周期蛋白和周期蛋白依赖性激...期进程中的调控机制研究进展_潘剑锋.pdf

潘剑锋 等/周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1525-1547 DOI:10.13345/j.cjb.220478 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：国家自然科学基金(31860627)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(31860627).*Corresponding author.E-mail: Received:2022-06-16;Accepted:2022-11-14;Published online:2022-12-08 1525 生物工程学报 周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展 潘剑锋1，尚方正1，马荣1，戎友俊1，张燕军1,2,3,4*1 内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018 2 农业农村部肉羊遗传育种重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018 3 内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018 4 内蒙古自治区山羊遗传育种工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018 潘剑锋,尚方正,马荣,戎友俊,张燕军.周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展J.生物工程学报,2023,39(4):1525-1547.PAN Jianfeng,SHANG Fangzheng,MA Rong,RONG Youjun,ZHANG Yanjun.Advances of the regulatory mechanism of cyclin,cyclin-dependent kinases and related kinase inhibitors in cell cycle progressionJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1525-1547.摘 要：在细胞发育过程中，细胞周期起着至关重要的作用。细胞周期进程主要受细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)、周期蛋白和内源性 CDK 抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKI)调控。其中，CDK 是主要的细胞周期调节因子，可与周期蛋白结合形成周期蛋白-CDK 复合物，从而使数百种底物磷酸化，调控分裂间期和有丝分裂进程。各类细胞周期蛋白的活性异常，可引起不受控制的癌细胞增殖，导致癌症的发生与发展。因此，了解 CDK 的活性变化情况、周期蛋白-CDK 的组装以及 CKI 的作用，将有助于了解细胞周期进程中潜在的调控过程，为癌症与疾病的治疗和 CKI 治疗药物的研发提供基础。本文关注了 CDK 激活和灭活的关键事件，并总结了周期蛋白-CDK 在特定时期及位置的调控过程，以及相关 CKI 治疗药物在癌症及疾病中的研究进展，最后简单阐述了细胞周期进程研究面临的问题和存在的挑战，以期为后续细胞周期进程的深入研究提供参考和思路。关键词：周期蛋白依赖性激酶；周期蛋白；周期蛋白依赖性激酶抑制剂；癌症；细胞周期 综 述 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1526 Advances of the regulatory mechanism of cyclin,cyclin-dependent kinases and related kinase inhibitors in cell cycle progression PAN Jianfeng1,SHANG Fangzheng1,MA Rong1,RONG Youjun1,ZHANG Yanjun1,2,3,4*1 College of Animal Science,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,Inner Mongolia,China 2 Key Laboratory of Meat Sheep Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the Peoples Republic of China,Hohhot 010018,Inner Mongolia,China 3 Key Laboratory of Animal Genetics,Breeding and Reproduction in Inner Mongolia Autonomous Region,Hohhot 010018,Inner Mongolia,China 4 Goat Genetics and Breeding in Inner Mongolia Autonomous Region Engineering Technology Research Center,Hohhot 010018,Inner Mongolia,China Abstract:Cell cycle plays a crucial role in cell development.Cell cycle progression is mainly regulated by cyclin dependent kinase(CDK),cyclin and endogenous CDK inhibitor(CKI).Among these,CDK is the main cell cycle regulator,binding to cyclin to form the cyclin-CDK complex,which phosphorylates hundreds of substrates and regulates interphase and mitotic progression.Abnormal activity of various cell cycle proteins can cause uncontrolled proliferation of cancer cells,which leads to cancer development.Therefore,understanding the changes in CDK activity,cyclin-CDK assembly and the role of CDK inhibitors will help to understand the underlying regulatory processes in cell cycle progression,as well as provide a basis for the treatment of cancer and disease and the development of CDK inhibitor-based therapeutic agents.This review focuses on the key events of CDK activation or inactivation,and summarizes the regulatory processes of cyclin-CDK at specific times and locations,as well as the progress of research on relevant CDK inhibitor therapeutics in cancer and disease.The review concludes with a brief description of the current challenges of the cell cycle process,with the aim to provide scientific references and new ideas for further research on cell cycle process.Keywords:cyclin dependent kinase(CDK);cyclin;cyclin dependent kinase inhibitor(CKI);cancer;cell cycle 细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，通过介导不同底物磷酸化，参与细胞周期调控和转录调节1。大多数 CDK 具有 CDK激酶结构域、周期蛋白结合位点、磷酸化修饰位点和 T-loop(称为激活环)基序等2-3。当CDK 与其特定的周期蛋白非共价结合时 CDK的 T-loop 被置换，从而暴露底物 ATP 结合位点并重新排列活性位点的关键残基，激活CDK 活性4-5。迄今为止，已有数十种 CDK(CDK1/2/4/6/7/9 等)和周期蛋白(cyclinA/B/D/E/F/G/H 等)被确认，并在细胞周期调控中发挥重要作用，例如 cyclinD-CDK4/6 启动细胞周期进 程，cyclinE-CDK2调 控S期 进 入，cyclinA-CDK2 调控 S 期 DNA 复制，cyclinA/B-CDK1 触发有丝分裂等6-7。由于大多数 CDK 异常表达与癌症进展有关，因此研发 CDK 抑制剂作为抗癌靶向药物引 潘剑锋 等/周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展 ：010-64807509： 1527 起了学界极大关注8。近 20 年来，至少有数十种靶向 CDK 的药物在临床试验中进行了研究，然而却仅有极少数被批准用于临床治疗9-10。在研究早期，发现的 CDK 抑制剂多为泛 CDK抑制剂与多 CDK 抑制剂，其虽可有效抑制多种 CDK 或其他激酶，但表现出来的明显副作用，阻碍了这两类抑制剂进入市场与开展临床治疗。因此，为获得更安全、有效、副作用小的 CDK 抑制剂用于临床治疗，研究者对选择性 CDK 抑制剂展开了研究。2015 年第一种选择性 CDK4/6 抑制剂帕博西尼(palbociclib)被美 国 食 品 药 品 监 督 管 理 局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于治疗乳腺癌11。之后，3 种选择性 CDK4/6 抑制剂瑞博西尼(ribociclib)、阿贝西利(abemaciclib)、曲拉西利(trilaciclib)也相继上市并用于临床治疗12。此外，当前被鉴定的选择性 CDK 抑制剂，主要靶向 CDK1、CDK2、CDK4/6、CDK7 等13-14。在临床研究中 CDK 抑制剂不仅可以被用于治疗各类癌症，还可以被用于治疗各类非癌症疾病，例如炎症性疾病、中枢神经系统疾病和感染性疾病等15。这表明 CDK 在许多癌症与非癌症疾病的病理过程中发挥着重要作用。本文介绍了 CDK 激活或灭活过程的关键事件、特定时期及位置的周期蛋白-CDK 的研究进展、相关 CDK 抑制剂在癌症和非癌症疾病中的应用情况及研发进展。最后，简单阐述了细胞周期研究领域面临的问题和存在的挑战，旨在为细胞周期研究领域的发展提供研究思路。1 CDK 活性激活的关键事件 CDK 是驱动真核细胞周期的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在其特定时期激活或灭活可使细胞周期进程有序进行16-17。CDK 激活需要满足如下条件：(1)需要与周期蛋白结合；(2)CDK 激活位点的磷酸化和抑制位点的去磷酸化；(3)不与 CDK 抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKI)结合等。有趣的是只有当周期蛋白与 CDK 结合形成周期蛋白-CDK 复合物时，CDK 上的激活位点磷酸化和抑制位点去磷酸化，才会激活 CDK 的活性，而活化的 CDK则会在 CKI 的作用下被抑制，因此 CDK 的激活需要满足这 3 个关键事件。1.1 与周期蛋白结合形成复合物 周期蛋白(cyclin)是一类在细胞周期调控过程中表达量呈周期性变化的蛋白质，周期蛋白最初是由 Tom Evans在 1983年研究海胆细胞周期时发现，主要通过激活 CDK 活性和其他细胞周期相关的酶，进而控制细胞周期进程的蛋白质家族18-19。在脊椎动物中，周期蛋白包括 A、B、D、E、F、G 和 H 等类型，可在特定时期与特定 CDK 结合构成周期蛋白-CDK 复合物，例如 cyclinD-CDK4/6、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2、cyclinH-CDK7、cyclinA-CDK1 和cyclinB-CDK1 等3,20。每一组周期蛋白-CDK 可通过触发下一组周期蛋白-CDK 以及其他相关细胞周期蛋白的表达，调控各个阶段细胞周期的有序进行7。另外，周期蛋白拥有如下基本结构与特征，包括氨基酸结构域(又称为细胞周期蛋白盒)、破坏框、脯氨酸/谷氨酸/丝氨酸/苏氨酸(pro-glu-ser-thr,PEST)序列等3。这些结构与特征调控周期蛋白与 CDK 结合、周期蛋白的泛素化降解、G1 期周期蛋白更新等过程3。此外，不同种类的周期蛋白只在细胞周期特定时期表达和调节特定 CDK。随着细胞周期的进展，周期蛋白产生效应后立即降解21。但有趣的是 CDK 的浓度不会随着周期进程变化而波 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1528 动。因此，在细胞周期进程中其活性的激活则是细胞周期各阶段进程能顺利进行的关键。此外，周期蛋白的降解是由后期促进复合物(anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C)在 M 期后期至 G1 期后期的活动，以及 SCF(Skp1-Cul1-F-box)-Skp2(S-phase kinase-associated protein 2)复合物在 G1 期后期至 M 期早期的活动所致22-23。另外，在胚胎干细胞中周期蛋白的表达模式明显与体细胞不同24。例如小鼠胚胎干细胞具有更高且持续的 cyclinA/E 蛋白质表达水平，且在整个细胞周期中 cyclinA/E 的相关激酶 CDK2 被持续性激活25。表明周期蛋白在细胞周期进程中的表达模式不是一成不变，且在不同细胞类型中表达存在差异。因此，在探究不同细胞类型周期进程中，应注意对细胞周期蛋白表达模式的确认及验证，见图 1A。1.2 CDK 特定位点的磷酸化修饰 CDK 与周期蛋白结合是其具有活性的必备条件，但仅有周期蛋白结合还不足以激活CDK，必须在 CDK 特定位点的磷酸化或去磷酸化才能使其活性得以激活。人类和小鼠体细胞周期研究中发现，WEE 激酶家族是驱动 CDK抑制位点磷酸化主要的蛋白质激酶家族，该家族主要由这 3 类蛋白质 WEE1、膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶 1(protein kinase membrane associated tyrosine/threonine 1,PKMYT1)和WEE1B 构成，主要通过介导 Tyr15 和 Thr14 位点的磷酸化，降低 CDK 的活性26-28。WEE 激酶家族所造成的 CDK 活性降低，致使大量周期蛋白-CDK 无活性，从而导致该复合物在细胞周期下一阶段开始前大量积累27。而一种在进化上保守的磷酸酶细胞分裂周期 25(cell division cycle 25,Cdc25)，可通过移除 CDK 上由 WEE激酶介导的抑制性磷酸基团，重新激活周期蛋白-CDK29-30。有趣的是，重新活化的周期蛋 白-CDK还可抑制WEE激酶的活性，并防止WEE 激酶再一次灭活 CDK31。同时，在人类体细胞中发现活化的周期蛋白-CDK 还可磷酸化激活Cdc25 的活性，使得周期蛋白-CDK 可在短期内急剧增加，这表明了一种周期蛋白-CDK 活性激活的反馈调控机制32。在 CDK 的激活中，除抑制位点磷酸化外，激活位点的磷酸化也是决定CDK 活性激活的关键。在人类和小鼠体细胞中发现，CDK 激活激酶(CDK-activating kinase,CAK)可通过磷酸化 CDK 的 Thr161 位点，激活CDK 活性，从而确保细胞周期有序且精确地进行33-34。综上所述，CDK 激活需要如下两种模式：通过 Cdc25 将 WEE 激酶介导的抑制性磷酸基团去除，称为抑制位点去磷酸化；通过CAK 将 CDK 的激活位点磷酸化，称为激活位点磷酸化。而只有这两种磷酸化模式同时在CDK 上进行，才可激活 CDK 的活性。因此，在细胞周期进程中对 CDK 特定位点磷酸化状态的探究就显得尤为关键，见图 1B。1.3 CDK 活性抑制剂 在细胞周期中存在多种 CKI，激酶 4 抑制因子(inhibitors of kinase 4,INK4)家族(p16INK4A、p15INK4B、p18INK4C和 p19INK4D等)、抑制蛋白(CDK interaction protein/kinase inhibitor protein,CIP/KIP)家族(p21Cip1、p27Kip1和 p57Kip2等)以及核糖体蛋白抑制 CDK(ribosomal protein-inhibiting CDKs,RPICs)7。这些 CKI 主要通过与周期蛋白-CDK 相互作用，阻止周期蛋白与对应的CDK 结合，从而抑制 CDK 活性，造成细胞周期进程停滞 3 5。其中，INK4 家族仅抑制cyclinD-CDK4/CDK6，而 CIP/KIP 家族则具有更广泛的特异性，可抑制 cyclinD-CDK4/CDK6、cyclinE-CDK2、cyclinA-CDK2 和 cyclinB-CDK1等35-36。因此，为了保证在特定时期细胞周期正常有序进行，则需对这些抑制剂进行降解或 潘剑锋 等/周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展 ：010-64807509： 1529 抑制以及相应的激活。在多种人类恶性肿瘤(多发性骨髓瘤等)细胞中发现 SCF-Skp2 复合物可通过泛素化降解 CKI，消除 CKI 对周期蛋 白-CDK 的抑制效果，促进细胞周期进程37。TGF-(transforming growth factor-beta)信号通路被证明可通过促进 SMAD2/3 和 SMAD4 结合，抑制 c-Myc 促进 p15INK4B表达38。并且SMAD2/3-SMAD4 复合物还可直接与 p15INK4B和 p21Cip1相互作用促进其表达，从而抑制细胞周期进程39。另外，p107 和 E2F 转录因子 4/5(adenovirus E2 promoter binding factor transcription factor 4/5,E2F4/5)也可作为 SMAD 的辅助因子，抑制 c-Myc 促进 p15INK4B表达40。可见在 细胞周期进程调控中 SMAD 家族起着重要作用。此外，DNA 损伤可通过激活 p53 促进p21Cip1/WAF1的表达，抑制相关 CDK 的激活，阻碍细胞周期进程41。另外，CDK 不仅可被 CKI抑制，同时周期蛋白-CDK 还可通过隔离 CKI，促进相关 CDK 激活，例如在乳腺癌和人类 B 细胞淋巴瘤细胞周期研究中发现 cyclinD-CDK4/6可通过与 p27kip1特异性结合，隔离 p27kip1对cyclinE-CDK2 的抑制作用，促进 CDK2 的激活42。表明 CDK 与 CKI 可能存在一种反馈调节机制。综上所述，CDK 活性激活需要将这些由泛素化介导的 CKI 在细胞周期特定时期内降解，才可保证细胞周期有序进行，见图 1C。图 1 Cyclin-CDK 活性调控过程 Figure 1 The regulation process of cyclin-CDK activity.A:Cyclin ubiquitination and degradation.Cyclin is ubiquitinated and degraded by APC/C-Cdc20 or SCF-Skp222-23.B:Cyclin-CDK phosphorylation modification,CAK mediates Thr161 phosphorylation,WEE kinase family mediates Thr14 and Tyr15 site phosphorylation,phosphorylated Cdc25 activates cyclin-CDK by removing Thr14 and Tyr15 phosphate groups,and feedback regulates Cdc25 and WEE kinase family activities27,30,33.C:CKIs ubiquitination degradation and activation,CKIs are degraded by SCF-Skp2 ubiquitination and degradation,DNA damage activates P53 to promote the expression of CKIs,and the TGF-signaling pathway mediates SMAD4-SMAD2/3 binding to promote the expression of CKIs7,38.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1530 2 G1期cyclinD-CDK4/6复合物 D 型细胞周期蛋白(cyclin D1/D2/D3)与CDK4/6 是驱动整个细胞周期启动的核心分子。胞外生长因子信号通过 MAPK(mitogen-activated protein kinases)信号通路刺激 cyclinD-CDK4/6启动细胞周期43。在细胞分裂过程中，激活的cyclinD-CDK4/6 可通过使底物视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,RB)磷酸化，促使 RB 与 E2F1/2/3 解离，激活 E2F1/2/3 的转录活性，从而协同 DP1/2 促进 cyclinE 及进入 S期所需的酶和蛋白质翻译，进而保证 G1-S 期转换19,44。此外，非磷酸化的 RB 可与转录因子 E2F1/2/3 紧密结合抑制转录因子的活性，从而诱导 G1 期停滞45。表明在 G1-S 期转换过程中磷酸化 RB 是关键事件。此外，有学者发现cyclinD-CDK4/6 通过与 RB C 末端的一个-螺旋配对，从而磷酸化 RB，并且该螺旋不可被cyclinE、cyclinA 和 cyclinB 识别，而且 RB C末端螺旋的突变能阻止其被 cyclinD-CDK4/6磷酸化，从而造成 G1 期停滞，表明 cyclinD-CDK4/6 磷酸化 RB 与其 C 端螺旋密切相关46。磷酸酶 Cdc25A 已在体细胞中被证明可通过去除特定位点磷酸化激活 cyclinD-CDK4/CDK6，促进 G1-S 期转换47。而 G1 期至有丝分裂期 Cdc25A 是一种不稳定的蛋白质，并且过于稳定的 Cdc25A 会造成 G1-S 期和 G2-M 期转换加速，致使基因组不稳定导致癌症及疾病发生32。而 cyclinD-CDK4/CDK6 可通过以ssTrCP 依赖的方式降低 Cdc25A 的稳定性，保证 G1-S 期正常转换32。表明 cyclinD-CDK4/CDK6与 G1期 Cdc25A间可能存在一种调控负反馈回路，控制着 G1-S 期转换。此外，异常表达的 cyclinD 会导致 DNA 损伤、复制应激和检查点激酶 1(checkpoint kinase 1,CHK1)激活，致使细胞出现异常生长48。因此，关于cyclinD-CDK4/6 降解机制的研究就显得尤为关键。研究发现，cyclinD 羧基末端磷酸化可触发泛素化蛋白酶体降解途径，并且该途径受到泛素连接酶(E3)家族成员 CRL4AMBRA1(the cullin-4-based RING-type)调控49。AMBRA1(activating molecule in beclin-1-regulated autophagy)主要负责 cyclinD 与 CRL4 的靶向连接，随后 E3 则将泛素蛋白链(ubiquitin,Ub)附着在 cyclinD 上，从而使 cyclinD 被泛素化降解48-49。另外，当 AMBRA1 耗竭或下调时cyclinD 及 Myc(n-Myc、c-Myc)家族蛋白水平升高，并且 Myc 家族蛋白质水平升高的同时还可上调 cyclinD 和 cyclinE 的表达，促进细胞周期的进展48。此外，AMBRA1 水平的降低可能是对 CDK4/6 抑制剂脱敏的机制之一，其可通过增加 cyclinD-CDK4/6 和 cyclinD-CDK2 的形成，从而抵抗 CDK4/6 抑制剂的敏感性50。表明AMBRA1 是 G1-S 期转换的关键调节因子，可控制 G1-S 期的转换，并有助于在 DNA 复制期间保持基因组的完整性减缓发育异常和肿瘤生长。cyclinD-CDK4/6 机制调控过程如图 2A 所示。3 G1 期 cyclinE-CDK2 复合物 在正常细胞周期中，CDK2 通过与 E 型细胞周期蛋白(cyclinE1/E2)结合促进 G1-S 期转换51。并且 E 型细胞周期蛋白与 CDK2 构成的 复合物主要通过使特定底物磷酸化控制细胞周期进程和 DNA 复制51。其中，cyclinE-CDK2通过催化 RB 磷酸化，致使 RB 失去对 E2F 的抑制作用，促进DNA复制相关基因转录和G1-S期转换51-52。此外，由 cyclinD-CDK4/6 激活介导的 RB 磷酸化失活，可通过促进 E2F 释放使 潘剑锋 等/周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展 ：010-64807509： 1531 图 2 G1 期 cyclin-CDK 机制调控过程 Figure 2 The regulation process of cyclin-CDK mechanism in G1-phase.A:Mechanistic regulation of cyclinD-CDK4/6.Growth factor signaling-mediated MAPK signaling and phosphorylated Cdc25A can activate cyclinD-CDK4/6 activity;DNA damage inhibits cyclinD-CDK4/6 activity by activating CKI;cyclinD is inhibited by CRL4AMBRA1 ubiquitination degradation,and lack of CRL4AMBRA1 increases the expression of Myc and cyclinD,promotes cyclinD binding to CDK4/6 and CDK2,and reduces sensitivity to CDK4/6 inhibitors19,43,47-50.B:RB-mediated gene transcriptional regulation.CyclinD-CDK4/6 and cyclinE-CDK2 phosphorylate RB bound to E2F,thereby promoting S-phase related genes and cyclinE translation45,46.C:Mechanistic regulation of cyclinE-CDK2.CyclinE-CDK2 activity is activated by Myc,inhibited by DNA damage-activated CKI,and degraded by ubiquitination by SCF-Skp253,55.cyclinE 表达量升高，从而使 cyclinE 在 G1 期积累44。在G1期积累的cyclinE则通过激活CDK2促进细胞 G1-S 期转换，并且此时 cyclinE 的表达量达到峰值44。到 S 期结束时，cyclinE 被SCF-Skp2 复合物降解，cyclinE-CDK2 活性被消除，直至下一个 G1 期开始53。cyclinE 的 C 端截断和 C 端附近的错义突变可赋予其在体内的高稳定性54。cyclinE-CDK2 的 Thr380 自磷酸化抑制 cyclinE 表达，破坏 cyclinE 的稳定性，而当 Thr380 突变为 Ala 后，cyclinE 稳定性增加54。并且 T380A 突变可消除 cyclinE 的破坏性磷酸化，并阻止 cyclinE 被泛素化降解54。表 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1532 明 cyclinE-CDK2 的激活与 cyclinE 的特异性位点自磷酸化和泛素依赖性降解间的机制联系。此外，Myc 基因家族可通过刺激和抑制关键细胞周期调节因子的表达，在生长控制和细胞周期进程中发挥作用55。并且过表达的 Myc 可通过激活 cyclinE-CDK2，促进 G1-S 期转换55。cyclinE-CDK2 机制调控过程见图 2B。4 S 期 cyclinA-CDK2 复合物 CyclinA-CDK2 是 S 期的标志复合物。cyclinA 表达的阻断及 cyclinA-CDK2 活性的抑制是对正常细胞中细胞周期阶段控制具有特异性的事件，是癌细胞凋亡网络的一部分56。研究发现，在 S 期 cyclinA-CDK2 可通过磷酸化细胞分裂周期 6(cell division cycle 6,Cdc6)，使其从 G1 期的核定位移位到细胞质中，从而调控Cdc6 在启动 DNA 复制过程的作用，阻止 S 期和G2 期的 DNA 再复制57。另外，DNA 复制的启动涉及细胞周期依赖性组装和蛋白质复合物的拆卸，包括起源识别复合物(origin recognition complex,ORC)和Cdc6 AAA(+)ATPases58。其中，ORC 可与 Cdc6 结合形成包含 6 个 AAA+亚基的环状复合物，并通过 Cdc6 将启动目标定位到染色体中的特定 DNA 序列59。并且 Cdc6 和Cdt1(Cdc10-dependent transcript 1)可将微小染色体维持家族(minichromosome maintenance family,MCMs)招募到复制起点，并与 ORC 和Cdc45 结合形成复制前复合物(pre-replication complex)，共同驱动 DNA 生物合成60。另外，在缺乏起源活性的 DNA 上，Cdc6 ATPase 促进 Cdc6 的解离，而具有起源活性的 DNA 则可下调 Cdc6 ATPase 稳定 ORC-Cdc6-DNA 复合物，促进 MCM 加载启动 DNA 复制58。表明特定的 DNA 序列可通过控制 Cdc6 ATPases 的速率，调控 Cdc6 从 ORC-Cdc6-DNA 复合物中解离的速率。此外，cyclinA-CDK2 的磷酸化可导致染色质许可和 DNA 复制因子 1(chromatin licensing and DNA replication factor 1,Cdt1)降解，并且 Cdt1 的降解、Cdc6 的移位以及联会蛋白(geminin)能防止 MCM 与染色质在 S 期结合，从而通过控制复制起点严格限制染色体在每个细胞周期中只复制一次61。综上所述，维持基因组稳定性需要每个细胞周期精确复制一次 DNA，而这一过程可能是通过限制复制起点许可实现，使每个复制起点的触发限制为每个细胞周期一次。此外，正常的 DNA 复制过程中，cyclinA-CDK2 激活受到 Cdc25 的调控，从而保证 DNA的复制受到严格调控62。但随着 DNA 损伤信号 ATM/ATR-Chk1/Chk2 激酶的传导，使 Cdc25暴露出一段降解基序，导致 Cdc25 被泛素化降解62。而 Cdc25 的降解则导致 cyclinA-CDK2中的 CDK2 无法去除抑制性磷酸基团，致使其激活被抑制，细胞周期进程被阻止63。另外，cyclinA-CDK2 可通过磷酸化抑制 RB，促进E2F1/2/3 和 DP1/2 复合物合成 S 期蛋白，从而促进 S 期 DNA 合成64。并且有序的 S 期进展还需要E2F及时失活，cyclinA-CDK2可通过与E2F稳定结合，从而指导 E2F-DP1/2 异构体的磷酸化，中和其 DNA 结合能力，致使其活性降低，保证有序的 S 期进展65。在 S-G2 期转换过程中，cyclinA2 的定位从只在细胞核到既在细胞核又在细胞质的变化，并且只有在细胞质的 cyclinA2-CDK2 可通过 Bora 的磷酸化激活有丝分裂激酶PLK1(polo-like kinase 1)66。表明细胞质中的cyclinA2 可能通过触发 PLK1 的激活调控 S-G2期转换，且细胞质存在的 cyclinA2 受到 DNA 损伤信号调控。而 DNA 损伤信号主要通过 DNA依赖性蛋白激酶(DNA dependent protein kinase,DNA-PK)和ATM/ATR-Chk1/Chk2两条激酶途径 潘剑锋 等/周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶及相关激酶抑制剂在细胞周期进程中的调控机制研究进展 ：010-64807509： 1533 磷酸化激活 p53，促进 CKIs(p21Cip、p27Kip1/2和p57Kip1/2)的表达，抑制 cyclinA-CDK2 活性造成S-G2 期转换停滞67。因此，cyclinA2 核质定位以及 p53 活性的变化，是细胞周期进程中至关重要的事件，是 S-G2 期转换的关键。核糖核酸还原酶(ribonucleotide reductase,RNR)催化用于 DNA 合成的脱氧核糖核苷酸三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphates,dNTP)构建块的从头合成，且 RNR是由两个大的 RRM1 亚基和两个小的 RRM2 亚基组成的异源四聚体68。在 S-G2 期，RRM1 的Ser559 可被 cyclinA-CDK2 磷酸化，并且 RRM1的这种 S559 磷酸化可增强 RNR 活性，维持正常 DNA 复制过程中所需的 dNTPs，确保基因组稳定68。此外，RRM1 S559 磷酸化和 ATR 的联合靶向可触发致命的复制应激和深刻的抗肿瘤作用68。因此，RRM1 的翻译后磷酸化可为精细调节 RNR 和癌症的治疗提供新策略。CyclinA-CDK2 机制调控过程见图 3。5 S 期 cyclinH-CDK7 复合物 CyclinH-CDK7 是调控细胞周期进程的关键复合物，其遗传失活可导致细胞周期停滞，诱发成人干细胞衰竭导致的过早衰老等疾病的发生69。研究发现，cyclinH-CDK7-MAT1(mating-type locus)组成的三聚体复合物 CDK激活激酶(CDK-activating kinase