来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达.pdf

!卷 期!#$年%月生物工程学报!#$%&%()*$+,(-.#(/%0$(,(12&()!*)!+,(-!#$./0/12/3：+45,46-7$，!#$；800/9:/3：;460$，!#$)=?6?4,996:/3 A-B645:C6D EF G:/D 8B610,(:,64(H/946:D/5:C I95315B 4,:6)=/(：F$L7#L$FE7EFM；NLD41(：-45BO5BP1QD41()54541)/3,)05)农业部 EF 项目资助（*)!#JKFF）。来源于!#$%$%&(&#)$&的耐高温!淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达#$%&()*)+,-&.&*&/)0(*1+)%2 3-&%4),256&!24762&+%)4!#$%$%&(&#)$&(*+,-./$.$0-#1)0+-#/2)/-6)%)$62,杨宗岐7，!，李轶女!，张志芳!，王勇7，沈桂芳!R8*S K5BLT17，!，UG R1L*V!，KW8*S K1LX45B!，Y8*S R5B7453 ZWN*S,1LX45B!7 南开大学生命科学学院，天津J#%7!中国农业科学院生物技术研究所，北京7#F77!(,%1%(-3#-%40#%$0%&，5+$6+#7$#8%*&#/2，9#+$:#$J#%7，!#$+!.#(/%0$(,(12;%&%+*0%?2(-=1*#0),/)*+,40#%$0%&，.%#:#$1 7#F7，!#$+摘要来源于 2*(0(00)&-)*#(&)&的耐高温!L淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶，在植物中表达耐高温!L淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段 0,AL/*$3LA%/.L0,3L*A,!JL*A,!和壮观霉素抗性基因，构建了来源于 2*(0(00)&-)*#(&)&的耐高温!L淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体 9$8。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中，经壮观霉素抗性（7#DBU）筛选，获得了 E 个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后，经 I.、Z,:/65 A(:检测分析及暗培养，证实耐高温!L淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明，转基因衣藻表达产物具有耐高温!L淀粉酶活性，每克鲜重衣藻最高达%M,。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。关键词2*(0(00)&-)*#(&)&，耐高温!L淀粉酶，叶绿体表达，衣藻中图分类号T%F$文献标识码8文章编号 7#LJ#$7（!#$）#L#MML#M85,%29,=:4A(/!L4D-(4/C6D 2*(0(00)&-)*#()&1 45 1D96:45:153,:614(/5O-D/15 A6/?15B 453 4(015 C:/:4A(/!L4D-(4/15 9(45:045 6/3,0/B6/4:(-0:15:/963,0:15 C 4(015B 069 9(45:)80:/96/15 2/0:6，9$8，05:41515B:/:4A(/!L4D-(4/B/5/C6D 2*(0(00)&-)*#()&，?4 05:6,0:/3?1:!,+?2(?($+&*%#$+*/#9(4:13 6/0DA1545:C64BD/5:453 90:15D-015L6/1:45:+=B/5/4/(/0:D46/6)=D13 9$8?4:645C/66/3 15:/0:B/5D/C!)*%#$+*/#A-:10 D/:C6D/3(15/?/6/A:415/3 A-7#DBU 9/0:15D-015/(/0:15)I.4D9(1C104:15，Z,:1 C:B/5/453 0,(:124:15 15:?/3:4:/B/5/43 A/5 15:/B64:/3 15:0:B/5D/C!)*%#$+*/#)=/96/3 15:/0:C!)*%#$+*/#?4 3/:/0:/3 A-4D-(4/40:121:-44-453 C,53:A/4 1B%M,B C6/?/1B)=/9/61D/5:4(6/,(:3/D5:64:/3:1A1(1:-C,15B:645B/510 0:C 9(45:4 A16/40:6 C6 963,0:15 C 153,:614(/5O-D/):&7;)%02*(0(00)&-)*#(&)&，:4A(/!L4D-(4/，0:/96/15，!,+?2(?($+&*%#$+*/#耐高温!淀粉酶是目前工业上用量最多的酶之一，广泛应用于食品、制药、酿造、发酵及纺织工业中的淀粉加工。来源于嗜热古细菌!#$%$%&(&#)$&的胞外!淀粉酶以其优异的耐热性能而受到关注。该酶具有很高的热稳定性，活性不依赖于钙离子，最适的反应活性在高温下实现，且半寿期长。此外，高温下酶促反应可减少杂菌的污染机会；反应不需用冷却水，可节约能源；淀粉粘稠度的降低能减少输送时的动力消耗。近十几年来，随着利用植物非食品部分如玉米、水稻和小麦的秸秆，甘蔗废料等发酵生产能源燃料乙醇技术的发展和应用，耐高温!淀粉酶的市场需求越来越大。但是，由于在乙醇生产过程中需要加入大量的酶制剂，所以生产成本较高。用植物秸秆等废弃物生产乙醇虽然使生产成本大大降低，但耐高温酶的用量大增#。因此，利用植物转基因技术将耐高温!淀粉酶基因导入植物中，使其在植物中表达，可避免在秸秆发酵过程中加入外源耐高温!淀粉酶，达到进一步降低生产成本的目的。叶绿体遗传转化是近#$年发展起来的一种新的植物基因工程技术，与传统的核转化相比其具有超量表达目的基因；以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默；具原核表达方式，能以多顺反子的形式表达多个基因；母系遗传方式可防止基因扩散以及基因产物区域化等优点，已成为目前植物生物反应器研究热点之一%。本研究将来源于嗜热火球菌!#$%$%&(&#)$&的耐高温!淀粉酶*+基因成功地导入叶绿体转化模式植物衣藻叶绿体中使其表达，表达产物具有耐高温!淀粉酶活性。!材料和方法!材料!植 物 材 料：野 生 型 衣 藻（,-.*+/$+$0*#1)0-*#/2)%&）来 自()*+*,*,-)./，(01234.52)/.67，(0)8-9:#&$;，培养方法参见文献?中 克 隆 有 嗜 热 火 球 菌!#$%$%&(&#)$&的高温!淀粉酶*+基因（由中国农科院生物技术研究所张志芳研究员惠赠）。质粒-6A 和;-6A 上克隆有衣藻叶绿体*245 基因=B端启动子、#6%7 基因%B端终止子和一组多克隆位点，;(上 克隆有衣藻叶绿体特异表达的*/5 表达盒及同源片段%.4!2#07!4128!%-.7!#4.#%!#4.#，其 中 缺 失%-.7 结 构 基 因 约C$1D，并在%-.7=B和%-.7%B之间引入多克隆位点3%$E F、8*+,、9*%、5:#、8+。!$工具酶及分子生物学试剂：各种限制酶、!(&(:?聚合酶、G24HI 酶、J 为 GH4J2O8 公司产品，NE 引物由上海生工生物工程有限公司合成，(:?序列测定由上海基康生物技术有限公司完成，引物标记试剂盒购自美国 N)H92L-公司，同位素（!%#!N!M?JN）购自北京亚辉生物工程公司。!#方法!#!质粒提取、(:?片段克隆、重组质粒鉴定：参照 P-9D)HH1 等=分子克隆方法。!#基因枪转化：采用美国 QRS!E?(公司 KHM2GN(P!$T,2 Q.HG./6.O-)6.OG2 M2G.52)7/7/629 转化衣藻。参数为：真空度#U.4O82/汞柱、轰击距离 VO9、氦气压力$/.、金粉颗粒直径 C$9。!#$衣藻(:?的提取，参阅文献;。!#%衣藻蛋白质提取，参阅文献&，U。!#&引物：根据*+基因序列设计一对特异引物：N：=B!J?W?WJ?WJ?WJW?W!%B，N#：=B!?J?WW?WJ?J?WJ?W!%B。为研究衣藻叶绿体转化子的同质化程度而设计的 O8GX=B下游、O8GX%B上 游 引 物：N%：=B!WWJJJWW?JWJJJJJ?JJJW!%B，N,C=的条件下，每分钟!淀粉酶分解可溶性淀粉产生$9HG 还原糖（以麦芽糖含量计）所需的酶量为一个活性单位。活性测定缓冲液为#$99HGTX 乙酸钠，=99HGTX-G#和 99HGTX KLPS,C=。底物是用测定缓冲液溶解的浓度为 Z（;T-6A 用=%$酶切，用 K04L D2-4 核酸酶削平该位点以去除起始密码子?JW，连接后得到;$&#0*.$(8)$21%-0$.$?生物工程学报#$;，FHGC#，:HC质粒!#!$；将质粒!%&用!#!和$%&双酶切，用&()*+大片段酶补平$%&位点，电泳回收,-./0 的耐高温#1淀粉酶基因片段，将其克隆于质粒!#!$的!()2和*+(（补平）位点之间，得到中间载体!$%，使耐高温#1淀粉酶基因置于衣藻叶绿体基因特异启动子 34(,-.和终止子 54/+%0 调控之下；再用$%&6和 1&,双酶切!$%，并补平1&,位点，回收含有()2 基因的 78%片段，将其克隆入质粒!9.7 的$%&:位点，构建成耐高温#1 淀粉酶基因衣藻叶绿体表达载体!9.%（图,）。图,衣藻叶绿体转化质粒!9.%构建示意图;,?*)#ABC#/4567(/8,55 CE*A*!#A)D*AF#*)!F 2;：E*F*=*B DA=F()#!衣藻叶绿体的转化及转基因衣藻的获得用包裹有质粒!9.%的金粉子弹轰击野生型衣藻受体细胞，过渡培养后涂布于抗性筛选 H%I 培养基上（含壮观霉素 J!C,KK$=LFM），N3O，5KKKP 的连续光照条件下培养。Q R,KG 后平板上出现绿色的单藻落，而空载金粉轰击的野生型衣藻细胞在抗性筛选 H%I 培养基（含壮观霉素 J!C,KK$=LFM）上则完全白化死亡。这些绿色抗性单藻落能在二次继代筛选的抗性选择培养基中正常生长，这初步表明高温#1淀粉酶基因和(8.基因可能通过同源重组整合到衣藻叶绿体基因组中。本实验共轰击 S 枪，得到T 个抗性衣藻单藻落。!#转基因衣藻的$%&检测抗性衣藻经过 9 轮抗性继代筛选后，提取衣藻78%。用耐高温#1淀粉酶基因的一对特异引物 I,和 IN 进行 I?6 检测，同时以质粒!9.%为阳性对照。扩增结果（图 N）显示以抗性衣藻 78%为模板能扩增出,-./0 的片段，而以野生型衣藻 78%为模板，则没有扩增出相应的片段。图 N衣藻叶绿体转化子()2 基因的 I?6 分析;NI?6)U/4567(/8,55#A)D*AF)#*D()2=()(,：,-K/0 78%FA/(A（IA*F(=）；N：#E(+G#U!(；5：!9.%#E(!*#/4567(/8,55#A)D*AF)#!转基因衣藻同质化程度的$%&扩增分析尽管衣藻细胞内只有一个叶绿体，但是这个叶绿体却含有 SK R,KK 个叶绿体基因组拷贝，因此同时转化这么多基因组是不可能的。在叶绿体转化的初期，只有少数叶绿体基因组拷贝整合了外源基因，所以 最 初 的 叶 绿 体 转 化 细 胞 是 一 种 异 质 体（E(#(A*!FC），含有野生型和转化型两种叶绿体基因组拷贝，需要进一步提高外源基因在衣藻叶绿体基因组中的同质化程度。为了检验外源基因是否定点整合入衣藻叶绿体基因组%7#0 基因之间及外源基因在衣藻叶绿体基因组中的同质化程度，以衣藻转化子和野生型衣藻78%为模板，I5 和 I.为引物，进行 I?6 扩增分析，Q.3杨宗岐等：来源于 92/&%&%:;:/5&;:;的耐高温#1淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达结果如图!所示。当以野生型衣藻#$为模板，用上述同源片段引物进行%&扩增时，应扩增出一条()*+,的条带（图!$）。完全同质化的衣藻转化子（转基因叶绿体基因组拷贝完全取代野生型叶绿体基因组），应只扩增出一条-).+,的#$条带（图!/）。扩增结果如图!&显示，经过六轮次壮观霉素筛选后，衣藻叶绿体转化子的%&扩增产物中没有()*+,的条带，-).+,的条带非常清晰，而野生型衣藻则仅扩增出()*+,的条带，说明此时的衣藻叶绿体转化子中，转基因叶绿体基因组拷贝已完全取代了野生型叶绿体，衣藻叶绿体转化子同质化程度已经很高。图!衣藻叶绿体转化子的同质化程度%&分析0123!%&45467818 9:;=2?=9:992=5=1;79:!3#$%&()$;?458:9?45;8$：AB142?4 9:4C61:1B4;195 D8152#$9:;=*$+(),-#!3#$%&()$B69?9C648;；/：AB142?49:BDB;8,7424?98=2=6=6=B;?9C9?=8183(：()*+,#$4?+=?8（%?9=24）；E：;7C=；G45=!：C.-$48;=C981;1H=B95;?96；-I.：!3#$%&()$;?458:9?45;615=83!#转基因衣藻的$%&()*+,-%检测为了进一步确定外源基因在衣藻叶绿体基因组中的整合情况，本实验以()-+,的耐高温!J淀粉酶基因为探针，与上述鉴定转化子和野生型衣藻同质化程度的%&产物进行杂交，同时以质粒 C.-$为阳性对照。A9D;=?5,69;分析结果表明，衣藻转化子均能杂交出一条-).+,的条带，与阳性对照的杂交条带大小一致，而野生型衣藻没有出现杂交条带，如图-所示，证明了%&扩增出的-).+,条带含有外源目的基因片段，同时也证明了外源耐高温!J淀粉酶基因确实整合到叶绿体基因组中。图-以()-+,的.,基因为探针的%&JA9D;=?5 分析0123-A9D;=?5,69;152 45467818 9:;DB;8C?9,=F1;.,2=5=3(：%981;1H=B95;?96；E：;7C=；!I K：!3#$%&()$;?458:9?45;615=83!.转基因衣藻!/淀粉酶活性的测定采用 A99271J#=6895L方法，用经过.轮抗性筛选的衣藻转化子的总蛋白提取液测定!J淀粉酶活性，结果（图 K）表明，测定的!株衣藻转化子均表现出较高的!J淀粉酶活性，其中最高的酶活力为MM)KDN2 鲜重衣藻。图 K衣藻转基因植株!J淀粉酶活性分析0123K$5467818 9:?=B9,1545;!J47648=4B;1H1;1=89:!3#$%&()$;?458:9?45;615=8!0转基因衣藻的表型分析野生型衣藻与其它一些植物不同，能在黑暗中合成光非依赖性叶绿素（612=C=5=5;B69?9C766）而呈现绿色，这是因为野生型衣藻能产生光非依赖性 的 原 叶 绿 素 酸 酯 还 原 酶（612=C=5=5;C?9;9B69?9C=?=DB;48=），它由/&+0、/&+1、/&+2 三种基因编码，其中任一基因的缺失，将导致衣藻在黑暗中生长时呈现黄绿色。将野生型衣藻和转化子在平皿上划线暗培养，(*后，显示出转基因衣藻为黄绿色，而野生型衣藻为绿色（图.），说明转基因衣藻的叶绿体#$中大部分/&+0 结构基因已被外源基因表达盒所取代。同时，也证明通过同源重组置换某些功能基因及表型分析是研究植物叶绿体分子结构和功能的有效途径。L-K!&$%#3#456%+57 2$5)#/&%5+58,生物工程学报E*.，O96)EE，#9)-图!暗培养转基因衣藻表型分析#$%!&()*+,-(*.+/0)1.*/20)+1（3）0)4 5#64+,-(（7）8)4(/40/9$/*5+:*)4#+#*)1!讨论目前国内外耐高温淀粉酶均用微生物工程表达系统生产。植物叶绿体表达系统是近十几年来发展起来的一种新的高效表达系统，其具有表达量高、表达具有原核性、定点整合、生物安全性高及生产成本低等优点使其成为植物基因工程领域的研究热点。到目前为止，国内外尚未见到用植物叶绿体表达高温淀粉酶和其他工程酶的报道。本研究将来源于嗜热火球菌!#$%$%&(&#)$&的!;淀粉酶基因导入叶绿体转化模式植物 衣藻叶绿体中并获得表达，为在叶绿体中表达工程酶进行了一些有意义的探索。虽然在筛选到的衣藻转化子中，淀粉酶的活性可达 8?$鲜重衣藻，但表达量与微生物表达系统相比还是比较低的。因此，对于这种性质特殊的极端酶，如何进一步提高其在叶绿体表达系统中的表达量，还有待于进一步的研究。叶绿体起源于原核生物蓝细菌，遗传表达具有原核性A，其基因组基因的排列方式、调控方式、BC 碱基对含量及翻译所偏爱的密码子与原核生物相接近，可以直接表达来自原核生物的基因，无需进行繁琐的密码子优化改造。但高温!;淀粉酶基因来源于极端高温菌!#$%$%&(&#)$&，其基因组的组成及翻译密码子的偏爱性与普通原核生物不同，3D 含量为I*+,-和终止调节序列 FI#.%/调控耐高温!;淀粉酶基因的表达，保证了外源基因的表达，但为了进一步提高外源基因的表达量，很有必要继续克隆和改造能在叶绿体中执行功能的强启动子和合适的终止子。叶绿体遗传转化不同于核转化，是通过一对与叶绿体基因组同源的 JK3 序列将外源基因定点整合到叶绿体基因组中，不存在核转化的位置效应，但整合位点在叶绿体基因组中的选择也影响外源基因的表达，即不同插入位点对转化频率和表达效率也有影响，当然这是以整合位点的选择和外源基因的插入不破坏叶绿体本身基因结构为前提的。因此通过对叶绿体转化载体的优化和改造，可以进一步提高外源基因在叶绿体中的表达量。#$#%&#（参考文献）L+()MN/$()1()，C*)1+0)+#)O P*/$#01，B0/0Q(4 3)+/0)#9#0)%C6*)#)$，1(R8():#)$，:0/0:+(/#S0+#*)，0)4(T-/(11#*)*.0)(T+/0:(66860/0;02,601(./*2+(,-(/+(/2*-#6#:0/:0(*)!#$%$%&(&#)$&#)0%12#)%1)*%$3)0)4 4*%)33&.+)3)%5126$&#7*3$(4)$3$8)%*3 912:)+#，UU V!FWH H C60#/(P#(#66(，B/($*/,M，X(#981%Y,-(/+(/2*-#6#:()S,2(1：1*8/:(1，81(1，0)4 2*6(:860/2(:0)#121.*/+(/2*1+0Q#6#+,%;)%#$.)$3$8*7)2?，Z0/%HAA，-%VWF F J0)#(66 Y，0)ZL，366#1*)%Z#6(1+*)(1#):6*/*-601+$()(+#:()$#)(/#)$：0)()#/*)2()+066,./#()46,(/0#)Q#*+(:)*6*$,%5#27!3*7+%)，HAAH，)（H）：GW V U W Y0/#1O%D(913*:$:$7*1*8/:(Q*9，0:*2-/()1#($8#4(+*Q#*6*$,0)4 60Q*/0+*/,81(%*7 A)28$：-%*L02Q/*9 M，/#+1:O，Z0)#0+#1 D%Z*6(:860/C6*)#)$：360Q*/0+*/,Z0)806 Z%C*64 L-/#)$Y0/Q*/0Q*/0+*/,&/(11，UGU!*:0#T MJ，Z0,.#(64 L，B*641:2#4+;C6(/2*)+M，O/#:91*)M%Z*6(:860/Q#*6*$,*.913*:F V H B*641:2#+1;C6(/2*)+Z%D/0)1$()#:(T-/(11#*)*.02#)*$6,;:*1#4(04()#)(+/0)1.(/01(#)+(:6*/*-601+：3 1(6(:+0Q6(20/9(/.*/1#+(;4#/(:+(4+/0)1.*/20+#*)*.%13*:$:$7*，B&%32)%-%)=2，UU，*+：WAGF V WAGU G L:*+/0)96#)，7#)K$*，O9(2 O.8(+，L+(-()&%Z0,.#(64%J(6*-2()+*.0 B&/(-*/+(/$()(.*/913*:$:$7*#2)71*#+):6*/*-601+%512!3*7+6$&#7*3，HAAH!,（!）：FF V WW U K(61*)K%3-*+*2(+/#:040-+0+#*)*.+(L*2*$,#2(+*4.*/+(4(+(/2#)0+#*)*.$68:*1(%6 4)$3 912:，UUW，*-!（H）：F V FGAAZ:Q/#4(O，L:00.JM，J06(,Z 2+*3%C*)+/*66(4(T-/(11#*)*.-601+#4+/0)1$()(1#)-60)+1 Q01(4*)0)8:6(0/():*4(4 0)4-601+#4+0/$(+(4 D K3-*6,2(/01(%!#$%22)78$(+12 B*+)$7*3-%*:$%)27%2$(+12 C7)+2+*+2$(-:2#)%*，UUW，+*：FA V L:*/(/C3，78:9*6S B，C60/(MM 2+*3%D(#)+/0:(66860/-/*48:+#*)0)4 1(:/(+#*)*.Y_P;()(6*-(-/*+(#)#)2(+,6*+/*-#:,(01+!)%1)*,*+$#)%D272，UUF，*!.：V UHK09028/0 a，B*b*Q*/#D，_9(28/0 D：C*4*)810$(+0Q860+(4./*2#)+(/)0+#*)06JK31(R8():(40+0Q01(1：1+0+81.*/+(,(0/HAAA=B&%32)%-%)=2，HAAA，(/：HUHFL:*+O/0)96#)，L+(-()&Z0,.#(64%&/*1-(:+1.*/2*6(:860/.0/2#)$#)+($/()06$0 913*:$:$7*#2)71*#U V!UW杨宗岐等：来源于!#$%$%&(&#)$&的耐高温!;淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达