温度骤降对南美白对虾仔虾抗氧化机能的影响.pdf

第 15 卷 第 3 期 天 津 农 学 院 学 报 Vol.15，No.3 2008 年 9 月 Journal of Tianjin Agricultural University September，2008 *收稿日期：20081221 基金项目：天津市农业科技成果转化与推广项目“海珍品（鱼虾）集约化健康养殖技术成果转化与示范”（0604020）作者简介：孙金辉（1979），男，山东文登人，助教，硕士，主要从事水产营养与生态方面的教研工作。E-mail：。通讯作者：陈成勋（1967），天津市人，副研究员，学士，主要从事水产动物育苗与营养免疫方面的研究。E-mail：。文章编号：1008-5394（2008）03-0007-04 温度骤降对南美白对虾仔虾抗氧化机能的影响*孙金辉1，徐赟霞2，季延滨1，王庆奎1，赵丛明3，陈成勋1，通讯作者 （1.天津农学院 水产科学系 天津市水产养殖与生态重点实验室，天津 300384；2.大连水产学院，辽宁大连 116023；3.天津市立达海水资源开发有限公司，天津 300300）摘 要：测定温度骤降后南美白对虾仔虾肌肉中过氧化氢酶（Catalase CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）的活性和丙二醛（Malondiadehyde，MDA）的含量，评价温度骤降对南美白对虾仔虾抗氧化机能的影响。结果显示：温度由24 骤降到21 时，样品中CAT、SOD、ACP、AKP的活性及MDA的含量分别为0.004 790.005 54 kU/gport、0.8320.908 kU/gport、0.002 190.002 41 U/gport、0.000 6590.000 706 U/gport及0.4650.501 mmol/L；温度由24 骤降到18 时，样品中CAT、SOD、ACP、AKP的活性及MDA的含量分别为0.004 200.005 54 kU/gport、0.7910.908 kU/gport、0.001 970.002 43 U/gport、0.000 6430.000 706 U/gport及0.4670.844 mmol/L。由于温度降低到21 与对照组的温差不大，故各个指标的变化程度不是很明显；而温度降低到18 后，各指标呈现出了一定的变化趋势，说明温度骤降对南美白对虾仔虾有一定的影响，是南美白对虾健康与存活的重要因素之一。关键词：温度骤降；南美白对虾；抗氧化酶 中图分类号：S917 文献标识码：A Effects of Sudden Drop in Temperature on Activities of Antioxidant Enzymes of Litnpenaeus vannamei SUN Jin-hui1,XU Yun-xia2,JI Yan-bin1,WANG Qing-kui1,ZHAO Cong-ming3,CHEN Cheng-xun1,Communication Author（1.Department of Aquaculture,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China;2.Dalian Fisheries University,Dalian 116023,Liaoning Province,China;3.Tianjin Lida Seawater Resource Development Limited Company,Tianjin 300300,China）Abstract：The experiment studied the indexes of Litnpenaeus vannamei in conquering the sudden drop in temperature.The activities of CAT,SOD,AKP,ACP and the content of MDA were analyzed.The results show that the average activities of CAT,SOD,ACP,AKP and the average content of MDA were 0.004 790.005 54 kU/gport,0.8320.908 kU/gport,0.002 190.002 41 U/gport,0.000 6590.000 706 U/gport and 0.4650.501 mmol/L when the temperature dropped suddenly from 24 to 21;the average activities of CAT,SOD,ACP,AKP were 0.004 200.005 54 kU/gport,0.7910.908 kU/gport,0.001 970.002 43 U/gport,0.000 6430.000 706 U/gport and 0.4670.844 mmol/L when the temperature dropped suddenly from 24 to 18.The differences of temperature were not remarkable between the experimental groups and the control group when the temperature dropped to 21,so the changes of each index were not obvious.But when the temperature dropped to 18,each index presented the certain change tendency.It is explained that the changes of temperature have certain influences on the Litnpenaeus vannamei,and the temperature was one of the important factors for the health and the survival of Litnpenaeus vannamei.Key words：sudden drop in temperature；Litnpenaeus vannamei；antioxidant enzymes 南美白对虾（Litopenaeus vannamei Boone），学名凡纳滨对虾，已成为我国主要养殖虾种之一。天 津 农 学 院 学 报 第 15 卷 8 到 2001 年，我国养殖的南美白对虾产量已列世界首位。但随着南美白对虾养殖规模的不断扩大，各种疾病日趋严重，给养殖产业造成了巨大损失。因此，研究生态环境因子对南美白对虾生长、发育、摄食、存活的影响对其养殖生产有着重要的意义1。水温是影响南美白对虾生长、发育的主要生态因子之一2，直接影响着对虾的存活、生长和代谢强度等。研究温度对南美白对虾抗氧化能力的影响，探讨对虾调控抗氧化能力的环境生理学机制能为南美白对虾的健康养殖过程中水环境的调控和病害的防治提供科学依据3。对虾属于变温动物，其体温随着环境温度的变化而改变，而环境温度的不同必然影响机体的新陈代谢和生理调节机制4。目前，有关温度对甲壳动物免疫力影响的报道甚少5。本文通过研究水温骤降后不同时间内南美白对虾仔虾肌肉中过氧化氢酶（Catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）的活性和丙二醛（Malondiadehyde，MDA）的含量来探讨育苗以及实际的生产过程中温度变化对南美白对虾仔虾抗氧化能力的影响，比较温度骤降对抗氧化指标的影响，为南美白对虾健康养殖过程中水环境的调控和病害的防治提供科学依据。1 材料与方法 1.1 实验材料 实验所用南美白对虾仔虾于 2007 年 5 月 5 日购自天津大港区立达海水资源养殖有限公司，生物学体长为（1.10.2）cm，体色正常，健康活泼。实验前海水盐度为 12，温度为（24.00.5），连续充气。1.2 实验方法 实验以 24 海水环境为基准，用高锰酸钾消毒处理 140 L 的塑料水槽，将虾在水槽内暂养一段时间。将暂养的健康南美白对虾仔虾分别投放到 18 和 21的塑料水槽中，每槽放 250 尾，每次取样做 3 个平行处理。每个水槽中的海水盐度不变；温度梯度通过加热棒控制，实验期间温度的变动幅度为0.5。以 24 时的仔虾为对照，实验期间的海水盐度为 12，保持连续充气，期间对虾仔虾无死亡现象。每次随机取出 30 尾，取样时间为温度骤降后0、1、3、6、10、16、24 h。用游标卡尺准确测量每一尾虾的长度。用解剖器将所取仔虾的部分肌肉取出，并以 10 尾为一组计算平均值，共 3 个平行样。称量每个平行样的重量，放入自封袋中，迅速放置于 4 保存备用，以免失去活性。取出仔虾肌肉组织准确称量后，放入研磨器中加入生理盐水，于冰上制成 10%的组织匀浆，将上清液于 4 保存备用。过氧化氢酶的测定采用可见光法。以每毫克组织蛋白每秒钟分解 1 mol H2O2的量为一个活力单位。组织匀浆中 CAT 活力（对照管 OD 值测定管 OD 值）271（1/60取样量）匀浆蛋白含量。超氧化物歧化酶的测定采用黄嘌呤氧化酶法。以每毫克组织蛋白在 1 mL 反应液中 SOD 抑制率达 50%时所对应的 SOD 量为一个 SOD 活力单位。组织匀浆中 SOD 活力（对照管吸光度测定管吸光度）/对照管吸光度50%（反应液总体积/取样量）组织中蛋白含量。碱性磷酸酶的测定采用福林酚法。以每克组织蛋白在 37 与基质作用 15 min 产生 1 mg 酚为 1 个单位。碱性磷酸酶活力（测定管吸光度/标准管吸光度）标准管含酚的量（0.003 mg）取样量中的蛋白克数。酸性磷酸酶的测定采用福林酚法。以每克组织蛋白在 37 与基质作用 30 min 产生 1 mg 酚为 1 单位。酸性磷酸酶活力（测定管吸光度/标准管吸光度）标准管含酚的量（0.003 mg）所加样本中的蛋白克数。丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法。组织中 MDA 含量=（测定管吸光度测定空白管吸光度）/（标准管吸光度标准空白管吸光度）标准品浓度（10 mmol/L）蛋白含量。2 结果与分析 2.1 实验结果 温度从起始温度 24 骤然降低到 21 及18 后，各测定指标在不同时间段的数值变化情况见图 1图 5。2.2 分析 仔虾肌肉中 MDA 的含量在温度降低幅度为3 后，有低缓增加的趋势（图 1），但变化不明显。说明较短时间内，降温幅度为 3 时，对仔虾机体的影响不大。温度降幅为 6 时，处理 6 h第 3 期 孙金辉，等：温度骤降对南美白对虾仔虾抗氧化机能的影响 9后其含量出现升高趋势，至 24 h 所测值升高到0.844 mmol/L。由图 1 的变化趋势看出，在温度降幅为 6、骤降 6 h 以后，虾体肌肉中的 MDA 开始积累，说明机体对该项指标产生较明显的影响，并且这种影响在 6 h 以后才得以体现。仔虾肌肉CAT 活性变化测定结果表明，在温度骤降幅度为3 时，CAT 活性总体呈下降趋势，但变化不明显（图 2），说明降幅为 3 时，对仔虾的 CAT 活性影响不大。在温度骤降 6 后，CAT 的活性逐渐下降，3 h 内变化较明显，6 h 后趋于稳定，624 h CAT 的活性没有发生明显变化（图 2）。仔虾肌肉的 SOD 活性变化与 CAT 酶相似，温度降幅为 3 时，总体呈下降趋势，但变化不大（图 3）；温度降低幅度为 6 时，SOD 的活性下降较明显，温度降低 1 h 后，SOD 酶的活性已经明显低于起始温度的活性，6 h 后，SOD 酶活性继续呈下降趋势，与起始温度值的差异明显，随后，下降的幅度变小，并随时间延长趋于稳定（图 3）。仔虾肌肉 ACP 活性变化的测定结果表明，其活性在温度降低幅度为 3 后基本趋于平稳（图 4），说明降幅为 3 时对其活性无太大影响；在温度降低幅度为 6 后，ACP 的活性变化较明显，总体呈下降趋势，3 h 之前呈现稳定状态，6 h 以后开始下降，到 24 h 活性降至最低（图 4）。AKP 的活性变化与 ACP 的活性变化规律相似（图 5）：温度降幅为 3 时有下降趋势，但变化不明显；在温度降低幅度为 6 后，AKP 的活性则逐渐下降，1016 h 活性下降程度较大（图 5），说明降幅为 6 时变化比较明显，并且这种影响在 10 h 以后得以体现。图 1 不同温度降幅对 MDA 含量的影响 图 2 不同温度降幅对 CAT 活性的影响 图 3 不同温度降幅对 SOD 活性的影响 图 4 不同温度降幅对 ACP 活性的影响 图 5 不同温度降幅对 AKP 活性的影响 3 讨论 3.1 温度骤降对南美白对虾仔虾肌肉中 MDA 含量的影响 丙二醛是脂质过氧化的最终产物，它反映了机体受氧化损伤的程度。本研究结果显示，温度从 24 骤然降低到 18 以后，南美白对虾仔虾肌肉中的 MDA 含量逐步增加，说明机体受温差刺激后抗氧化系统紊乱，机体受到了氧化损伤。MDA 在体内的积累比 SOD 和 CAT 的下降略微滞后，这与温度骤降后机体抗氧化系统受损，引起脂质氧化代谢产物的上升的推论是一致的。动态检测 SOD、CAT 和 MDA 能比较准确地反映出机体内自由基的代谢情况及组织的氧化损伤情况，这对判断机体的健康状况以及免疫防御能力具有重要价值6。自由基引起机体氧化损伤后，会引起细胞膜中不饱和脂肪酸和磷脂的比例发生改变以及膜内蛋白的破坏；残存的自由基与膜内巯基基团结合，导致多种酶失活，细胞发生肿胀、变天 津 农 学 院 学 报 第 15 卷 10 性甚至死亡，从而使机体的免疫能力下降。这可能是南美白对虾在温度急剧下降后容易发病死亡的一个重要原因7。3.2 温度骤然降低对南美白对虾仔虾肌肉中CAT 活性的影响 过氧化氢酶是机体抗氧化、清除自由基的主要酶类8260。在细胞内，CAT 主要通过与线粒体及过氧化氢体结合，将细胞代谢产生的毒性物质H2O2迅速催化、分解为 H2O 和 O2，清除过氧化氢，防止羟自由基的形成。体内 CAT 的酶活力下降，标志着机体清除自由基的能力下降9。本研究结果显示，温度从 24 骤降到 18 以后，南美白对虾仔虾肌肉中 CAT 酶的活性急剧下降，但在 6 h 后基本达到最低并趋于稳定，在温度改变前后活性差异极大。温度降低后，CAT 抗氧化酶活性的降低标志着抗氧化系统受到一定程度的影响，使超氧阴离子自由基、过氧化氢、单态氧和羟自由基等自由基急剧增加，它们直接作用于细胞，损伤或破坏生物膜系统，造成细胞结构和功能的损害10。温度降低到 21 以后，CAT 的活性变化不明显，可能是温度骤降的幅度不够大，且时间短。具体原因有待进一步的实验证明。3.3 温度骤然降低对南美白对虾仔虾肌肉中SOD 活性的影响 超氧化物歧化酶是机体抗氧化、清除自由基的主要酶类。SOD 酶属于金属蛋白酶，是最重要的特异性 O2清除剂，能阻断脂质过氧化作用，是抗氧化系统中的关键性酶，也是机体免疫调节网络的重要组成部分，其活性受 O2的调控。SOD 酶与过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶（GSH-R）等结合，可有效清除体内 O2、H2O2及 ROOH 等活性氧，终止氧自由基对机体氧化的连锁反应。体内SOD 和 CAT 的酶活力下降，标志着机体清除自由基的能力下降8263。本研究结果显示，温度从 24 骤然降低到 18 以后，南美白对虾仔虾肌肉中SOD 酶的活性急剧下降，3 h 后就下降到最低，温度改变前后活性差异大。温度降低后，SOD 抗氧化酶活性的降低标志着抗氧化系统受到一定程度的影响，使超氧阴离子自由基、过氧化氢、单态氧和羟自由基等自由基急剧增加，它们直接作用于细胞，损伤或破坏生物膜系统，造成细胞结构和功能的损害11。温度降低到 21 以后，SOD的活性变化不明显，可能是由于温度骤然降低的幅度不够大或时间短，也可能存在其他影响因素。3.4 温度骤然降低对南美白对虾仔虾肌肉中ACP 和 AKP 活性的影响 由于 ACP 和 AKP 两种酶分子中唾液酸含量的不同导致其具有不均一性，再加上不同组织学来源的 ACP、AKP 生化反应特性不同，且在室温下非常不稳定，测定其活性时易受到多种实验条件的影响，因此，条件控制不佳会使测定结果产生明显误差。由于酸性磷酸酶稳定性较差，在实验过程中，如果条件控制不严，将会使结果产生误差。随着暴露时间的延长，ACP、AKP 活性会明显下降，这主要是因为在室温开放条件下，血清中的 CO2逸出，pH 值升高，使酶发生不可逆失活12124。温度对保持 ACP、AKP 活性的稳定起到至关重要的作用，室温下，ACP、AKP 均会迅速失活。实验过程中，ACP 和 AKP 活性都呈现出下降的趋势，这与温度骤降有重要关系，变化幅度不大可能是由于其他条件不稳定造成的。4 结论 南美白对虾属变温动物，温差的急剧变化会对机体的生理代谢、免疫能力等方面造成显著影响，甚至威胁到正常的新陈代谢。养殖生产的实践表明，大多数海水养殖生物的病害都发生在温度变化较大的季节，并且在温度急剧变化时更易发生病害13。本实验表明，当温度降幅为 3 时，南美白对虾仔虾各个免疫化学指标的变化程度不明显，而温度降幅为 6 后，各指标则呈现出了明显的变化趋势，说明温度骤然变化对南美白对虾仔虾生长有着一定的影响，是南美白对虾健康与存活的重要因素。依据本研究结果，并结合我国对虾养殖现状，得出结论：在南美白对虾养殖过程中，温度应控制在 2430 范围内，温度急剧波动的幅度不超过 3。在我国北方养殖南美白对虾时，5、6 月份应避免因寒流等引起养殖水温的急剧下降；秋季昼夜温差较大，也应采取措施，如适当增加水位（保持在 1.5 m 左右），以减少水温的波动幅度，避免因温度降低导致机体抗氧化能力下降，从而有效地防止因温度变化引发的疾病爆发14。实验结果也将有助于了解环境因素对机体抗氧化能力的影响，评估体内氧化代谢的情况及其对机体的损害程度，同时，对判断养殖动物的免疫状态和病情诊断以及病害防治都具有重要的参考价值12130。（下转第 28 页）天 津 农 学 院 学 报 第 15 卷 28 保存。制作活鱼标本，应用 60 热水使鱼致死，或放在空气中使其窒息，然后在瓷盘中用软毛刷蘸肥皂水把附于鱼体上的粘液刷掉（但不要伤鳞片），再从腹部向体内注射 10%福尔马林，之后用薄纱布把鱼体缠裹在玻璃板上，用 10%福尔马林固定。固定时间约 7 d，中间换一次固定液。固定后，把材料取出，拆除纱布，重新用针引线从鱼体前端和后端穿过鱼腹固定于玻璃板上，用 15%的福尔马林保存。参考文献：1 李风岐，苏育嵩.海洋水团分析M.青岛：青岛海洋大学出版社，2000：364366.2 李风岐，李磊，王秀芹，等.1998 年夏、冬季南海的水团及其与太平洋的水交换J.青岛海洋大学学报，2002，32（3）：329336.3 李风岐，谢骏，俎婷婷.大洋性次中层混合水团隶属函数的拟合及南海水团分析J.中国海洋大学学报：自然科学版，2004，34（5）：861866.4 陈清潮.中国海洋生物多样性的现状和展望J.生物多样性，1997，5（2）：142146.5 黄宗国.中国海洋生物种类与分布M.北京：海洋出版社，1994：4145.6 陈大刚，焦燕.中日海洋鱼类与分布的比较研究J.青岛海洋大学学报，1997，27（3）：305312.7 Kihara K，Itosu C.Structure of demersal fish community in the South China SeaJ.Nip Suis Gakk，1989，55（4）：639642.8 成庆泰，郑葆珊.中国鱼类系统检索M.北京：科学出版社，1987：87102.9 朱元鼎.中国软骨鱼类志M.北京：科学出版社，1960：9598.10 孟庆闻，苏锦祥，缪学祖.鱼类分类学M.北京：中国农业出版社，1995：114136.11 陈清潮.南海生物资源开发现状、潜力及今后发展对策J.南海研究与开发，1991（2）：1722.12 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