403020100去除率/%吸附量去除率（b）0.20.10.0镍吸附量/mg2530354045温度/50403020100去除率/%吸附量去除率2.82.42.01.61.20.80.40.0镍吸附量/mg15101520初始浓度/mg/L806040200去除率/%吸附量去除率（c）图2不同pH（a）、温度（b）、Ni2+初始浓度（c）对镍处理效果的影响1086420镍浓度/mg/L01234567时间/d100806040200去除率/%镍浓度去除率图3含镍废水浓度及去除率随时间的变化43210镍吸附量/mg01234567时间/d吸附量一级动力学拟合曲线二级动力学拟合曲线图4生物膜处理含镍废水的动力学拟合表1生物膜处理含镍废水的动力学拟合及其参数模型一级动力学二级动力学模型方程式log(qe-qt)=logqe-k1t2.303tqt=1k2q2e+tqe参数qe/mg3.251 74.222 3K1.194 70.116 8R20.955 20.955 0138第 3 期表明，藻类细胞表面的自由位点数量是由 pH 控制的18，同时，对于胞外聚合物，强酸性和强碱性条件都会抑制其对重金属的处理效果19。当pH升高至8时，镍处理效果上升至最高，并随着 pH 进一步升高而明显下降。这主要是由于当溶液pH为酸性时，溶液中的 H+与带正电的镍离子对目标位点产生竞争吸附，不利于水中镍离子的去除；而且由于细胞壁上的羧基、磷酸基团、羟基、胺基等表面官能团在pH较小时是质子化的20，与镍离子静电相斥，不利于水中镍离子的去除；且酸性条件也不利于藻类正常生存代谢21。当 pH 增大时，减弱了 H+的竞争及官能团与镍离子的静电斥力，有利于藻类正常代谢及对水中镍离子的去除。当pH过高时，藻类死亡率升高，将减少胞外多聚物的释放，削弱对镍的处理效果。温度是影响微生物生长的重要因素之一22，在处理含镍废水过程中，温度为 2535 时去除率较高，其随温度变化波动不大，最适温度为35 左右，这是因为在此温度区间，微生物能较好地生长代谢，且由于重金属吸附属于放热反应23，所以随温度的升高去除率有微小的上升。但当温度过高时，藻菌生物膜代谢生长会受到严重影响，此时这种影响在整个作用系统中占据负面的主导地位，处理重金属的效果将明显减弱。重金属初始浓度不仅主导着生物膜的吸附量、去除率，同时也明显影响微生物的生长代谢24。随着镍初始浓度的升高，生物膜吸附量先升高后下降，吸附量的升高是由于溶液中离子总量增加导致的富集增加，而随后的减小则主要是由于过量的镍离子已经对藻菌生物膜产生了明显的毒害作用。在较高的重金属背景下，藻类生物活性降低，死亡率上升，同时藻菌共生体分泌的胞外聚合物减少，影响去除效率25，不同镍浓度下的胞外聚合物含量变化也证明了这一点；同时，在DLVO理论中，当离子浓度过高时，则会出现抗凝聚作用，也会导致吸附能力降低26。在动力学研究中，除了发现藻菌生物膜表现出在3 d左右达到吸附平衡外，藻菌生物膜的胞外聚合物含量变化更能体现生物膜对镍胁迫的响应。与空白水样相比，由于镍离子的刺激，生物膜分泌出更多的多聚糖，而随着时间的变化，生物膜中多聚糖在运行后4 d达到最大值，而后开始缓慢下降，一方面说明由于镍离子的刺激使得生物膜分泌更多的多聚糖等胞外聚合物以保护细胞在不利环境下的活性，大量微生物及植物都具备这样的响应机制27；另一方面，生物膜分泌的多聚糖含量与镍的去除率呈正相关，这可能的原因是多聚糖中的羟基等官能团能够直接结合水中的重金属离子28，因此多聚糖在镍去除中扮演着重要角色。含镍水样中生物膜 ATP 含量整体比空白水样小，这是由于镍对微生物有一定的毒害作用，在加入镍离子24 h内，ATP含量明显减少，随后由于生物膜分泌的胞外聚合物又提供了能缓冲重金属毒性的微环境，导致生物膜微生物增多，活性增强，ATP含量逐渐升高。由于微生物修复处理重金属污染所具备的独特优势，其已逐渐成为污染修复领域的研究热点。本研究结果表明，通过城市湖水水样中藻类的富集挂膜得到藻菌生物膜，其对含镍废水具有良好的处理1.61.41.21.00.80.60.40.20.0生物膜多聚糖含量/mg/（mLg）0123456时间/d空白水样中含镍水样中（a）（b）1086420生物膜ATP含量/mg/（mLg）0123456时间/d空白水样中含镍水样中图5含镍废水对生物膜多聚糖含量（a）、ATP含量（b）随时间变化的影响4.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0生物膜胞外聚合物含量/mg/（mLg）15101520初始浓度/mg/L多聚糖含量ATP含量图6不同镍初始浓度对生物膜胞外聚合物含量的影响任芸芸等：藻菌生物膜处理含镍废水及其胞外聚合物变化研究139湖北农业科学2023 年效果。通过不同处理参数下的运行，得出在 pH 为8、温度为 35 左右时对镍的去除效果较好，可在3 d 左右达到吸附平衡，且生物膜对镍的耐受值为10 mg/L。同时通过研究胞外聚合物含量的变化，镍离子去除率在4 d时基本达到最高，多聚糖含量也在4 d时达到最高，结合镍离子去除率和多聚糖含量随处理时间的变化，可以得出二者呈一定程度的正相关关系。本研究证明了藻菌生物膜在重金属处理中的应用价值。参考文献：1周建军，周 桔，冯仁国.我国土壤重金属污染现状及治理战略 J.中国科学院院刊，2014，29（3）：315-320，350，272.2王丙烁，黄益宗，王农，等.镍污染土壤修复技术研究进展 J.农业环境科学学报，2018，37（11）：2392-2402.3陈远.遵义钼镍矿下游水体污染及生物毒性研究 J.科技创新与应用，2012（23）：121-122.4SALT D E，BLAYLOCK M，KUMAR N P，et al.Phytoremediation：A novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants 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