考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量.pdf

食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES1602009 Vol135 No15(Tot al 257)考马斯亮蓝法测定果汁中蛋白质的含量3黄婉玉,曹炜,李菁,朱青,常丹(西北大学化工学院食品科学与工程系,陕西 西安,710069)摘 要 采用考马斯亮蓝法,对不同果汁中的蛋白质含量进行了测定。结果表明:蛋白质浓度在10-80g/mL内与吸光度有良好的线性关系(R2=0.996 4);样品平均回收率(n=3)分别为9912%、9818%、10118%,RSD分别为0164%、0181%和0158%(n=3)。该方法具有快速、灵敏度高、重现性好等特点。关键词 果汁,蛋白质,考马斯亮蓝,含量,测定第一作者:硕士研究生(曹炜副教授为通讯作者)。3 陕西省农业科技攻关计划(2006K02-G4)收稿日期:2008-12-02,改回日期:2009-04-02 在浓缩果汁和果汁饮料生产中,后混浊一直是影响产品质量的关键因素之一,它不仅可以破坏产品的感官质量,甚至可以导致果汁发生沉淀。形成果汁后混浊的因素很多,其中,酚类氧化聚合成大分子物质或酚类与蛋白质形成的聚合物是导致果汁后混浊的主要因素1。Beveridage等人在研究苹果汁混浊成分时,发现果汁中蛋白质的含量与混浊的形成密切相关2,3。因此,测定果汁中的蛋白质含量对控制果汁后混浊尤为重要。食品中蛋白质含量的测量方法有紫外吸收法、凯氏定氮法、福林2酚比色法、考马斯亮蓝法等4。紫外吸收法在测定酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质时,有一定的误差;福林2酚比色法是灵敏度较高的方法之一,但是,由于果汁中酚类及柠檬酸的干扰,导致测定结果偏高;凯氏定氮法是测定粗蛋白质的经典方法,但由于样品中非蛋白质含氮化合物的干扰,使得测定结果不能完全反映被测样品中真实蛋白质的含量;考马斯亮蓝比色法是由Bradford等人建立的1种测定微量蛋白质的方法5,考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成的蓝色蛋白质2染料复合物,在595 nm处有最大吸光度,复合物1 h内保持稳定。在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质2染料复合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质含量的测定。该方法不受酚类化合物和游离氨基酸的干扰617,具有快速,稳定,灵敏度高,测量结果准确等特点。本文采用考马斯亮蓝比色法测定了不同果汁中蛋白质的含量,并对该方法的线性关系、回收率、精密度、稳定性等进行了考察,旨为建立1种测定果汁蛋白质的新方法,以便优化果汁加工工艺,提高果汁的品质。1 材料与方法111 实验材料红枣汁按照文献8方法制备:选取完整无霉烂的红枣,去核后切分小块,加入红枣质量4倍的纯净水进行打浆,在浆液中加入016 g/L果胶酶,50 下酶解2 h后于8 000 r/min条件下离心10 min,上清液中加入011 g/L的壳聚糖进行澄清,8 000 r/min离心10 min,将离心后的红枣汁经超滤得到红枣澄清汁,澄清后的红枣汁置于-18 冰箱中冷冻待用;苹果汁,鲜橙汁,葡萄汁,水蜜桃汁等均为市购;考马斯亮蓝G2250(分析纯)购自中国医药公司,小牛血清白蛋白(生化试剂)购自西安沃尔森生物技术有限公司,其余试剂均为分析纯。112 实验仪器751-GD型紫外可见光分光光度计(上海分析仪器厂);LNG2TM2018超滤试验机(上海朗极化工科技有限公司);HH22数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);打浆机(美国ACA公司);BS 200S2WE1电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);LXJ2B型高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。113 溶液的配制小牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取牛血清白蛋白1014 mg,用蒸馏水定溶至100 mL,配成104g/mL的标准溶液,置于4 冰箱中备用。考马斯亮蓝G2250溶液的配制:准确称取考马斯亮蓝G2250 60 mg,溶于100 mL 30 g/L的过氯酸溶液中,用滤纸过滤,将滤液置于棕色试剂瓶中备用。114 果汁中蛋白质含量的测定方法 4准确移取一定量经活性炭脱色后的果汁置于试分析与检测2009年第35卷第5期(总第257期)161管中,加入210 mL考马斯亮蓝G-250溶液,用蒸馏水定容至410 mL,摇匀,在室温下反应10 min,以空白(不加果汁)溶液作参比溶液,用7512GD型分光光度计于595 nm波长处测定样品组的吸光度,2 结果与分析211 标准曲线的绘制在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液010、012、014、016、018、110、112、114 mL,加蒸馏水至2 mL,配制成浓度为010、1014、2018、3112、4116、5012、6214、7218g/mL的蛋白质标准溶液,然后在各支试管中分别加入210 mL考马斯亮蓝G2250溶液,摇匀,在595 nm波长处测定吸光度,以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。回归方程为Y=01008 3X+01144 9(R2=01996 4),小牛血清白蛋白浓度10-80g/mL内与其吸光度呈良好的线性关系。212 精密度实验精密移取牛血清白蛋白标准溶液6份,按照114方法测定蛋白质的含量,结果表明蛋白质吸光度的RSD为0186%。213稳定性试验在同一果汁中加入210 mL考马斯亮蓝G2250溶液,摇匀,在8 h内,每隔1 h测定1次蛋白质含量,计算其RSD值。由实验结果可知,同一果汁蛋白质含量的RSD为117%,表明8 h内溶液稳定性良好。214 重复性实验取一定量果汁6份按114实验方法进行检测,计算其蛋白质含量的RSD值。结果表明蛋白质含量的RSD值为0196%,表明其重复性好。215 加样回收率实验在1 mL红枣汁中分别准确加入牛血清白蛋白标准溶液012 mL、013 mL和014 mL、用蒸馏水补足至210 mL,再加入210 mL考马斯亮蓝G2250溶液,摇匀,测定蛋白质含量,并计算回收率。结果见表1。表1 回收率结果本底量/g加标量/g测定的总量/g回收率/%RSD/%5612561256121212418136241486719673166821139913981810118016401810158 结果表明,回收率为9818%-10118%,平均加样回收率为99197%,RSD值为0158%-0181%,平均RSD为0168%,准确度较高,符合测定要求。216 不同果汁中蛋白质含量的测定按114的方法测定不同果汁中的蛋白质含量,每种样品取3份,3次测定的平均值作为该种果汁蛋白质含量的实测值,结果见表2。表2 不同果汁蛋白质含量(n=3)样品蛋白质含/gmL-1RSD/%红枣汁56120156苹果汁12120124鲜橙汁82120181葡萄汁62170119水蜜桃汁11180169 从表2中可知,不同种类果汁中蛋白质含量各不相同,鲜橙汁中的蛋白质含量最高为8212g/mL,葡萄汁次之为6217g/mL,红枣汁为5612g/mL,水蜜桃汁中的蛋白质含量最低,仅为1118g/mL,由此可见,不同果汁的蛋白质含量存在较大差异。217 干扰试验在一定浓度的小牛血清白蛋白溶液中加入不同浓度的酚类物质和氨基酸,按照211的方法分别测定考马斯亮蓝2蛋白质复合物的吸光度,结果见表3。表3 没食子酸和甘氨酸对考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量的干扰干扰物浓度/gmL-1吸光度(A)没食子酸甘氨酸2511013540135950120135401358751301359013581040135101356对照组0135601356 由表3可知,不同浓度的没食子酸和甘氨酸对考马斯亮蓝2小牛血清白蛋白复合物的吸光度没有明显干扰。3 结论采用考马斯亮蓝比色法测定果汁中的蛋白质含量时,用小牛血清白蛋白作为对照品,其浓度在一定范围内与吸光度有良好的线性关系,样品平均回收率(n=3)分别为9912%、9818%、10118%,RSD分别为0164%、0181%和0158%,该法具有精密度高、稳定性和重现性好,不受酚类和游离氨基酸的影响,对设备要求较低,适合大量果汁样品的测定等优点。本文仅对果汁中蛋白质含量进行了测定,其中的蛋白质的种类和单体含量有待进一步深入研究。食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES1622009 Vol135 No15(Tot al 257)参考文献1Beveridge T,Harrison J E,Weintraub SE1Procyanidincontributions to haze formation in an aerobically pro2duced apple juice haze J 1Lebensmittel Wissenschaftand Technologic,1997,30:594-601.2Siebert KJ,Carrasco A1Formation of protein2polyphe2nol hazes in beverages J 1Journal of Agricultural andFood Chemistry,1996,44:1 997-2 005.3Siebert 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recovery rate were 99.2%,98.2%,101.8%,respectively,RSDs were 0.64%,0.81%and 0.58%respectively.A rapid,sensitive,and accuratemethod for the determination of protein content in juice was found.Key wordsjuice,protein,coomassie brilliant blue,content,determination 市场动态饮料机械将随饮料市场火热走俏市场我国目前生产果汁厂家大约有6 000家,具有一定规模的饮料企业有1 000多家,拥有职工20万余人,年销售收入600多亿元,年创利税60多亿元。全国饮料总产量保持持续稳定增长,1980年年产不足30万t,1990年猛增到330万t,到2000年为1 490万t,20年增长50多倍,平均年增长速度为21.8%。2001年达1670万t,比2000年增长11.94%,持续保持2位数以上的增长速度,是食品工业中发展最快的行业之一。随着饮料市场的发展,饮料设备的发展也进入了一个新发展空间。我国的饮料工业迅速的发展,产量迅猛增长,品种也迅速增多,为了满足中小型企业和大型生产饮料企业,饮料机械厂家针对不同企业,不断创新,研究出适合饮料生产厂家的设备。饮料加工机械分前处理机械、后处理机械、包装机械、装箱码垛机械等,主要有:清洗机械、分级(筛选)机械、粉碎机械、打浆机、榨汁机、分离机械、均质机械、过滤机械、浓缩机械、热交换机械、水处理设备、汽水混合机、提香机、杀菌机械、灌装设备、装箱码垛设备以及冷饮成套设备等。由于中小型企业,资金不足,企业一般采用“小型饮料生产线”,可有效降低饮料企业的投资成本、促进饮料工业的发展。小型饮料生产线由于价格适中、顺应消费潮流,因此,十分适合中小型饮料企业使用,将具有十分广阔的市场空间。对于高速度、高产量的大型饮料企业,他们对饮料机械要求比较高。首先,从多功能来讲:同一台设备,可进行茶饮料、咖啡饮料、豆乳饮料和果汁饮料等多种饮料的热灌装;均可进行玻璃瓶与聚酯瓶的灌装。其次,技术含量高、可靠性高:全线的自控水平高和全线效率高。在线检测装置和计量装置配套完备,能自动检测各项参数、计量精确。集机、电、气、光、磁为一体的高新技术产品不断涌现。最后,速度高、产量高:对于碳酸饮料来说,灌装速度好的灌装机的最高能达到2 000灌/min,其灌装机的灌装阀分别达到165头、144头、178头。非碳酸饮料灌装机的灌装阀50-100头,灌装速度最高能达到1 500灌/min。因此,饮料机械行业在竞争中谋求发展、壮大,在技术上不断更新力度,不断提高产品质量和品牌意识,将会赢得更多饮料企业的青睐。