针灸对肠易激综合征大鼠平滑...能及皮层肌动蛋白表达的影响_赵嘉伟.pdf

年月第卷第期，【论 著】湖北中医药大学学报？针灸对肠易激综合征大鼠平滑肌收缩功能及皮层肌动蛋白表达的影响赵嘉伟，王华（湖北中医药大学针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北武汉）摘要：目的观察针灸对腹泻型肠易激综合征（）大鼠 平 滑肌收缩功能及皮层肌动蛋白（、）表达的影响。方法将只月龄级雌性大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、针灸组组，每组只。以急性应激与慢性应激相结合的方法制备大鼠模型。针刺组选取内关、足三里、关元进行针刺干预，每次干预持续，连续；针灸组在针刺干预的基础上，同时进行艾灸干预。采用蛋白免疫印迹法检测远端 结肠组织蛋白表达水平以及比值。结果与空白组比较，模型组大鼠肠推进率、结肠收缩最大张力、远端结肠组织蛋白表达水平及比值均升高（）；与模型组相比，针刺组、针灸组均表现出肠推进率、离体结肠收缩最大张力明显降低（），达量及的比值明显降低（）；与针刺组相比，针灸组的肠推进率、离体结肠收缩最大张力明显降低（），表达量及的比值明显降低（）。结论针刺干预与针刺艾灸联合干预均能明显改善模型大鼠的肠道动力，并均能明显改善模型大鼠的肠道动力相关重要分子的表达，说明针灸对的 治疗作用与其对皮层肌动蛋白表达水平的调控有关；与单纯针刺干预相比，针刺艾灸联合干预在改善模型大鼠的肠道动力分子指标方面存在更为明显的作用，在改善模型大鼠的肠道动力方面存在明显优势。关键词：肠易激综合征；针灸；肌动蛋白；标本配穴中图分类号：；文献标识码：，（，）：（，）（）（）：，；，基金项目：国家自然科学基金面上项目（项目编号：）；国家中医药管理局岐黄工程项目（国 中医药人教函号）。作者简介：赵嘉伟（），男，湖北中医药大学 级针灸推拿学专业硕士研宄生，研宄方向：针灸效应机制的研究。通信作者：王华（），男，湖 北中医药大学教授，研 宄方向：针灸效应机制的研究，：。湖北中医药大学学报 年月第卷第期？，（）（），（）；，？（），（户），：；肠易激综合征（，）作为慢性发作性肠道疾病的一种 常见病症，其以腹痛、胃胀及大便习惯改变为主要特征。肠易激综合征包含腹泻型、便秘型、混合型以及不 定型在内的种亚型。中 国的 患病 率因地区、年龄、性别等因素有所区别；其中成人的 患病 率约为。本实验所研宄的亚型是（，腹泻 型肠易激综合征）；大多数研宄表明，在我国是的主要亚型。随着现代生活方式的改变以及生活节奏的加快，的发病率越来越高；研宄显示，年龄、性别、肠道菌群失调、饮食习惯、胃肠道感染史、内源性大麻素系统异 常、文化程度、维生素缺乏、家庭收入、精神压力等因素均与的发病相关。以腹痛、腹泻、解稀便（糊状便或水样便为主要临床表现，虽然无性命之虞，但可对患者的曰常社会生活造成不小的困扰。作为临床常见的消化功能紊乱性疾病，己成为针灸科的 临床优势病种。现代医学对于的治疗策略首推采用个体化管理，注重建立包含患者教育、饮食建议、缓解压力的良好医患关系；若患者没有良好反馈，则 需给予药物或非药物的治疗方案。治疗常用药物多选用抗生素，同时使用益生菌来调节肠道微生物群以缓解症状。然而，运用处方药物治疗往往会伴随严重的副作用，而且患者服药过后病 情少有明显改善。多项临床试验表明？，针灸等中医疗法改善了患者的治疗效果，并减少了副作用。有研宄表明，针灸治疗的 临床疗效明显优于西药，对腹痛、腹胀、大便次数及大便异常等均有显著 改善，并且复发率更低。近年来针对病理机制的研宄结 果表明，皮层肌动 蛋白结合蛋白（）与肌动 蛋白（）、肌动 蛋白（）共同作用，通过调节肌动蛋白细胞骨架的结构改变肠道平滑肌细胞的功能，从而改变病理进程中的结肠功 能。本研宄以大鼠为研宄对象，以“标本配穴”针灸治疗为干预手段，通过探讨针灸对肠平滑肌收缩功 能及皮层肌动 蛋白表达的影响，为“标本配穴”针灸治疗的科学内涵提供实验依据。现将研究结 果报道如下。材料与方法实验动物及分组只月龄级雌性大鼠，体质量（），由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物许可证号：（京）。放置于环境温度，湿度 环境中适应性喂养周，采用随机数字法分为空白组、模型组、针灸组、针刺组各只，实验严格遵守科技部号文件关于善待实验动物的指导性意 见要求。主要仪器及试剂 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；生物张力传感器（成都泰盟软件有限公司）；电泳仪电源、垂直电泳槽、电转仪（北京六一仪器厂）；酶标仪（）；中研太和一次性使用针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司）；季福 堂细艾条（岳阳市艾健堂生物科技有限公司）。兔多抗（杭州贤至生物有限公司，批号：）；兔多抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号：）；兔多抗（北京博奥森年月第卷第期，湖北中医药大学学报？生物技术有限公司，批号：）；兔多抗（武汉三鹰生物技术有限 公司，批号：）。模型 制备以急性应激与慢性应激相 结合的方法制备大鼠模型，参照文献方法，将大鼠暴露于种不同的压力源：（）禁水；（）禁食；（）夹尾巴；（）暴露于（：环境丨；（）放置于（：水中游泳；（）白天和夜晚倒置；（）水平振动（）。上述应激方案每随机应用，且连续无重复特定的压力源，制备时间持续周。随后休息 喂养周，在第天时进行急性束缚应激，包裹肩部，上肢前肢和胸廓。干预方法自制鼠衣固定大鼠，参照实验针灸学和实验动物常用穴位名称与定位第部分：大鼠？，选取内关、足三里、关元。“内关”穴位于大鼠前肢内侧、离腕关节约左右的尺桡骨缝间；“关元”位于大鼠肚脐下 约处；“足三里”穴位于膝关节下 外侧，腓骨小头下方约处。针刺组：选用中研太和一次性针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司）直刺，针刺深度为，以平补平泻手法行针，每隔行针，重复次，最后次行针毕后取针，每次干预持续，连续。针灸组：在针刺干预的基础上，同时将直径为季福堂细艾条（岳阳市艾健堂生物科技有限 公司）悬放于穴位上约处，刺激强度以大鼠耐受情况而定，每 次干预持续，连续。空白组和模型组不行干预治疗。指标检测肠推进率：干预治疗结束后，大鼠剥夺食物，在取材前检测各组大鼠小肠推进率。配置营养性半固定糊状物，用其对大鼠进行灌胃处理并等待，随后用颈椎脱白法将大鼠处死，开腹，分离出胃部及小肠部，用手术缝合线结扎幽门处和回盲部肠段，将肠道平铺在操作台上，测量两结扎部位间长度，即小肠全长，记为；测量幽门和糊状物到达小肠最远处的距离，记为；通过计算可得，小肠推进率。离体结肠平滑肌条收缩实验：用颈椎脱白法将大鼠处死，开腹，在盲肠下处，剥 离并修剪出约的结肠肠管，以手术缝合线将其一端与固定钩连接，以纵行肌方向悬挂于浴槽中，浴槽中盛有温度为的溶液，并持续通有混合气体；缝合线另一端与张力环能器相连。先平衡，接着给与左右的张力，继续平衡。肌条收缩稳定后，滴加 溴化乙酰胆碱（）溶液，使得浴槽内的浓度依 次处于、，每个浓度平衡左右，观察纵行肌条最大张力在不同浓度药物下的变化情况。蛋白免疫印迹（）法检测结肠组织活性以及表达：样品制备：将少量剪碎的结肠组织与裂解液混合，匀浆后置于冰上充分裂解，提取上清液制备蛋白样品，用法测 定蛋白浓度。将蛋白上清与蛋白上样缓冲液（体积比按照：）混合，煮沸备用。各样品总蛋白量为明，配置凝胶进行电泳，转模，封闭，加入（：）、（：）、（：）、：）抗。孵育过夜，力口入二抗（：）摇床孵育，滴加试剂显影，定影，扫描胶片，用分析胶片灰度值。统计学方法所有 数 据 均采用软件进行统计分析，定量资料采用均 数标准差的方式进行统计。若资料服从正态分 布，多组间 比较采用单因素方 差分 析；多重检验时，若方 差齐采用检测法进行两 两检验，若方差不齐则采用检测法进行两两检验。计数数 据采用（）表示，采用；检验比较率的显著性。以尸为存在具有 统计学意义。结果各组大鼠的肠推进率比较与空白组对比，模型组和针刺治疗组的肠推进率显著增快（），针灸组无明显差异）；与模型组对比，针刺组、针灸组的肠推进率显著变慢（）；与针刺组对比，针灸组的肠推进率显著变慢（）。见表。表各组肠推进率比较（元）组别肠推进率（）空白组模型组针灸组针刺组与空白组比较，；与模型组比较，；与针刺组比较，。各组大鼠离体结肠收缩的比较湖北中医药大学学报 年月第卷第期，？在中，四组大鼠的离体肌条最大张力无明显差异）；在中，模型组的离体肌条 最大张力明显提高，与空白组、针灸干预两组有明显差异（），但两组组间比较无统计学差异）；在中，模型组的离体肌条最大张力显著提高，与 空白组、针灸干预两组有明显差异），同时针刺组和针灸组出现显著 性 差 异）。见表，图。表各组大鼠 离体结肠收缩比较（）浓度组另丨（）（）（）空白组 模型组 针灸组 针刺组 土士与 空白组比较，；与模型组比较，；与针刺组比较，图中各组离体结肠收缩比较各组大鼠结肠组织蛋白水平、比值比较与空白组对比，模型组与针刺组、针灸组的？表达量及的 比值明显增高（）；与模型 组对比，针刺组、针灸组的表达量及的 比值明显增高（）；与针刺组对比，针灸组的表达 量及的比值明显降低（）。见图和表。空内组模增绀针灸祖针刺姐图各组结肠组织、凝胶电泳图表各组结肠相对表达量比较）组别相对表达量比值空白组模型组 针灸组针刺组 与空白组比较，；与模型组比较，租；与针刺组比较，？讨论在祖国传 统医学理论当中，与相对应的为“肠郁”，主要有腹痛、腹泻等症状，其关键病机当为心神 失调，气机紊乱，肠腑失司。针灸疗法因其操作简便、效 果明显等优势，在临床治疗中得到广泛运用。在的针灸治疗中，配穴方法对最终的治疗结局影响重大。本课题组依据中医针灸“治病求本”思想 和标本理论，提出了局部选穴或随证选取“标穴”疏导经气，以利导邪气排除；选取固护先 天之气（元气）和 后天之气（胃气）的“本穴”，调动机体正气，以增 强抗邪能力，在的针灸临床治疗中取得了良好的疗效。本课题组所选用 的内关穴（标穴）为心包经要穴，与脾经、胃经等诸条经脉连属 相关，可调心神，通畅气机，与现代医学中教导患者舒缓压力的治疗方略不谋而合。关元穴（本穴）则是任脉的腹部腧穴，是小肠募穴、足三阴经与任脉交会穴，是一身元气之起点，可固护人先天之本；足三里（本穴）为胃经合穴，可补中益气，通调腑气，固护 后天之本。三穴共用，调心神，通肠腑，以从心论治、标本兼治。在标本配穴的治疗策略基础上，艾灸疗法也是在的临床针灸治疗中常用的治疗手段。本草纲目当中记载，艾具有“温中，逐冷，除湿”作用；而艾灸疗法是通过发挥其温热特性，作用于特定的穴位或者部位，起到 治病去病、保健强身等疗效的一种治疗方法。艾灸疗法对于以脾、肾不 足、湿邪为患引起的的疗效尤其明显。肠道动力异 常是的关键生理病理表现，患者可存在胃排空 障碍、结肠收缩小肠移行性复合运动 异常及传输紊乱等涉及多部位、多形式的动力异常。与健康人群相比，可导致患者的结肠传输速度显著增快；而的主要症状即为肠道动力 加快引起的腹泻。因此，结肠本身收缩活动的异 常 是的重要机制之一，而评价肠道动力和致泻、止泻作用的重要指标即为肠推进率与 离体结肠收缩最 大 张力？。本年月第卷第期，湖北中医药大学学报？课题组研宄结 果表明，与模型组相比，针刺组、针灸组均表现出肠推进率、离体结肠收缩最大张力明显降低（），说明针刺干预与针刺艾灸联合干预均 能明显改善模型大鼠的肠道动力；与针刺组相比，针灸组的肠推进率、离体结肠收缩最 大 张力明显降低（），说明与单纯针刺干预相比，针刺艾灸联合干预在改善模型大鼠的肠道动力方面存在明显优势，可对结肠蠕动异常增快的大鼠起到抑制作用，使其结肠蠕动频率趋于正常。属于肌动 蛋白结合蛋白家族，在细胞骨架的细胞运动中扮演不可替代的角色；其位于染色体，并由 个氨基酸共同构成。根据的氨基酸序列，它包含个重要的结构域：个端酸性区（）、个肌动蛋白重复结 构域和个端结构域。一个螺旋和一个富含脯氨酸的区域位于蛋白质的中心部分，介 于肌动 蛋白重复结构域和结构域之间。丰富的皮层结构使得具有独特的功 能，可兼具收缩、保持细胞的形状、运动、细胞间黏附等。、是细胞中肌动蛋白的不同存在形式，其中为单体形式，而以寡聚体及聚合体的形式存在。两种 不同 的肌动蛋白在细胞中的平衡可由进行调节，从而影响平滑肌细胞的收缩功 能，进而改善肠道的收缩功能、调节肠道动力。本研宄 结果显示，与模型组相比，针刺组、针灸组均表现出表达量及的比值明显降低），说明针刺干预与针刺艾灸联合干预均 能明显改善模型大鼠的肠道动力相关重要分子的表达，说明“标本配穴”针灸疗法对的治疗作用与其对皮层肌动蛋白表达水平的调控有关；与针刺组相比，针灸组的表达量及的比值明显降低（），说明与单纯针刺干预相比，针刺艾灸联合千预在改善模型大鼠的肠道动力分子指标方面存在 更为明显的作用。综上所述，本研宄选用“标本配穴”法治疗大鼠，通过检测模型大鼠平滑肌收缩功 能以及皮层肌动 蛋白表达水平的影响探究其作用机制。此外，本研宄对“标本配穴”法中针刺单纯干预、针刺艾灸联合干预这两种干预手段治疗的效应差异进行比较，进而为针灸临床治疗方案的制定提供更充实的实验证据与理论依据，有助于“标本配穴”疗法在临床治疗中的推广。参考文献：，：，？，（）：赵尔樱，周佳玮，褚海云，等肠易激综合征流行病学与致病因素研宄进展中国公共卫生，：，？，（）：王娇娇，储浩然，吴立斌储浩然针灸治疗腹泻型肠易激综合征经验探析中国针灸，（）：郭静，孙建华，陈潘，等针刺双向调节效应“调神健脾”法针刺治疗肠易激综合征多中心随机对照试验亚组分析中国针灸，（）：吴帆，唐丽娜，王华，等标本配穴针灸对大鼠肠黏膜机械屏障的影响时珍国医国药，（）：，？：，：李佳，薛艳，王华，等电针足三里穴对肠易激综合征大鼠平滑肌收缩功能及皮层肌动 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