实验性膜迷路积水的造模方法及其特点[1].pdf

1 9 4 医学耳鼻咽喉科学分册 2 0 0 4年 7 月第 2 8 卷第 4 期!盟 g 0 l 鲤 丛 !塑：!Q !垫：实验性膜迷路积水的造模方法及其特点 牟忠林韩德 民汪若峰 摘要 膜迷路积水 的动物模 型是研究梅尼埃病发病机制、病理特征、生理改变和治疗方法 的重要工具，本文就 目前建立膜迷路积水动物模型方法及其特点、机制作一综述。关键词 模型，动物(M o d e l s，A n i m a 1)；膜迷路积水(H y d r o l a b y r i n t h)梅尼埃病为一常见病，典型的症状为发作性眩 晕、听力下降、耳鸣伴恶心、呕吐，严重影响人们 生活，如果在驾驶、高空作业或潜水时发作，还可 造成意外死亡。自1 8 6 1 年法 国医生 P r o s p e r Me n i e r e 首次报道以来，其发病机制学说很多，但 目前尚无 定论，因此也 无 治本措 施及预 防方 法。1 9 3 8年 H a ll p i k e和 C a i r n s 认为梅尼埃病人的病理特征为膜 迷路积水(h y d r o l a b y r i n t h，曾用名“内淋 巴水肿”e n d o l y m p h a t i c h y d r o p s)后 J，这一结论逐渐被 学 者们证实。此后，很多学者经动物造模，作了大量 研究。本文就 目前建立膜迷路积水动物模型的方法 及其特点、机制作一综述。实验性膜迷路积水大致 有四种方法，分述如下。【阻塞内淋巴管导致膜迷路积水】阻塞内淋 巴管可以阻断内淋 巴从前庭暗细胞和血管纹的边缘 细胞纵向流入内淋巴囊，造成膜迷路积水。K i m u r a，Ma n n i，A l b e 等破坏 豚 鼠、猴、猫 等动物 的 内淋巴囊或阻塞其 内淋巴管造成膜迷路积水，结果 豚鼠积水发生率最高，且积水程度随术后存活 时间延长而加重，1 周约 5 8，2 4周约 7 8，1 2月为 1 0 0，平均 8 0 3。病理改变 以顶转最 重。A l b e r s 报道术后 1 月，仅顶转少量毛细胞缺 损，并且多为第 3列外毛细胞。术后 2个月，外毛 细胞缺损加重，并有向下扩展趋势，且内毛细胞亦 出现缺损。电镜下血管纹边缘细胞退行性改变，空 泡化、萎缩，基底细胞间隙增大。前庭膜间皮细胞 层间隙增大。蜗管内细胞外衣糖蛋白减少，毛细胞 纤毛间的相互联系消失。计算机图像分析积水程度。正常蜗管截面积 由 底向顶递减，评价积水程度不宜采用绝对值。现多 作者单位：5 7 2 0 0 0 三亚，海南省三亚市人民医院(牟忠林)；首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科(韩德 民、汪 若峰)通信作者：牟忠林(E m a i l：m u z h o n g l i n 2 s i n&c o m)综 述耳 科 学 用积水后增加值与正常值之 比，可选用面积或长 度。王宜南等认为选择中阶面积AS S和前庭膜长 度 L L所得结果无显著性差异，选择点计数与绝 对值所得结果亦无显著性差异。另有一种解释是因为阻塞内淋 巴管使 c a 超 负荷和氧 自由基的产生，导致膜迷路积水。S h i n o-m o il在阻塞豚鼠内淋 巴管前 2 4小时腹膜 内注射别 嘌呤醇(5 0 m g K g d a y，黄嘌呤氧化酶的拮抗剂及 氧 自由基清除剂)1 7欠 天，共 1 5天。两周后治疗 组颞骨连续切片膜蜗管总体积仅增加 3 3 8 ，注 射生理盐水组则增加 6 5 1，两组间 P=0 0 0 7。同时治疗组血管纹等内耳结构的萎缩发生率也低于 对照组。【注射血管加压素导致膜迷路积水】血管加 压素也称抗利尿激素、垂体加压素。很多证据表明 血管加压素与膜迷路积水密切相关。S z i k l a i 等用放 射性示踪的 H-V P注入侧脑室，只在外淋巴观察到 示踪物，故认为血管加压素对内淋巴的影响可能是 通过外淋 巴侧 的血管纹发挥生理效应 的。M e e s 用膜染色法证实耳蜗内存在血管加压素受体，分别 为 V 1和 V 2两种亚型。用 V 1 受体拮抗剂能阻遏血 管加压素诱发的内淋 巴电位化。V 2受体激动剂则 引起血管加压素样的可逆性的内淋巴电位降低，可 能 V 2受 体 激 活 腺 苷 酸 环 化 酶 使 胞 内 c A M P 升高。腹腔注射血管加压素(0 2单位 g 天)2小 时后处死豚鼠，按 R e i s s n e r 膜的膨胀程度作为计算 膜迷路积水的分度依据，结果 4 0(8 2 0)轻中 度积水。慢性 积水是 通过 皮下 注射 血管 加压素(0 5 单位 g 天)6 0天，4 1 0重度积水，3 1 0轻 中度积水。T a k e d a 豚鼠背皮下植入微渗透压泵，泵率为 0 5 1 0 0 2 i t h。分别 予血管 加压素 2 0 0 1 U k g mi n(0 5 7 n g k g m i n)，400 1L U k g mi n(1 1 4 n g 维普资讯 http:/ F o r e i g n Me d i c a l S c i e n c e s，J u t y 2 0 0 4，v o L 2 8 N o 4 k g mi n)，l O 0 0 1x U k g mi n(2 8 6 n g k g mi n)，对 照组使用生理盐水，1 周后放射免疫检测血浆中血 管加压素的浓度和颞骨切片观察积水程度。结果血 浆中高浓度的血管加压素(3 51 4 0 p g m l，4 0 0 1 0 0 0 1 U k g m i n)可导致膜迷路积水。3 5 p g m l 是正常人血浆血管加压素浓度 的上限，1 4 0 p g m l 几乎是梅尼埃病人急性期的浓度 。在梅尼埃病 和其他具有膜迷路积水的病人血管加压素 明显升 高，并且与眩晕密切相关。血管加压素能刺激血管 纹和半规管上皮 c A M P，引起膜迷路积水。血管加 压素引起诱发电位、耳蜗微音电位、听神经复合动 作 电位下降，一 s P升高。这些结果均与耳蜗 电图的 改变吻合“。I 标记 A r g 8-力 压素显示人类和豚 鼠内淋巴囊 均有显著的放射性标记，表明内淋巴囊是血管加压 素依赖性调控器官。培养的大 鼠内淋巴囊上皮组织 对荧光素异硫氰酸盐葡聚糖的摄取作用被血管加压 素所抑制。若给予血管加压素的同时给予 V 2受体 拮抗剂 H-9 4 0 0时，这种抑制作用可以避免，表明 淋巴囊的血管加压素作用是通过 V 2受体亚型。血 管加 压素通 过 V 2受体诱 导 内淋 巴囊 上 皮细胞 A Q P 2 表达发生改变，使水的重吸收减少，可导致 膜迷路积水“。血管加压素可结合 v 2受体，通 过 G蛋 白信号 通路激 活腺 苷酸环化 酶，使胞 内 c A M P浓度升高，导致 A Q P 2移位。A Q P 2基 因中 包含一段 c A M P依赖性蛋白激酶的作用序列，定位 在 2 5 3-2 5 6(A r g A r g G l u S e r)残基。A Q P 2蛋 白在 2 5 6位苏氨酸的磷酸化是 c A M P引起水通透性增高 的原因 引。内淋巴囊培养时血管加压素可抑制富 含核糖体的上皮细胞(亮细胞)代谢，促使 A Q P 2 合成并从内淋巴囊细胞内转移至膜表面，增加内淋 巴囊上皮细胞水通透性。正常状态下，A Q P 2弥漫 分布于内淋巴囊上皮细胞浆，血管加压素可抑制富 含核糖体 的内淋 巴囊上皮 细胞(亮细胞)代 谢，促使 A Q P 2合成并从 内淋 巴囊细胞 内转 移至膜表 面，增加内淋巴囊细胞水通透性 j。K i t a n o 合成特异性引物，应用 R T P C R检测血 管加压素 V 2受体和环状肽催产素受体转录。血管 加压素 V 2受体和环状肽催产素受体 m R N A s 在大 鼠内耳的表达表明血管加压素在调节 内耳液体平衡 中起作用 。R T P C R筛选多个大 鼠耳蜗、睾丸和肾脏存在 A Q P 2 转 录，并且 没有组织特异性 突变。耳蜗 中 1 9 5 A Q P 2转录水平较后两者低 1 0倍，We s t e r n b l o t 显 示有一 2 9 k D a 带。在大 鼠耳蜗，A Q P 2主要在内淋 巴的周围结构表达，包括 R e i s s n e r 膜，C o r t i 氏器，内外沟细胞 和螺旋缘。1 2例梅 尼埃病 人 的 A Q P 2 筛选没有发现 A Q P 2的 4个外显子编码和内含子一 外显子连接的序列改变或突变，所以 A Q P 2与梅尼 埃病的关系还有待进一步研究 。【免疫方法导致膜迷路积水】近年来许多学 者注意到膜迷路积水与 自身免疫有关，特别是内淋 巴囊的局部免疫反应具有十分密切关系。先用钥孔 蜮血蓝素(K L H)全身致敏豚 鼠，然后在内淋 巴 囊注入 K L H，5 7小时后耳蜗基底转开始 出现积 水，2 7天耳蜗各转积水快速发展并发展到最大 程度，2 8周积水渐渐减少 。豚 鼠内淋巴注入 K L H，1 天后，每只耳蜗侧壁、螺旋器和螺旋神经 节都发生可诱导性一氧化氮合酶免疫反应，高浓度 一氧化氮诱发膜迷路积水 。健 康 豚 鼠 1 8只，取 2 5 to o l L 6 一 氨 基 己酸 0 7 m l，酵母多糖 8 0 m g加入 豚 鼠血清 1 m l。另取 2 5 m o l L 6 一 氨基 己酸0 7 m l 加入豚鼠血清 1 m l 作为 对照。用酵母多糖活化豚鼠血清中的补体，将其上 清液行豚鼠颈动脉注射，对受试动物进行听功能和 形态学观察。其中 7耳(7 2 0)发生了轻度积水，表明以补体激活为特点的型变态反应可能参与了 膜迷路积水 j。L e e用辣根过氧化物酶注入 已致 敏的2 0只豚鼠内淋巴囊，其中 1 1只积水。有学者发现合并食物外过敏的梅尼埃病患者在 食物变应原激发时，听力下降并出现眼震。免疫治 疗后眩晕发作 的次数和严重程度均改善。免疫治疗 的目的是减低超敏反应 和缓解 I g E介导 的过敏症 状，其机制主要有三种理论：降低循 环 I g E水 平，诱导对变应原产生耐受性；产生 I g G封闭抗 体；炎性介质的耗损。【两期法形成膜迷路积水】D u n n e b i e r 创立 了两期法形成膜迷路积水的豚鼠模型。健康 白化雌 性豚鼠，先经颅后窝入路破坏内淋巴囊远侧端，术 后第 3 周起予腹膜 内注射肾上腺皮质醇(A l d o s t r o B e)1 0 0 p g 1 0 0 g 天，共 5天，3周后全麻下处死。耳蜗脱钙，切片染 色，光镜下将水肿程 度分为 4 度：1、对照组无积水；2、单用 A l d o s t r o n e组轻度 积水，血管纹 的边缘细胞活性增加；3、单纯手术 组，主要在蜗顶积水，血管纹边缘细胞、前庭膜及 感觉上皮变性；4、新方法可诱发 中重度积水，甚 维普资讯 http:/ 1 9 6 国外医学耳鼻咽喉科学分册 2 0 0 4年 7月第 2 8卷第 4期 O t o l a r v n g o l o F o m i g n Me d i c a l S c i e n c e s，J u l y 2 0 0 4，v o 1 2 8 N o 4 至不可逆病理改变。8 8 耳蜗 中及底转积水最重，这可能与底转至顶转 的 N a ，K -A T P酶逐渐减少 有关。N a ，K A T P酶可导致 内淋 巴 K 分泌增 加和内淋巴增多。内淋巴囊柱状上皮细胞被立方上 皮细胞取代，少许残存者严重水肿。细胞侧 间隙 增 大 加 。【几种动物模型比较】如前所述，阻塞内淋 巴管造成膜迷路积水的积水发生率最高，所需时间 长，病理改变以顶转最重要，而 A l d o s t r o n e 引起的 膜迷路积水发生在中底转，两期法形成膜迷路积水 的豚鼠模型既有阻塞 内淋巴管的缓慢积水过程，也 有因 A l d o s t r o n e 诱发的急性增压，可解释许多梅尼 埃病的症状，如波动性感音神经性听力下降，底转 积水导致高频听力下降。免疫导致膜迷路积 水 的发生率较低，所需观察时间较长。阻塞 内 淋 巴管可以阻断内淋巴从前庭暗细胞和血管纹的边 缘细胞纵向流人内淋巴囊，但阻断之后就不能观察 到内淋巴囊在内淋巴变化时的调节作用。与该方法 相比，注射血管加压素产生膜迷路积水能观察到内 淋巴囊在内淋巴变化时的作用，并且国外有人报道 血管加压素对 V 2受体 G s a G i l a 可产生浓度依赖性 刺激。血管加压素可通过对 c A M P对 C R E和 A P 1 的双重作 用介导 A Q P 2启始基 因 的表 达、转导、转录。综上所述，建立膜迷路积水的动物模型已成为 研究梅尼埃病发病机制、病理特征、生理改变和治 疗方法的重要手段，其中血管加压素及 A Q P 2与梅 尼埃病的关系尤其值得关注。我们应该根据具体的 研究 目的，选择不同的造模方法。参考文献 1 Hall p e CS。Ca i r n s H Ob s e r v a t i o n s o n t he p a tho l o g y o f Me me ms s y n d r o me J L a r y n g o l Ot o 1 1 9 3 8；5 3：6 2 5 5 5 2 Ki mu r a RS，S c hi u k n e c ht HF Me l n b r t n o u s hy d r o p s i n the i n n e r e a l o f the g u i ne a p i g a f t e r o b l i t e r a ti o n o f the e n d o l y mp h e ti c s a c Pr a t t Ot o-r h i n o l a r y n g o 1 1 9 6 5；2 7：3 4 3 3 王宜南，刘兆华 用计算机图像分析技术研究膜迷路积水 中 华耳鼻咽喉科杂志 1 9 9 6；3 1：1 3 9 1 4 1 4 A l b e l F W。Ve l d ma n J E。Hu i z i n g E H_ E a r l y h a i r c e l l l o s s i n e x lr i me n t a l h y d r o p Ann Ot o l Rh i n o l I ar y n gu1 1 9 8 7；96：2 8 2-2 85 5 A l b e l F W，d e G roo t J C，V e l d ma n J E e t a 1 Ul t r a s t r u e t u r e o f the s t r i a V S S S S and Re i s s n e r s me mb r a n e i n e x p e r i me n t a h y d r o p s A c t a O t o-l a r y ng o L 1 98 7；1 0 4：2 0 2-21 0 6 S h i n o mo r l Y，Ki mu r a R S Al l o p u r i n o l a t t e n ua t e s e n d o l y mph a t i e h y d r o p s i n the gu i n e a p i g c o c h l e a O R L J(o r h i n o l a r y n g o l Re l a t S p e c 2 0 01；6 3：26 7-271 7 S z i k l a i I，F e r r a r y E，St e r k e r s O，e t a 1 Va s u p r e s s in e n t r y i nto the i n n e r e a r fl ui d s o f t h e r a t He a r Re s 1 98 7；2 9：2 45-2 5 0 8 Me e s K，He r z o g V，Ma u r e r I Ho r mo n e r e c e pt o r s i n the i n n er e a r L a r y n g o r h i n o t o l o g i e 1 9 8 9；6 8：2 25 3 30 9 Ku ma g a mi H，L o e we n h e i m H，Be i t z E，e t a 1 Th e e ff e c t o f a nti-d i ur e t i c h o rm o n e o n the e n d o l y mph a fic s a c o f the i nn e r e a r P t l u g e r s Ar c h 1 9 9 8；43 6：9 7 0-9 7 5 1 0 T a k e d a T，Ta k e da S，Ki t a n o H，e t a 1 En do l y mp h a t i c hy d r o ps i n d uc e d b y c h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f v a s o p r e s s i n H e a r RO s 2 0 0 0；1 4 0：1 1 1 T a k e d a T，K a k i g i A，S a i t o H A n fi d i u r e t i e h o r mo n e(A DH)and e n d o l y mp h a t i c h y d r o p s Ac t a Ot o l a r y n g o 1 1 9 95；S u p pl 51 9：21 9-2 2 2 1 2 Ba i L，F us h i mi K，S a s a k i S，e t a 1 S t r u c t u r e o f a q u a p o r i n-2 v a s o p r e s s in w a t e r c h a r me L J B io l C h e r m 1 9 9 6：2 7 1：5 1 7 1-5 1 7 6 1 3 Ki t a n o H，T a k e da T，S u z uk i M，e t a 1 Va s o p r e s s i n an d o x y t ocin r e c e p-t o r mRNAs a r e e x p r e s s e d i n the rat i nn e r e a r Ne u ror e p o r t1 9 9 7；8：2 2 8 9-2 2 92 1 4 Mh a t r e AN，J e ro J，C h i a p p i n i I，e t a 1 A q u a pe r i n-2 e x p r e s s i o n in the ma n ma l i a n c ochle a and i n v e s ti g a tio n o f i t s r o l e in Me n i e r es d i s e a s e He ar R e s 2 0 o 2：1 7 0：5 9-6 9 1 5 J J e l u a n A N，D o mh o ff e r J L，A r e n b e r g I K，e t a 1 De m o n s t r a ti o n o f a l l t ean t i b o di e s t o the e nd o l y mph a fi c s a c i n Me ni e r e s d i s e a s eL r ngo-s c o p e 1 99 7；1 0 7：21 1-21 5 1 6 Wa t a n a b e K，T o mi y a ma S。J i nno u s h i k E x p r e s s i o n o f in d u c i b l e n i t r i c o x i de s y ntha s e i n the c oc hle a f o l l o wi n g i mmu n e r e s p o ns e in the e n d o l y mp h a t i c s a c o f gu i n e a p i g s OR L J O t o r h i n o l a r y n l Re l a t S p e c 2 0 01；6 3：1 5 5 1 5 9 1 7 王红生，赵沛英，李志光，等 补体活化与膜迷路积水 中华 耳鼻咽喉科杂志 1 9 9 4；6：3 7 1 1 8 L e e F P Ho r几 Hu an g T S En d o l y mp h a t i e h y d r o p s i n ani m a l e x p e r i me n ts A c o n fir ma t i o n o f mec h a n i c a l an d i mmu no l o g i c a l me t ho d s o f i n d u c e me n t Ac t a Ot o l a r y n guL 1 9 91；S u p p l 4 8 5：1 8-25 1 9 No e l l CA，Ro l and P S，Ma b r y RL，e ta1I n h a l a n tall e rgyan dMe n i e r e s d i s e a s e：U s e o f e l e c t roc ochle o g r a p h y an d int r a n a s a l a l l e r g e n c h a l l e n g e a s i n v e s fi ga tinn al t o o l s Ot o l a r y n g o l He a d Neck S u 晤 2 0 01；1 2 5：3 4 6-3 5 0 2 0 Du nn e b i e r E A，S e g e n h o u t J M，w i t H P，e t a 1 T w o p h a s e e n d o l y mp h a t i e h y d r o p s：a n e w d y n e gu i n e a p i g mo de l Ac t a Ot o l a m L 1 9 9 7；1 1 7：1 3 1 9 2 1 Du nn e b i e r E A，S e g e n h o u t J M，Di k F，e t a1 C ochle a r ult r a s t r u c t u r e in t wo-p h a s e e n d o l y mp ha t i c h y d r o p s i n the gu i ne a-pi g Eu r Ar c h Ot o d u no l a r y ng o L 2 0 0 2；2 5 9：1 7-2 3 2 2 Ve r h e ul J，S e g e n h o u t J M，D u nn e b i e r E A U h r a s t r u c t u r e o f the e n d o l y mp h a ti e s a c in two ph a s e e n d o l y mph e fic h y d r o p s i n the g I I Tme a pi n Ac t a Ot o l a r y n g o L 1 9 9 9；1 1 9：3 4 5-3 5 0 2 3 Ya s ui M，Ze l e n i n S M，Ce l s i G，e t a 1 Ad e n y l a t e c y c l a s e c o u pl e d v gl s o-p r e s s i n r e c e p t o r a c ti v a t e s A Q P 2 p ro m o t e r v i a a d u al e ff ect o n C 肛 an d AP I e l e me n t s A m J P h y s i o 1 1 9 9 7：2 7 2：F 4 4 3-4 5 0 (收稿 日期：2 0 0 3-0 6-0 2)维普资讯 http:/