紫铆因抑制内质网应激恢复内皮细胞线粒体稳态的机制研究.pdf

:/心血管疾病多学科研究专题紫铆因抑制内质网应激恢复内皮细胞线粒体稳态的机制研究范崇熙 金振晓 宁守斌 翟蒙恩 李白容 徐梦楠 陈虹羽 张静 郭锐 杨全龙 石学汇付之光(空军特色医学中心消化内科 北京 空军军医大学西京医院心血管外科 陕西 西安 空军特色医学中心放射治疗科 北京)基金项目:国家自然科学基金青年科学基金()北京市海淀区卫生健康发展科研培育计划项目()空军军医大学临床研究项目()空军特色医学中心博士助推项目()作者简介:范崇熙 博士 主治医师 从事心血管内皮细胞损伤及保护机制研究:通信作者:付之光:网络首发:/()摘要 目的 探讨紫铆因()抑制内质网应激信号通路发挥保护血管内皮细胞抗氧化应激诱导凋亡的作用 方法 构建低氧诱导的人脐静脉内皮细胞()氧化应激损伤模型 应用不同浓度 (、/)处理细胞 后 法测定细胞活性 染色法标记凋亡细胞情况 分别应用 和 染色检测细胞内活性氧()及线粒体膜电位()水平 法检测内质网应激和凋亡通路主要蛋白变化 此外 联合应用内质网应激特异性激动剂毒胡萝卜素()后 重复上述检测 结果相对于对照组 低氧损伤降低细胞活力并促进细胞凋亡 同时 低氧损伤诱导 发生去极化反应 进而导致细胞内 堆积 分子水平研究显示 低氧损伤激活内质网应激信号通路并上调凋亡蛋白的表达 不同浓度的 呈“剂量依赖性”地抑制内皮细胞凋亡、稳定 水平、清除细胞内 堆积、恢复内质网功能 最终逆转细胞死亡()应用 联合处理后进一步证实 对内皮细胞的抗低氧作用明显减弱()结论 通过抑制内质网应激信号通路 稳定线粒体功能 进而清除细胞内 蓄积并阻断凋亡过程 介导 抗低氧损伤的作用关键词 紫铆因 内质网应激 线粒体稳态 氧化应激 人脐静脉内皮细胞 凋亡中图分类号 文献标志码 ()()()(/)()()():/“”()().氧供异常是机体多种心脑血管疾病的诱因 同时血氧浓度对于维持血管功能具有重要作用 急慢性缺氧能够引起血管内皮细胞()线粒体及内质网稳态变化 导致细胞内活性氧()堆积 进而影响细胞间的紧密连接 最终成为多种心脑血管疾病进展的病理生理基础 紫铆因()是一种源自白蜡树(又名漆树)的查尔酮 具有很高的药用价值 在东亚长期被用作治疗各种疾病 如血管炎、肝病、胃炎和神经系统炎症等 已被证明具有广泛的生物学功能 包括抗氧化、抗炎、抗糖尿病、降压和抗肿瘤作用 保护心肌或抗心力衰竭过程与恢复线粒体 内质网功能有关 并可减轻细胞氧化应激反应诱导的凋亡 然而对保护低氧导致的内皮细胞损伤却未见报道 本研究拟采用人脐静脉内皮细胞()为研究对象 构建低氧损伤模型 观察 对其保护作用及此过程中线粒体功能和内质网应激()关键蛋白的变化 旨在为低氧性 损伤的防治提供新的基础理论依据 材料与方法 材料()购自上海陶术生物科技有限公司 购自美国 公司 完全培养基()购自武汉普诺赛生命科技有限公司 胰蛋白酶()、试剂盒()和青 链霉素双抗混合液()购自北京翱擎生物科技有限公司 原位细胞凋亡检测()试剂盒()购自德国 公司 检测试剂盒()和 线粒体膜电位荧光探针()购自上海翌圣生物科技股份有限公司 荧光染色剂()、裂解液()和 蛋白上样缓冲液()购自上海碧云天生物技术有限公司 蛋白浓度测定试剂盒()和 凝胶配制试剂盒()购自北京索莱宝科技有限公司兔源性蛋白激酶 样内质网激酶()抗体()和兔源性 抗体()购自美国 公司 兔源性 ()抗体()和鼠 源 性 抗 体()购 自 美 国 公司 兔源性葡萄糖调节蛋白 ()抗体()和鼠源性/同源蛋白(/)抗体()购自英国 公司 兔源性 抗体()购自美国 公司 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠()和山羊抗兔()抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司 型 细胞培养箱购自美国 公司 低氧小室装置购自美国 有限公司 型多功能酶标仪购自美国 公司 激光共聚焦显微镜购自日本 公司 蛋白分离及 型成像系统购自美国 有限公司 方法 细胞培养及传代复苏的 接种于含/胎牛血清及/双抗混合液的专用完全培养基中 在 、/条件下隔日换液培养 当培养瓶底部细胞生长密度达 时 用 /胰 酶 常 规 消 化 并 传 代 将 对 数 生 长 期 的 作为实验对象 实验分组和药物处理 常规溶于二甲基亚砜()配置成 /的溶液中 保存 使用前以无血清的内皮细胞专用培养基稀释成工作液 并保证 浓度低于/实验分为以下 组:对照组 低氧损伤组低氧 /组 低氧 /组低氧 /组 根据国内外现有文献报道构建低氧损伤模型 具体步骤如下:常规空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/接种于所需的培养容器内 后换用含有不同浓度 的无血清专用培养基 随后置于低氧小室装置内将其充满含/、/和/的混合液体 夹闭进气口 对照组换液后仍在 的/环境下培养 实验时间均为 结束后收集细胞用于检测 法检测细胞活性 以 /的密度接种于 孔板中 每孔 每组设 个复孔 细胞形态展开完全后 给予不同药物及低氧处理 实验结束时 小心吸取细胞上清液 用 的 洗 次 随后每孔加入 含/的无血清细胞专用培养基混合液 孵育 应用 型多功能酶标仪测定 值 细胞存活率 (用药组 值 空白对照组 值)/(细胞对照组 值 空白对照组 值)法检测细胞凋亡率 按照 /孔的细胞量制作爬片 处理结束后 采用 /多聚甲醛固定 洗 次 并用含 /的 溶液覆盖细胞爬片 以增加细胞膜的通透性避光条件下 向各组爬片滴加 工作液 孵育 用以标记凋亡细胞核 滴加 工作液(/)室温复染细胞核 /甘油封片后 在激光共聚焦显微镜下随机选择 个无重叠图像观察并拍照 计算细胞凋亡率 凋亡率 绿色细胞数/蓝色细胞数 细胞内 聚集测定使用膜渗透荧光探针 二氯荧光素二乙酸酯()检测细胞内 的浓度 按照 比例用无血清培养液稀释 使其终浓度为 /探针进入细胞并被细胞内 酯 酶 水 解 形 成 二 氯 荧 光 素()被捕获在细胞内取一定量的上述工作液覆盖于处理后的细胞爬片 避光孵育 细胞内的 可以将 氧化为高荧光化合物 二氯荧光素 应用激光共聚焦显微镜于 激发后 收集在 处发出的绿色荧光 分析结果 线粒体膜电位()检测 是线粒体功能的重要指标 同时也是可以用作细胞凋亡的早期检测指标 荧光染料 能够准确地标记 情况 其中红色荧光(聚合体)到绿色荧光(单体)的转变预示 下降(或去极化)体现线粒体功能的失常 操作步骤如下:按照 步骤中的方式制作细胞爬片并给予处理 用 清洗处理后的细胞爬片 向 孔板内加入 无血清专用培养基和 预先配置的 染色工作溶液 在 、/避光环境下 孵育 吸掉混合培养液 然后用合适的预热缓冲液清洗细胞 次 加入 专用培养基在荧光显微镜下观察并拍摄 单体的激发和发射波长分别为、用于检测 聚集体 红色和绿色荧光的相对比率代表 的变化 分析结果 检测细胞关键蛋白变化收集各组细胞样本 预冷的 洗 次 加入一定量的 裂解液在冰上刮掉细胞 收集细胞悬液并继续在冰上放置 期间用移液器吹打混合液体 于 下 离心 收集上清液 通过 蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度 调平各组蛋白含量并加入 蛋白上样缓冲液 煮沸 将 总蛋白在 /的 上分离 然后转移到 膜上 利用 /脱脂牛奶溶液封闭非特异性膜蛋白位点约 根据蛋白分子量 将对应的条带分别与 抗体()、抗体()、抗体()、抗体()、抗 体()、抗 体()、抗体()混合孵育 过夜 次日 用 洗涤 次 加入相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠()和山羊抗兔()抗体室温孵育 用 缓冲液洗涤膜 次 使用 超灵敏发光液体进行化学发光反应 信号强度由 型成像系统测量和量化 变化 为了评估低氧诱导的 损伤过程中 的变化及作用 首先筛选合适的内质网应激特异性激动剂毒胡萝卜素()的应用浓度(本实验设 个浓度 分别为 、/)其次 在相同低氧环境下 给予一定量的 联合 (/)处理 实验结束后 收集细胞进行生物测定 统计学分析实验数据以 表示 采用 统计软件进行检验 通过单因素方差分析对 个(或以上)实验组进一步比较 对多重比较进行最小显著差异校正 表示差异有统计学意义 结果 对低氧条件下 损伤后细胞活力及凋亡的影响 结果显示 低氧 后 细胞活力显著下:/降 并且细胞明显变圆、折光性增强 震动培养瓶可见细胞脱落()与低氧损伤组相比 用不同浓度 处理显著增加了细胞活力 同时细胞形态随药物浓度增加而明显恢复 这表明 可以在 的治疗中缓解 受低氧诱导的损伤(图)此外 低氧环境增加 凋亡细胞数量表现为绿色荧光比例明显增加 处理则显著抑制其变化(图)以上结果说明 能够“剂量依赖性”地减轻低氧诱导的 活性降低这与抑制细胞凋亡有关:对照组:低氧损伤组:低氧 /组:低氧 /组:低氧 /组:各组处理后内皮细胞活性 :紫铆因 对照组 低氧损伤组 低氧 /组 低氧 /组 图 低氧条件下不同浓度 处理后 的细胞活力图标尺为 :紫铆因 对照组 低氧损伤组 低氧 /组 低氧 /组图 低氧条件下不同浓度 处理后 凋亡图 对低氧条件下 损伤后细胞内 及 的影响 是参与氧化还原反应的重要化学反应性分子 细胞内过量的 可诱导细胞凋亡 荧光染色结果表明 低氧损伤组可显著增加 内 的水平()与低氧损伤组相比 不同浓度的 均可显著降低 内 的水平(图)空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/标尺为 :紫铆因:二氯荧光素 对照组 低氧损伤组 低氧 /组 低氧 /组图 低氧条件下不同浓度 处理后 内 水平变化图 降低是线粒体功能损伤的敏感指标 是一种敏感的荧光探针 广泛用于 的检测 当 较高时 可以在线粒体基质中聚集形成聚合物并发出红色荧光 较低时 的单体形式不能聚集在线粒体基质中则会产生绿色荧光 低氧后 绿色荧光增加 表明 降低和线粒体功能异常()不同浓度的 处理降低了低氧对 的影响 并以“剂量依赖”的方式增加红色荧光的表达 表明 对维持线粒体功能具有保护作用(图)标尺为 :紫铆因 对照组 低氧损伤组 低氧 /组 低氧 /组图 低氧条件下不同浓度 处理后 内 聚合体和单体荧光强度图 对低氧条件下 损伤后 和凋亡相关蛋白的影响 线粒体功能紊乱导致的细胞 堆积对于 至关重要 相反抑制 能够恢复线粒体功能 在多种刺激下防止细胞损伤和减缓凋亡 为了评估 是否会影响低氧条件下 损伤后 和凋亡分子的变化 法用于检测上述通路中的关键蛋白 研究结果显示 低氧处理激活 表现为其磷酸化水平上调 同时损伤组中 和 蛋白的表达水平显著增加此外 表 达 降 低 表 达 增 加(图)不同浓度的 处理显著抑制了、以及 蛋白质表达 并增加 水平(图)上述蛋白变化趋势表明 对 低氧损伤诱导的 和凋亡关键蛋白具有调控作用:/:紫铆因 对照组 低氧损伤组 低氧 /组 低氧 /组图 低氧条件下不同浓度 对 中 和凋亡相关蛋白的影响 激活 对 保护 抗低氧损伤的影响 为了探索 在 保护 抗低氧诱导的氧化应激损伤过程中的具体作用 作为 的有效激动剂联合应用于实验 结果显示 不同浓度 (、/)处理 后 检测发现 在浓度剂量超过 /时细胞活性显著降低(图)提示 对细胞产生毒副作用 因此选择 /用于后续实验 与低氧 /组相比 联合 可抑制细胞活性(图)、促进凋亡(图)并增加了细胞内 的堆积程度(图)说明在 介导 抗低氧诱导损伤过程中 激活 能逆转 的保护作用 此外 结果证实联合应用 和 可以进一步促进 关键蛋白(、和)的表达 同时提高 并抑制 的含量(图 )这些结果表明 信号通路作为一种潜在机制参与 低氧损伤后 发挥的抗凋亡作用:不同浓度 对细胞活性的影响:各组细胞活性变化:各组细胞凋亡变化分析图:各组细胞 含量分析图 :各组细胞中 及凋亡关键蛋白的变化典型条带及统计分析图 :紫铆因:二氯荧光素:毒胡萝卜素 对照组 低氧损伤组 低氧 /组图 激活 对低氧损伤条件下 保护 损伤的影响空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/讨论氧气是真核生物清除有害代谢产物及确保酶促反应关键催化剂和底物 血管则是其主要运输器官正常的血管功能可以保证组织血供、避免缺氧及营养供给不足 对于维持血管结构及其功能至关重要 也是多种损伤的靶细胞 越来越多的证据表明缺氧性 损伤在癌症、心肌缺血、代谢性疾病、慢性心脏病等疾病的发病机制中起着关键作用 成为人类健康的头号威胁 因此 探索其调控机制以及有效的抗缺氧治疗方法 成为心脑血管领域的研究热点 是一种植物类黄酮 具有多种药理学活性如抗癌、抗炎和抗氧化应激等 近期一项临床研究显示 含有 的黄酮类化合物可显著降低胃肠道肿瘤瘤体大小 且用药后患者的耐受性良好然而 等认为 联合 能降低 的迁移能力 单独应用则效果不明显此外 多项研究表明 等发现 可舒张大鼠主动脉血管 而这一作用与血管内皮完整性相关 而 的团队则提出 通过调控 选择素的表达发挥抗肿瘤坏死因子 诱导的 炎性损伤 其机制可能与调控 或 通路有关以上结果提示 对动静脉血管内皮均有调控或保护性作用 然而 其对低氧诱导的内皮细胞损伤的保护作用仍需深入研究 本实验利用 低氧小室装置提供低氧环境(/、/和/)该装置广泛用于实验室研究 具有低成本、易操作和高稳定性等特点 结果显示 低氧处理 后 出现脱落、变形 细胞活性明显降低 说明低氧诱导的损伤模型构建成功 可以用于后续实验研究线粒体是 中氧气的主要消耗场所 低氧刺激能够改变线粒体融合、分裂、吞噬及氧化磷酸化等过程 引发 堆积和线粒体功能进一步异常 最终激活细胞凋亡 也称为氧化应激损伤 因此 清除 恢复线粒体功能是维持细胞正常氧化应激反应的关键途径 作为一种天然抗氧化剂 可以通过清除氧自由基等有害物质 明显减轻过氧化氢诱导的大鼠溶血过程或抑制乙醇对肝星状细胞的毒性作用 本实验低氧损伤组中 凋亡细胞比例和凋亡相关蛋白(和)显著增加 同时伴随细胞 水平升高 进一步通过 染色评价线粒体功能所示 低氧导致 去极化 线粒体功能失衡说明此时细胞发生线粒体介导的氧化应激 凋亡反应不同浓度的 呈剂量依赖性地稳定、清除堆积的、降低凋亡率 说明 通过抑制异常线粒体氧化应激反应保护 抗低氧损伤 是一种特殊的细胞器 对蛋白质折叠、分泌和翻译后修饰至关重要 当细胞收到外界刺激时会诱发未折叠(或错误折叠)蛋白质的积累 称为 研究表明 与多种心脑血管疾病的发病率密切相关 包括缺血性心脏病、心肌纤维化和脑卒中等 是一种 信号蛋白激活(或磷酸化)后能促进 解离 进而提高 合成效率 并维持氧化还原稳态 目前认为 能建立 和线粒体之间的信号连接调控凋亡过程 其机制可能与恢复线粒体稳态相关 过度激活 或应激持续存在(包括低氧损伤)则会激活下游 通过核转录水平促进视网膜微血管内皮细胞中凋亡相关蛋白的表达 另一项研究指出 通过增加抗氧化分子的表达、抑制 的产生提高过氧化氢损伤后大鼠心肌细胞活力 该作用与恢复线粒体功能和抑制 密切相关 本实验中 低氧环境诱导 线粒体氧化应激反应的同时伴随内质网标志蛋白(、和)的异常活化 说明 参与低氧导致的 损伤 应用 处理则有效下调上述 关键蛋白 提示 通过抑制上述反应发挥细胞保护作用 是一种微粒体 酶抑制剂 可以诱导细胞发生 联合应用后 明显减弱 对 的保护作用 进一步证实 通过抑制 介导 抗低氧诱导的氧化应激损伤综上所述 对低氧环境下 线粒体功能失衡诱导的凋亡损伤具有明显缓解作用 这与清除细胞 和抑制 密切相关 因此 治疗可能是新型预防血管内皮功能障碍的治疗药物 其作用机制尚未完全阐明 仍需深入研究【参考文献】.():赵芸漳 厉建伟 钟国徽 等 线粒体钙单向转运体在模拟失重所致巨噬细胞极化改变中的调控作用研究.空军航空医学():李黎 史先鹏 周楠 等 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性氧氧化应激信号通路在过敏反应中的作用及抗氧化剂干预实验研究.陕西医学杂志 ():.:/:.:/.():.():.():.():.:.():胡佳 谢佳欣 成姣 等 内皮细胞低氧复氧损伤模型的建立.中国动脉硬化杂志 ():.():.():.():.():.()():.():/.():.(/):.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():.():().():艾永飞 刘静 尚福军 等 信号通路在褪黑素抵抗血管紧张素诱导乳鼠心肌细胞肥厚中的作用.心脏杂志 ():.():.:吕云利 刘吉耀 孙喜庆 线粒体自噬和内质网应激调控血管内皮细胞功能研究进展.心脏杂志 ():.()():(收稿 修回)(编辑:陈仕红)空军军医大学学报 年 月 第 卷第 期 :/