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土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。
关键词：土壤淀粉酶产生菌 分离纯化 发酵培养 透明圈法 生理生化试验
正文：
1、 土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化
1.1 实验原理
在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这就是纯种分离法的原理。
在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。
淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4大类。产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘变为蓝色的特性，将分离的微生物接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色，判断是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
从微生物群体中经分离、生长，在平板上形成的肉眼可见的菌落，不一定是单个细胞生长繁殖而成的，有的可能来自2个或者多个细胞。因此，纯培养的确定观察菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。甚至有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
1.2 实验器材
1.2.1 材料 土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、PDA培养基、99ml无菌水1瓶（带玻璃珠）、5支9ml无菌水/试管等。
1.2.2 用具 无菌培养基、无菌吸管、无菌水、酒精灯、无菌涂布棒（又名扩散棒、三角棒）、接种环、生物洁净工作台、生化培养箱、人工智能培养箱、手动菌落计数器（SC6）、移液器、移液枪、试管、三角瓶、显微镜等。
1.3 实验过程
1.3.1 土壤稀释液的制备
称取土壤，制备稀释度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。
1.3.2 稀释平板法从土样中分离真菌
先在无菌培养皿中加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL，再加入马铃薯培养基，充分混匀铺平并凝固后倒置于28~30℃恒温培养5~6d，培养完成后观察真菌菌落形态。结果如图1所示，培养基上分布有多个菌落，根据颜色判断为有两种真菌，一种正面为青色，背面为肉色，有9个菌落，另一种正面为墨绿色，背面为黑色，有霉味，有3个菌落。
图1 稀释平板法分离真菌结果
1.3.3 平板涂抹法分离土壤中的放线菌
先在无菌培养皿中倒入适量淀粉培养基，铺成平板，凝固后，再加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL，用无菌三角玻棒在平板表面涂抹均匀，倒置于28~30℃条件下培养3~4d，观察放线菌菌落形态。结果如图2所示，并没有分离得到单菌落，而只有菌苔，颜色为黄色，有泥腥味。没有出现单菌落可能是操作出现差错，因为稀释度为10-7，并没有偏大，所以可能是操作的问题。
图2 平板涂抹法分离放线菌结果
1.3.4 平板划线法分离土壤中的细菌
先在无菌培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基，制成平板，再用分区划线法挑取稀释度为10-2的土壤稀释液一环在平板上划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~30℃培养。观察细菌菌落形态，结果如图3所示，有肉眼可见的单菌落，直径约为3mm，颜色为肉色，有臭味。
图3 平板划线法分离细菌结果
1.3.5 用划线分离法对淀粉酶产生菌进行分离纯化
1.3.5.1 在分离出真菌的马铃薯培养基的平板上滴加碘液，如图4所示，可以看出仅有一个菌落的水解圈较大符合要求，挑取该菌落，在淀粉培养基上进行划线分离，倒置30℃培养。结果如图5所示。
图4 滴加碘液后的马铃薯培养基
图5 淀粉培养基上分离纯化得到的真菌
1.3.5.2 在分离出细菌的牛肉膏蛋白胨培养基上挑取单菌落，在淀粉培养基上进行划线分离，倒置30℃培养，结果如图6所示，有单菌落。
图6 淀粉培养基上分离纯化得到的细菌
1.3.5.3 将淀粉培养基上分离纯化得到的单菌落接种到斜面培养基上，培养至成熟，待用。
1.4 结果与分析
1.4.1 由图1观察可得真菌的菌落特征，本实验中分离得到的为霉菌，有两种，一种正面为青色，背面为肉色，另一种正面为墨绿色，背面为黑色，有霉味，菌落较大且疏松，菌落比较干燥，用接种环挑取菌落时较难，说明与培养基结合牢固。
1.4.2 由图2观察可得放线菌的菌落特征，本实验中没有得到单菌落，为菌苔，比较干燥，颜色为黄色，菌落较小，分布紧密，带有泥腥味。
1.4.3 由图3观察可得细菌的菌落特征，菌落小且突起，直径约为3mm，较湿，颜色为肉色，有臭味，用用接种环挑取单菌落时较容易，说明不与培养基结合。
1.4.4 由图4观察知有一个菌落的水解圈直径较大，为淀粉酶产生菌。
1.5 结论
1.5.1 对土壤中微生物进行分离筛选，观察各种微生物的菌落形态，本次实验结果如表1-1所示。
表1-1 土壤中微生物菌落特征
微生物类别 菌 落 特 征
霉菌
放线菌
细菌
含水状态
干燥
较干燥
较湿
外观形态
大而疏松
小而紧密
小而突起
菌落透明度
不透明
不透明
稍透明
菌落与培养基结合程度
结合较牢固
结合牢固
不结合
菌落颜色
青色和墨绿色
黄色
肉色
气味
霉味
泥腥味
臭味

1.5.2 在淀粉培养基上分离得到的单菌落，为淀粉酶产生菌，再接种到斜面上进行培养，作为后续实验的材料。
2、淀粉酶产生菌的发酵培养
2.1 实验原理
微生物发酵是生物工程的重要组成和基础。它主要是利用微生物的特定性状，通过现代工程技术进行工业化生产有用物质的技术体系。微生物发酵既是开发生物资源的关键技术，又是生物技术产业化的重要环节。
根据微生物发酵方式的不同，可以将发酵分为固态发酵和液态发酵。固态发酵又称固体发酵，是一种传统的发酵方法，即将发酵的固体原料按一定的比例与一定量水分混合后进行灭菌，然后接种菌种。液态发酵又称为液体发酵，将所用原料配成液体状态，接种菌种进行发酵。液态发酵又可分为浅盘发酵和液体深层发酵。液体深层发酵采用密闭的发酵罐，在罐中进行发酵。
液体发酵大致分为三大工序：种子培养，发酵，提取。
2.2 实验器材
2.2.1 菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，前期实验分离得到的菌种。
2.2.2 仪器：超净工作台、恒温培养箱、摇床、发酵罐、发酵尾气分析仪、移液器、接种环、酒精灯、记号笔等。
2.2.3 培养基：液体发酵培养基
2.3 实验过程
2.3.1 摇瓶发酵
2.3.1.1 种子培养：取活化好的菌种由斜面培养基转接入盛有30mL种子培养基的250mL锥形瓶内，与转速180-220r/min旋转式摇床上30℃培养1-2天。
2.3.1.2 发酵：吸取培养好的种子液3mL，接入多个盛有30mL发酵培养基的的锥形瓶内，于180-220r/min恒温摇床上30℃培养2-3天。
2.3.1.3 提取：取发酵液20mL，平均分配到两个离心管中，12000r/min离心10min，分别收取上清液和菌体，分别保存在冰箱中。
2.3.2 全自动发酵罐的基本了解
全班同学分为两批由老师介绍全自动发酵罐的基本构造和基本操作方法。
2.4 结果与分析
本次实验得到的上清液为黄色，菌体为淡黄色。保留，作为后续试验淀粉酶活性测定及微生物生理化反应的材料。
3、淀粉酶的活性测定
3.1 实验原理
淀粉酶包括几种催化特点不同的成员，其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下一份子麦芽糖，又被称为糖化酶。产淀粉酶的微生物在以可溶性淀粉为底物配置的固体培养基生长，其菌落周围的培养基会由白色变成灰色且透明，形成透明圈。在一定浓度范围内，透明圈的直径d与淀粉酶活力的大小（对数值）成正比。以已知浓度的淀粉酶为对照，制作透明圈与淀粉酶活力标准曲线。从样品的透明圈直径大小可在标准曲线上求得其淀粉酶活性大小。由于本方法是直接测定方法，而且灵敏度高，不需要特殊设备，故被广泛采用。
3.2 实验器材
3.2.1 菌种：产淀粉酶微生物
3.2.2 培养基：培养基Ⅱ：培养基Ⅰ加2g/L的可溶性淀粉和2g/L的琼脂，透明圈测定使用。
3.2.3 仪器和其他用具：摇床、恒温培养箱、纸片、移液枪、镊子、淀粉酶标准品、尺子、小试管、容量瓶、离心机。
3.3 实验过程
3.3.1 取取浓度为1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL，6mg/mL的淀粉标准溶液和样品，滴于纸片上，使用6个培养基，每副培养皿放置4张纸片，置于培养基的方式简单表示如下：
1 2 3 4 5 6 1 x 5 x 6 x
2 1 4 3 6 5 x 1 x 5 x 6
置放完成之后，在37℃恒温培养箱中培养18-20h。
3.3.2 透明圈直径的测定
培养完成后取出，在培养基上滴加碘液，一段时间后，测定透明圈直径（cm），结果如表3-1所示：
表3-1 标准淀粉酶溶液及样品透明圈直径（cm）记录表
1mg/mL
2.55
2.7

2mg/mL
2.75
3

3mg/mL
3
3.05

4mg/mL
3.2
3.3

5mg/mL
3.25
3.3

6mg/mL
3.25
3.32

样品
3.1
3.1
2.75
3.35

样品的透明圈直径第3组实验数据与前两组相差较大（分别为2.6cm和2.55cm），故舍去。
3.4 结果与分析
3.4.1 标准曲线
测得的透明圈直径取平均值，淀粉酶溶液浓度换算为酶活力，制得表3-2如下：
表3-2 标准淀粉酶溶液数据处理结果表
序号
透明圈直径（cm）
淀粉酶活力（U/g）
淀粉酶活力对数值
1
2.625
3700
3.568
2
2.875
7400
3.869
3
3.025
11100
4.045
4
3.250
14800
4.170
5
3.275
18500
4.267
6
3.285
22200
4.346
根据数据处理结果作标准曲线，如图1所示
图1 标准曲线
3.4.2 样品酶活力计算
实验测得样品的透明圈直径平均值为3.067cm，根据标准曲线所得线性方程y=0.916x-0.6487，计算得样品的淀粉酶活力对数值为4.056，从而得出样品的淀粉酶活力为11376.3U/g。
3.5 结论
3.5.1 绘制标准曲线得线性方程为y=0.916x-0.6487。
3.5.2 被测发酵液样品的淀粉酶活力大小为11376.3U/g。
4、淀粉酶产生菌的初步鉴定（生理生化试验）
4.1 实验原理
细菌的代谢与呼吸主要取决于酶的催化作用，各种细菌具有不同的酶系组成，因此表现在对某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情况不同，代谢产物也有所不同，有些微生物能分泌淀粉酶将淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖；而另一些微生物分泌脂肪酶，将脂肪水解为甘油和脂肪酸。葡萄糖进入细胞后，不同细菌经不同途径发酵葡萄糖，产生不同的代谢产物。这不但充分体现了细菌代谢类型的多样性。同时，微生物对碳氮化合物的分解利用的生理生化反应也是微生物菌种鉴定的重要依据之一。
4.1.1 糖发酵实验 糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是他们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产生酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可用指示剂来显示，在配制糖发酵培养基时，已预先加入溴甲酚紫（pH6.8以上时呈紫色，pH5.2以下时呈黄色）。当细菌发酵糖而产酸时，会使培养液由原来的紫色变为黄色。气体的产生可由糖发酵管中倒立的德汉氏小管中有无气泡来指示。
4.1.2 V.P试验 V.P试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸，丙酮酸进行缩合、脱羧后，产生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被空气中的氧气氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基起作用生成红色化合物，此即为V.P阳性反应。当试管中加α-萘酚时可以促进反应的出现。
4.1.3 甲基红试验 甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。在细菌代谢糖产生酸的过程时，培养基就会变酸，使加入培养基中的甲基红指示剂由橙黄色（pH6.2）转变为红色（pH4.4），即甲基红反应。
4.2 实验器材
4.2.1 菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期实验分离得到的产淀粉酶菌株等。
4.2.2 培养基：糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨培养基、胰蛋白胨水培养基。
4.2.3 试剂：甲基红试剂、40％KOH、5％α-萘酚等。
4.3 实验过程
4.3.1 糖发酵实验
分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期分离到的未知菌于糖发酵液体培养基（葡萄糖、乳糖）中，另一支不接种，37℃培养24h后，取出观察是否有颜色变化及是否有气体产生。接种有大肠杆菌的培养液变成黄色，并且有气体产生，其他三支试管均无明显现象。如图4-1所示为葡萄糖发酵液体培养基的结果，图4-2为乳糖发酵液体培养基的结果。
图4-1 葡萄糖发酵实验结果图
图4-2 乳糖发酵实验结果图
4.3.2 V.P试验
分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期分离到的未知菌于葡萄糖蛋白胨培养基中，另一支不接种，37℃培养24h后，在三支菌管内加40％KOH20滴，再加等量的α-萘酚溶液，拔去硅胶塞，用力振荡后于37℃保温30min，取出观察是否出现红色。接种有枯草芽孢杆菌的培养液变成红色，其他均无明显现象。如图4-3所示为加入40％KOH和α-萘酚之前的结果。。（由于在实验过程中往接有枯草芽孢杆菌的试管中加α-萘酚时出现意外，打翻了一部分，但并没有影响到结果的观察，但之后并没有拍照，因此没有实验结果图。）
图4-3 V.P试验加入试剂之前的结果图
4.3.3 甲基红试验
分别接种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、前期分离到的未知菌于葡萄糖蛋白胨培养基中，另一支不接种，37℃培养24h后，在培养液中加入M.R试剂2滴，观察是否出现红色。接种有大肠杆菌的培养液变成红色，其他均无明显现象。如图4-4所示为加入甲基红之前的结果，图4-5为加入甲基红之后的结果。
图4-4 甲基红试验甲基红加入之前结果图
图4-5 甲基红试验加入甲基红之后结果图
4.4 结果与分析
4.4.1 结果记录如表4-1所示
表4-1 结果记录表
试验名称
结果记录
大肠杆菌
枯草芽孢杆菌
前期实验分离到的菌株
葡萄糖发酵试验
о+
-
-
乳糖发酵试验
о+
-
-
V.P试验
-
变红
-
甲基红试验
变红
-
-
4.4.2 结果分析
4.4.2.1 葡萄糖发酵试验和乳糖发酵试验中，只有接有大肠杆菌的培养液变成黄色且有气体产生，而其他均无明显现象，说明大肠杆菌能分解利用葡萄和乳糖产酸并产气，而枯草芽孢杆菌和前期分离得到的菌不能分解利用葡萄糖和乳糖。
4.4.2.2 V.P试验中，只有接有枯草芽孢杆菌的培养液出现V.P阳性反应，说明枯草芽孢杆菌能利用葡萄糖发生V.P反应，而大肠杆菌和前期实验分离到的菌则不能利用葡萄糖发生V.P反应。
4.4.2.3 甲基红试验中，只有接有大肠杆菌的培养液出现红色，说明大肠杆菌能利用葡萄糖产生有机酸，使甲基红变为红色，即出现M.R阳性反应，而枯草芽孢杆菌和前期实验分离到的菌则不能利用葡萄糖发生产生甲基红反应。
4.5 结论
大肠杆菌能分解利用葡萄糖和乳糖产酸并产气，能发生甲基红反应；枯草芽孢杆菌利用葡萄糖和乳糖不产酸也不产气；前期实验分离到的菌不能利用葡萄糖和乳糖产酸和产气。