正电荷修饰对光交联海藻酸盐水凝胶支架细胞粘附性能的影响_尹苗.pdf

正电荷修饰对光交联海藻酸盐水凝胶支架细胞粘附性能的影响尹苗徐飞丁慧芬邓婷王家伟（武汉大学口腔医学院修复科湖北 武汉 ）摘要目的：提高光交联海藻酸盐水凝胶支架的细胞粘附性能。方法：在光交联过程中，通过掺入不同量的甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（）对海藻酸盐水凝胶支架进行修饰。用 、溶胀实验及活死细胞染色等技术检测正电荷修饰对水凝胶结构及粘附性能的影响。结果：正电荷可成功接枝到光交联海藻酸盐水凝胶中；引入 降低了水凝胶的溶胀率；一定量的正电荷能明显促进 细胞在凝胶表面的粘附及伸展。结论：一定量的正电荷修饰能显著改善光交联海藻酸盐水凝胶支架的细胞粘附性能。关键词骨组织工程藻酸盐粘附性正电荷 中图分类号 文献标识码 文章编号 （），：（）（），：由颌面部创伤、肿瘤切除、感染以及发育异常等原因导致的颌骨缺损一直是口腔颌面修复治疗的难点。组织工程技术为重建颌骨缺损提供了一条全新的思路。海藻酸盐水凝胶是常用的组织工程支架材料。当海藻酸采用离子交联时，常因聚合速率过快，导致水凝胶结构不均匀；凝胶中的二价阳离子也容易与周围环境发生离子交换，导致凝胶溶解，失去凝胶特性。当海藻酸采用光交联时，虽然凝胶的稳定性能增强，但由于材料表面的强亲水性，细胞外基质（）中的粘附蛋白难以在材料表面附着，也导致细胞粘附性能不足。接枝多肽分子是改良水凝胶支架细胞粘附性能的常用方法。然而，有实验表明：接枝多肽并不能改善 在凝胶表面的吸附，不利于组织形成，。基金项目国家自然科学基金（编号：）作者简介尹苗（），女，湖北人，博士研究生，主要从事组织工程支架改性研究。通讯作者王家伟，：因而，与多肽修饰相比，支架材料对蛋白整体的吸附更为可靠。天然蛋白处于两性电离状态，只有在等电点时，净电荷为零。由于人体 中的绝大多数蛋白等电点较低，在生理环境下，蛋白大多带负电荷。因此，将材料表面接入适当密度的正电荷可有效增强蛋白吸附，从而促进细胞粘附，同时不会对细胞活性产生消极影响。分子中含有一个稳定携带正电荷的季铵基团，是常用的化学小分子。本课题组曾利用该分子修饰了聚乙二醇水凝胶，发现正电荷修饰对细胞在凝胶表面的粘附、增殖、分化均有明显的促进作用。基于此，本文拟利用 修饰海藻酸盐水凝胶，通过引入适当量的正电荷来增强细胞在海藻酸水凝胶表面的粘附。本研究国内外尚未见文献报道。材料与方法材料海藻酸钠、氨乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（）、二乙酸荧 光 素（）、碘 化 丙 锭（）、羟基 （羟乙氧基）甲基苯丙口腔医学研究 年月第 卷第期酮（）来自于 ；来自于阿拉丁；（吗啡啉）乙磺酸（）来自于武汉科瑞生物技术有限公司；羟基 硫代琥珀酰亚胺（）、乙烷基（二甲基氨丙基）含碳硝化甘油（）来自于上海源叶生物科技有限公司。甲基丙烯酸酯化海藻酸盐（）的合成参考文献报道将 接枝到海藻酸盐上，经 核磁共振（）计算藻酸盐上甲基丙烯酸酯基团的接枝率。：及正电荷修饰的海藻酸盐水凝胶；：光交联反应原理图图海藻酸盐水凝胶 正电荷修饰光交联海藻酸盐水凝胶（）的制备将 溶解于含有光引发剂 的去离子水中，与不同浓度的 混匀，转移至模具中，紫外灯（波长 ，强度）光照 成胶，其反应原理如图所示。其中，各组水凝胶成分见表，其数值均为终浓度。表各组水凝胶前体溶液组成 样本 红外光谱分析（）将制备好的凝胶冷冻干燥，使用红外光谱仪检测各组凝胶的组分。平衡溶胀率（）的测定将各组水凝胶于 蒸馏水中浸泡，取出后用滤纸吸干表面，称重（）。随后冷冻干燥至恒重，称重（）。计算平衡溶胀率（）：（）。接枝正电荷对 细胞在凝胶表面粘附的影响将凝胶切割成 的水凝胶块，置于 孔板中。将 细胞（个）接种于凝胶表面，放入培养箱。细胞粘附后，用 洗去未粘附的细胞。分别于培养后、取出凝胶，用 双染试剂染色后，置荧光显微镜下观察细胞的粘附伸展状况并拍照（）。双 染 试 剂 由 和 组 成：可使活细胞发出强绿色荧光；可使死细胞发出红色荧光。细胞在凝胶表面的早期粘附率及细胞伸展状况利用 统计分析。早期粘附率根据第时各组凝胶表面粘附的细胞量来计算：早期粘附率粘附细胞量接种细胞量 。细胞伸展的状态用形状因子（）来描述，计算公式如下：。其中，为圆周率，代表细胞包括伪足在内所占的面积，为细胞的周长。当粘附的细胞为正圆形时，（）（）。越小，细胞在材料表面伸展越好。随机筛选散落的单个细胞进行统计，每组测算细胞数为 个。统计学分析所有数据以珚形式表示，采用 统计软件包进行单因素方差分析或检验，为有统计学差异。结果 结果如图所示，由于甲基丙烯酸酯基团的接入，海藻酸盐核磁图谱上形成新的波峰，包括：位于 的亚甲基上的（）；位于和 的丙烯基上的（）；位于 的甲基上的（）。通过 波谱显示的藻酸盐上的固有（）与接枝上的丙烯基团上（）的峰面积，可计算藻酸盐上双键的接枝率，约为。图甲基丙烯酰化藻酸盐的 图谱 结果正电荷修饰的光交联海藻酸盐水凝胶在 和 处出现了新的特征峰，且峰的强度随着 浓度升高而增大，见 ，图。其可能来源是 基团中的羰基的伸缩振动和甲基的非对称性弯曲振动。图光交联海藻酸盐及正电荷修饰的光交联海藻酸盐水凝胶的红外光谱 接枝正电荷对水凝胶平衡溶胀率的影响如图，随着 的引入，水凝胶的平衡溶胀率明显降低（）。这意味着正电荷的引入使光交联水凝胶在溶胀平衡时载水量下降，凝胶亲水性能降低。图正电荷修饰对水凝胶平衡溶胀率的影响 接枝正电荷对细胞粘附的影响细胞粘附形态：染色结果显示组水凝胶表面的细胞均活性良好（图）。培养时，细胞在各组凝胶表面多呈球形，无明显伸展；表面可见少量多角形细胞。培养后，和 表面细胞仍多呈球形，少量细胞有伸展；在 表面，细胞多呈梭形或多角形，伸展良好，部分增殖呈片状。早期粘附率 细胞接种 后，各组凝胶表面的细胞粘附率差异明显（图、）。引入 能明显提高细胞在凝胶表面的早期粘附率；随着 浓度的升高，早期粘附率明显增大（）。细胞伸展程度时，组凝胶表面粘附细胞的值均接近，细胞均伸展不明显，但伸展状况 和 相对较好（）。后，表面的细胞形状因子为 ，细胞伸展明显优于前两组（）。图：测试：细胞在各组支架材料上接种 和 后的粘附伸展状况，标尺为 ；：细胞在各组凝胶表面的早期粘附率；：细胞在和时在凝胶表面的细胞形态因素分析 ：；：；：讨论大量研究表明，细胞与材料之间的相互作用直接影响到细胞的生物学行为。良好的细胞粘附才能有效激活细胞增殖及分化的信号传导通路，从而促进组织形成。为了提高光交联海藻酸盐水凝胶支架的粘附性能，本文尝试将一定量的正电荷接入到水凝 胶 主 链 上。结 果 表 明：不 同 数 量 的 可在光交联过程中成功接枝到支架上。溶胀测试显示正电荷修饰改变了水凝胶的理化性能，其平衡溶胀率明显降低。水凝胶的溶胀平衡是由多种因素共同作用的动态平衡过程，包括高分子材料的分子量和结构、交联剂浓度、渗透压、交联度等。正电荷改性能抑制支架的吸水溶胀，可能口腔医学研究 年月第 卷第期是由于 中引入了较多的疏水性甲基。疏水基团的存在使材料表面的亲水性降低，网络结构更紧固，溶胀时水分子不易渗入到凝胶中。此外，支架的粘附性能也有显著改善，引入一定量的正电荷可明显促进细胞在材料表面的粘附和伸展。虽然支架材料与细胞之间的作用机制至今尚未完全明确，但支架蛋白介质层细胞模式已被广泛认可：支架与体内环境接触后，粘附蛋白等多种蛋白被迅速吸附到材料表面；随后，粘附蛋白与细胞表面粘附受体结合，介导细胞粘附至材料表面。蛋白在材料表面的附着是一个复杂的热力学过程，受到包括材料亲疏水性、电荷、表面形貌、范德华力等诸多因素的影响。光交联海藻酸盐水凝胶具有高度的亲水性，蛋白难以在凝胶表面附着，从而限制了细胞在材料表面的粘附。正电荷修饰能显著改善 表面的细胞粘附，直接原因是材料表面的电荷促进了 中蛋白的吸附。此外，由 基团引入的疏水基团，也可能通过降低凝胶的亲水性进而调控细胞粘附。但具体的作用机制以及正电荷修饰对凝胶表面细胞增殖分化的影响还需要进一步的研究。参考文献马文渊，何惠宇，杨楠，等 水凝胶、海藻酸钠凝胶与羊椎骨支架粘合植入动物体内观察口腔医学研究，（），（），（），（），（），（），（），（），（），：，收稿日期：（本文编辑李四群）欢迎订阅 年 口腔医学研究 杂志 口腔医学研究（原名口腔医学纵横）为武汉大学口腔医学院主办、国内外公开发行的口腔医学专业学术期刊。是科技部中国科技论文统计源期刊（中国科技核心期刊），中文核心期刊要目总览 第版核心期刊，美国 化学文摘、俄罗斯 文摘杂志、波兰 哥白尼索引（国际医学科学数据库）收录期刊。口腔医学研究 创刊于 年月，主编为樊明文教授，编委会由全国各大口腔医学院校各学科专家组成。口腔医学研究 创刊 多年来，始终坚持刊物的科学性、实用性，面向院、系和基层，以普及、提高、服务为宗旨。最快捷地报道国内外口腔医学的新进展、新技术，为口腔医学临床和科研及教学服务，为读者服务。辟有专家论坛、基础研究论著、临床研究论著、讲座、临床经验交流、专业英语、综述、病例报道、学术动态、会务消息等栏目，读者对象为全国各地口腔医疗、教学、科研人员，口腔专业学生、护理、医技人员等。口腔医学研究 也可为国内外各医疗器械、材料、药品和保健牙膏生产商或经营商刊登广告，是国家认定的处方药广告的宣传媒体。口腔医学研究 为月刊，每月 日出版。每期定价 元，全年 期，共 元（含邮资），欢迎广大读者到当地邮局订阅。如错过邮局订阅时间，可随时向编辑部邮购。编辑部地址：武汉市洪山区珞瑜路 号武汉大学口腔医学院，邮政编码：。电话：，传真：。：，：。口腔医学研究 国内统一刊号：，国际标准出版物号：。国内总发行：湖北省邮政报刊发行局，邮发代号 。国外总发行：中国国际图书贸易总公司（北京 信箱），国外代号 。广告经营许可证号：。，