原核启动子文库构建的研究进展_喻林兵.pdf

第 3 期第 53 卷基金项目：上海市自然科学基金面上项目（编号：22ZR1444000）；国家自然科学基金面上项目（编号：32272300）。作者简介：喻林兵(1994)，男，硕士，研究方向：食品微生物。电话：[phone]，E-mail:。*通信作者：熊智强(1981)，男，教授，博士，研究方向：食品微生物。E-mail:。原核启动子文库构建的研究进展喻林兵，郑丽圆，李宛莹，夏永军，王光强，艾连中，熊智强*上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093摘要：启动子是在转录水平上调节基因表达的关键元件，启动子文库广泛应用在代谢工程和合成生物学专业中，主要用于调节基因表达和优化代谢物生物合成。运用启动子对多基因通路中的基因表达进行合理和精确控制，可显著影响代谢通量分布，优化特定目标代谢物的合成。因此，国内外已有大量关于鉴定天然启动子，构建和设计组成型、诱导型、杂交启动子或人工合成启动子文库的研究。文章简要介绍原核启动子的结构和功能，对基于生物信息学的启动子预测和识别及人工构建启动子文库策略的最新进展进行了归纳总结，以期为原核微生物的代谢工程和合成生物学应用提供帮助。关键词：原核微生物；启动子；识别和预测；文库构建doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.026第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023启动子是细胞在转录水平上实现基因高效、精准表达调控的重要元件1。为调节代谢网络的通量平衡、提高目标产物产量并减少副产物生成，代谢途径中各基因组合表达通常需要一系列不同强度的启动子2。但可用的内源性启动子通常情况下较为有限且缺乏定量表征，因此通过构建启动子文库获取大量具有不同强度功能的启动子成为必然趋势。近年来启动子文库的构建策略主要涉及易错 PCR、核苷酸类似物、非保守序列随机化突变和混合启动子工程合理设计等，但这些非理性和半理性方法往往需要结合高通量筛选，才能获得不同强度梯度分布的启动子文库。随着合成生物学和人工智能工具的快速发展与更新，基于生物信息学和机器学习进行启动子序列和强度规律解析、人工预测及 AI 从头设计可能成为现实3。本文简要介绍原核启动子的结构特性，并对近年来原核启动子预测和识别方法及原核启动子文库的构建策略展开综述，以期为启动子文库的发展提供帮助。1原核启动子结构特性启动子是位于转录起始位点附近的一段 DNA序列，在距转录起点1001000个碱基对的范围内4，能够与 RNA 聚合酶特异性相结合实现转录过程5。在原核生物中，完整的启动子由核心启动子和上游调控元件（UP 元件）组成。典型的原核启动子保守区域包括转录起始位点（TSS）、-35 区（Sextama 框）、-10区（Pribnow 框）和间隔区（见图 1）。大肠杆菌中常见的 70 识别启 动子在-10 区中具 有共有序列TATAAT，-35 区有 TTGACA，这两个基序之间的典型间隔长度为 171 nt。然而，-10 区和-35 区的核苷酸在革兰氏阳性细菌谷氨酸棒状杆菌中的保守性较低6。TSS 位于起始密码子的上游，当 因子与 RNA聚合酶结合成全酶招募到 TSS 时，引发转录开始7-8。细菌启动子的 UP 元件在转录起始过程中也可以与RNA 聚合酶的 亚基相互作用9。原核启动子通常含有转录因子结合位点（Transcription factor-binding97-第 3 期第 53 卷工业微生物sites，TFBSs），允许细胞根据外部刺激和细胞状态调节基因表达10-11。在起始密码子之前不参与编码的碱基序列中还含有一个非编码 DNA 区域（5UTR），可以在转录和翻译水平上影响基因表达。原核启动子在 5 UTR 中具有保守的核糖体结合位（RBS），即 SD（Shine-Dalgarno）序列，会显著影响翻译效果12-13。因此，通过调节这些元素，可实现原核启动子的文库构建和工程化设计。图 1典型原核启动子序列示意图2 启动子序列的预测和识别当前已基于生物信息学和计算方法学开发出PromPredict、Promotech 和 Sigma70Pred 等多种原核启动子预测工具（见表 1），可借助这些工具从细菌基因组中批量预测和识别启动子序列14。预测流程主要包括数据集构建、特征提取/选择、分类算法、训练模型与测试和网络服务器14。CASSIANO 等使用大肠杆菌中充分表征的 70 启动子序列和随机序列 对 启 动 子 预 测 工 具（BPROM、MULTiPly、bTSSfinder、iPromoter-2L、BacPP、IBBP、iPro70-FMWin、Virtual Footprint、70ProPred 和 CNNProm）从特异性、敏感性、准确性和马修斯相关系数等指标方面进行性能比较，发现 iPro70-FMWin 结果最佳，优于使用广泛的 BPROM 原核启动子预测工具15。原核启动子的预测也不再局限于初步的分类，还增加了对启动子类型和强度的鉴定。例如 iPromoter-BnCNN、pcPromoter-CNN、MULTiPly 等模型具有双层结构，第一层能够对启动子进行预测，第二层则对启动子 类型进行分类16-18。2L-iPSW(word2vec)、iPromoter-ET、iPSW(2L)-PseKNC 等模型的第一层也是预测启动子，而第二层是对启动子进行强弱分类19-21。大部分预测模型都是基于大肠杆菌 RegulonDB数据库和枯草芽孢杆菌 DBTBS 数据库创建的基准数据集，但由于不同物种的 DNA 结合蛋白和 因子有其特殊性，因此需要补充更多微生物启动子基准数据集，以构建出具有广泛适用性的预测工具，用于精确预测和识别原核启动子。3启动子文库构建策略3.1易错 PCR易错 PCR 是一种简单的体外随机诱变方法，可有效获得多样化的启动子序列36。ZHAO 等运用易错 PCR 将 Trc 启动子（Ptrc）连续迭代 83 轮后，构建了一个由 3 665 个不同变体组成的组成型启动子文库，其中最强和最弱的启动子强度相差 454 倍，最强突变体 PML1118 比原始 Ptrc 强 69 倍，比 1 mmol/L异丙基-d-硫代半乳糖苷诱导的 T7 启动子强1.52 倍37。张国强等利用易错 PCR 方法对麦芽糖诱导型启动子 Pglvc 进行突变构建诱导性启动子库，麦芽糖诱导剂的响应范围从 03 g/L 扩展至 015 g/L，最强启动子 MT8 绿色荧光蛋白表达水平比 Pglvc提高了约 3.15 倍38。易错 PCR 突变范围广且操作简便，能够获得不同强度的启动子，但其突变率低，目的片段大小与 GC 含量都会影响突变效率，且后续的实验筛选还需费时费力。因此需要优化条件，采用多轮易错 PCR 来提高突变率。3.2核苷酸类似物诱变在 PCR 过程中随机插入 dPTP 和 8-oxo-dGTP等核苷酸类似物引起突变构建启动子文库。尽管dPTP（AG；TC；GA；CT 突变率最高可达19%）和 8-oxo-dGTP（AC；TG 突变率可达 2%）诱导的突变存在明显偏差，但仍然可以在没有插入和缺失的情况下引起大量碱基变化。ALPER 等通过添加 dPTP 和 8-oxo-dGTP 使噬菌体 PL-启动子扩增，获得了 22 个不同强度的启动子，其表达活性差异高达 196 倍39。MENG 等利用核苷酸类似物对 Trc启动子和 RBS 序列进行随机突变，筛选出 100 个强度范围为 03.559 的突变启动子，用于训练基于人工神经网络的启动子预测模型；并基于构建的启动子模型设计出具有期望强度的启动子，选择 3 个设计元件 s14（强度 0.56）、s05（强度 1）和 s21（强度2.50）在大肠杆菌中异源表达东亚钳蝎毒素 Bmk1，s21 调控蛋白表达水平是 s14 的 5.69 倍40。与传统易错 PCR 相比，核苷酸类似物诱变通过扩增 DNA周期来控制启动子突变率（最高达 20%），但其具有较强碱基偏好性（A：TG：C 突变约占 65%），严重SpacerTSS5-35-10RBS3ATGUP ElementCore Promoter Region98-第 3 期第 53 卷喻林兵等：原核启动子文库构建的研究进展影响启动子序列的多样性，且多为负向突变，需要结合高通量方法进行启动子筛选。3.3 非保守序列随机化非保守区不与 RNA 聚合酶直接结合，但可以促进调控蛋白与启动子的识别和特异性结合，进而改变靶基因的表达水平。因此，对非保守区域随机突变能够产生不同强度的启动子。HAN 等针对 PsrfA 启动子-10 区上游 7 bp 热点区域展开了两轮连续进表 1原核启动子预测工具比较序号工具基准数据集（启动子来源）特征提取分类算法1PromPredict1145（E.coli）615（B.subtilis）82（M.tuberculosis）GC content;averageFree energyBetween the averagefree energy2Promotech27766（13bacterial species）RF-HOT；RF-TETRARNN;RF3Sigma70Pred741（E.coli 70）PSTNP;PseEIIP;Dimer count;GC andAT skew;NucleotideCompositionSVM;RNN,CNN-LSTM;LSTM-CNN-LSTM4SAPPHIRE.CNN2113（P.aeruginosa 70）2928（S.enterica）One-hotCNN5iProm70166（54）One-hot;Nucleotide ChemicalPropertiesCNN6iPro2L-CLA3382（E.coli）Capsule networks layer;Bi-LSTM layerCNN;LSTM7bTSSfinder3597（E.coli）12797（Nostoc）351（Synchesis）1471（S.elongatus）PWM;Physicochemicalproperties/Mahalanobis distanceANN8IBBP1888（E.coli 70）Image-based andEvolutionary approachSVM9iPro70-FMWin741（E.coli 70）k-mer;g-gappedk-mer;Pattern finding;Positioning distancecount/AdaboostLR10iPromoter-2L2860（E.coli）Multi-window-basedPseKNCRF11MULTiPly2860（E.coli）Bi-profile bayes;KNN；k-mer;DAC/F-scoreSVM12deepPromoter3382（E.coli）Combination ofContinuous FastTextN-Grams/MRMDCNN13GSCNN156（B.subtilis 54）Gibb Sampling；PWMCNN14iPromoter-FSEn741（E.coli 70）Nucleotide Statistics;k-mer;EL15iPro-GAN1860（E.coli 70）92（E.coli 54）162（E.coli 38）307（E.coli 32）141（E.coli 28）517（E.coli 24）623（Unknow type）Physicochemicalproperties ofdinucleotide;MSAGAN-CD注：PWM：位置权重矩阵；KNN：k 近邻算法；DAC：基于二核苷酸的自协方差；ANN：人工神经网络；SVM：支持向量机；PLS：偏最小二乘法；HMM；隐马尔可夫模型；RF：随机森林；LR：逻辑回归；CNN：卷积神经网络；LDA：线性判别分析；IFS：增量特征选择；EL：集成学习；GAN：生成对抗网络；RNN：循环神经网络；LSTM：长短期记忆网络14。评价策略Training and validation10-fold grid search cross-validation5-fold cross validation;Independent test5-fold cross-validation5-fold cross-validation;Independent testIndependent test10-fold cross-validationvalidation;Jackknife test5-fold cross-validation;Jackknife test;Independent test5-fold cross-validation5-fold cross-validation10-fold cross-validation10-fold cross-validation参考文献22232425262728293031183233343599-第 3 期第 53 卷工业微生物化，构建的启动子突变库中最强突变体 PBH4 的强度比 PsrfA 高约 3 倍，采用 PBH4 表达-葡萄糖醛酸酶活性（8.90.1 U/mL）是 PsrfA 的 14.8 倍41。SIEGI 等将放线菌组成型启动子 ermEp1 的-10 区和-35 区上游、中间和下游的非保守序列随机化，以gusA 为报告基因创建了一个强度范围为 2%319%的启动子库，最强的启动子 P21 表达糖多孢红霉菌rppA 基因，III 型聚酮合酶产量比 ermEp1 高 3.1 倍42。WEI 等 基 于 谷 氨 酸 棒 杆 菌 启 动 子-10（NNTANANT）与-35（NNGNCN）共有区域及 RBS（AAAGGA）元件通过非保守序列随机化构建启动子库，从低、中、高强度组中随机选取 L6、M6 和 H6 优化苏氨酸生物合成途径，最后优化菌株苏氨酸效价（12.8 g/L）比对照菌株高 6.1 倍43。非保守序列随机化半理性设计广泛应用于原核生物启动子库的构建中，增强了随机化区域的可选择性，增加启动子序列的多样性，有利于生成强度变化范围广泛的启动子库。尽管该方法设计简便，但存在引物序列较长、成本较高等问题。3.4杂合启动子工程杂合启动子工程指将不同来源的上游元件和核心启动子区域进行组装，生成新启动子以调控转录效率的一项研究44-45。例如，大肠杆菌常用的 Tac 启动子就是通过融合 Trp 启动子-35 区和 Lac 启动子-10 区获得46。ZHANG 等47构建了一个由两个P69 启动子串联组成的 P70 启动子，其强度分别比P69 和 Tac 启动子高 28%和 121%倍。ZHOU 等创造了一个新型超强启动子 Pcpc560，由 cpcB 基因的两个预测启动子和 14 个预测的 TFBSs 组成；蓝细菌集胞藻 S.6803 中采用 Pcpc560 分别表达反式烯酰辅酶 A 还原酶和 D-乳酸脱氢酶，其蛋白表达量可达总可溶性蛋白的 15%48。与天然启动子相比，杂合启动子工程能获得转录更强的启动子，有效解决了某些菌株缺乏高活性启动子的问题。3.5启动子与核糖体结合位点（RBS）组合启动子/RNA 聚合酶和 RBS/核糖体的相互作用决定着转录或翻译的起始过程，是基因表达的限速步骤49-50。KOSURI 等将大肠杆菌 114 个启动子和111 个 RBS 随机组合，创建了一个包含 12 653 个构建体的文库，GFP 荧光强度的变化范围跨越 4 个数量级51。DUAN 等在谷氨酸棒状杆菌中将 6 种不同强度的启动子与 11 种不同强度的 RBS/bc-RBS（双顺反子修饰的 RBS）进行组合，GFP 表达水平跨越 4个数量级；通过将启动子和 RBS 进行组合优化精氨酸合成途径，优化后的菌株精氨酸（45.1 g/L）和瓜氨酸（35.2 g/L）产量分别是原始菌株的 1.6 倍和 2.35倍52。相较于前 5 种文库构建策略，启动子与 RBS组合是双文库的集成，有助于构建具有更广强度变化范围的启动子文库，可实现对转录和翻译水平的双层调控。3.6转录组测序技术（RNA-seq）RNA-seq 结合生物信息学方法对启动子进行预测和识别，可高效便捷地获得具有不同转录强度的启动子，因此该技术已被广泛用于构建原核微生物启动子库。MA 等53在 pH 为 7.4 和 pH 为 5.5 的条件下，通过 RNA-seq 分析从单增李斯特菌中鉴定出21 个启动子，其中有 7 个组成型启动子表现出比强启动子 Phelp 更高的强度（1.85.4 倍），5 个组成型启动子表现出比 Phelp 更高的脲酶 B 亚基（UreB）活性（1.18.3 倍）。汪舒颖等在厌氧和有氧两种培养条件下分别对单增李斯特氏菌 EGDe 进行 RNA-seq分析，筛选出 18 个候选强启动子，最强的 Pan4 启动子绿色荧光蛋白表达水平是单增李斯特菌常用Phly 启动子的 7.8 倍，能够成功调控天青蛋白和 毒素表达54。本课题组前期在葡萄糖和乳糖两种不同碳源培养基条件下，采用 RNA-seq 从嗜热链球菌S-3 中筛选出 18 个组成型启动子，其中 7 个强启动子强度均高于乳酸菌目前已知的最强组成型启动子P3255。此外，在葡萄糖和麦芽糖作为碳源的前提下，使用 RNA-seq 从唾液乳杆菌 AR809 中筛选出 32个具有不同强度的内源性组成型启动子，丰富了乳酸菌启动子元件库，为乳酸菌代谢调控奠定了坚实基础56。RNA-seq 作为一种高效便捷且准确的高通量筛选工具，突破了启动子文库构建中基于报告基因筛选的局限性，能快速筛选和表征启动子强度。4 结论与展望研究者们基于易错 PCR、核苷酸诱变和非保守序列随机化等策略已成功构建出强度范围广泛分布的启动子文库，但这些构建方法往往是非理性或半100-第 3 期第 53 卷理性的，费时且效率低，需要和高通量筛选方法结合使用。除大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌等少数模式生物外，在乳酸菌等其他原核微生物中仍缺乏足够的启动子元件和合适的模型用于理性设计，难以实现基于核苷酸序列直接预测启动子强度的目标。随着合成生物学新技术、单细胞测序技术、高通量生物检测新装备、生物信息学及机器学习等的快速发展，基于统计分析和人工智能的启动子从头设计已成为可能3，人工合成启动子文库构建对于未来启动子序列或元件的设计而言更加理性化，能够实现启动子强度的模型精确预测，可从头定量设计具有期望强度的启动子，建立适用于多物种的启动子识别和强度预测的通用模型。笔者相信对生命内在复杂机制的深入了解和标准化元件数据库的积累，将有助构建高精度的预测模型用于所需特征的启动子人工定制和从头合成。参考文献1 KEASLING J D.Synthetic biology for synthetic chemistryJ.ACS Chem Biol,2008,3(1):64-76.2 余君涵,马雯雯,王智文,等.人工合成启动子文库研究进展 J.微生物学通报,2016,43(1):198-204.3 于慧敏,郑煜堃,杜岩,等.合成生物学研究中的微生物启动子工程策略 J.合成生物学,2021,2(4):598-611.4 KANHEREA,BANSALM.Structuralpropertiesofpromoters:similaritiesanddifferencesbetweenprokaryotesandeukaryotes J.Nucleic Acids Research,2005,33(10):3165-3175.5PERRON G G,WHYTE L,TURNBAUGH P J,et al.Functionalcharacterizationofbacteriaisolatedfromancient arctic soil exposes diverse resistance mechanisms tomodern antibiotics J.PLoS One,2015,10(3):e0069533.6 PATEK M,NESVERA J.Sigma factors and promoters inCorynebacterium glutamicum J.J 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