银纳米对不同骨科生物材料上金黄色葡萄球菌生物膜的影响_严新安.pdf

论著银纳米对不同骨科生物材料上金黄色葡萄球菌生物膜的影响严新安1,2，Walter M Chirume1,2，方跃1,21.四川大学华西医院骨科（成都 610041）2.四川大学华西医院创伤医学中心（成都 610041）【摘要】目的 观察银纳米颗粒（silver nanoparticle,AgNP）的抑制细菌生物膜特性，并研究其在常用的3 种骨科生物材料上的抑制生物膜作用。方法 通过微孔板内药敏试验培养确定 AgNP 的最低抑制浮游菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）和最低抑制生物膜浓度（minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC）。在钛合金、氧化钛和不锈钢 3 种骨科生物材料上培养金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）生物膜，使用 32、16、8、4、2、0 g/mL AgNP 干预生物膜，确定 AgNP 在 3 种材料上的 MBIC。分析扫描电子显微镜结果，并通过测定光密度值观察 AgNP 对生物膜形成的影响。结果 微孔板内 AgNP 的 MIC 和 MBIC 均为 16 g/mL。在对内植物的生物膜抑制实验中，AgNP 在氧化钛中 MBIC 为 16 g/mL，在钛合金和不锈钢中 MBIC 为 32 g/mL。3 种材料中，氧化钛上光密度值最低，钛合金上光密度值最高。结论 AgNP 具有强大的抗细菌生物膜特性，能够在体外阻止金黄色葡萄球菌生物膜形成。钛合金上生物膜形成最多，而氧化钛上最少，不锈钢则介于两者之间。【关键词】银纳米；金黄色葡萄球菌；生物膜；内植物；骨髓炎Effect of silver nanoparticles on Staphylococcus aureus biofilm formation on differentorthopedic biomaterialsYAN Xinan1,2,Walter M Chirume1,2,FANG Yue1,21.Department of Orthopedic Surgery,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.China2.Trauma Center,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610041,P.R.ChinaCorresponding author:FANG Yue,Email:【Abstract】Objective To observe the inhibitory characteristics of silver nanoparticles(AgNP)on bacterialbiofilms and investigate their inhibitory effect on biofilm formation on three common orthopedic biomaterials.Methods The minimal inhibitory concentration(MIC)and minimal biofilm inhibitory concentration(MBIC)of AgNPwere determined by microplate dilution assay.Biofilms of Staphylococcus aureus(ATCC 25923)were cultured on threeorthopedic biomaterials(titanium alloy,titanium oxide,and stainless steel)and intervened with AgNP at concentrationsof 32,16,8,4,2 and 0 g/mL to determine the MBICs on the three materials.The effects of AgNP on biofilm formationwere analyzed by scanning electron microscopy and measuring optical density.Results The MIC and MBIC of AgNP inthe microplate assay were both 16 g/mL.The MBICs of AgNP on biofilm formation in titanium oxide,titanium alloy,and stainless steel were 16 g/mL,32 g/mL,and 32 g/mL,respectively.Among the three materials,the lowest opticaldensity was observed on titanium oxide,while the highest was on titanium alloy.Conclusions AgNP has strongantibacterial biofilm characteristics and can prevent the formation of Staphylococcus aureus biofilm in vitro.Biofilmformation is most pronounced on titanium alloy,least on titanium oxide,and intermediate on stainless steel.【Key words】Silver nanoparticles;Staphylococcus aureus;biofilm;implants;osteomyelitis内植物相关感染是骨科临床工作中的常见问题，研究显示，全髋关节置换术后感染率为 2.2%，脊柱手术术后感染率为 2.0%1-2，使用外固定支架的患者中近一半发生了针道感染3-4。对于这种情况，常用治疗方案是手术清创联合抗菌药物。但随着细菌耐药形势愈加严重，抗菌药物治疗效果常常欠佳。当骨科内植物发生感染时，细菌接触并黏附到DOI：10.7507/1002-0179.202110174基金项目：四川省科技计划项目（2018SZ0235）通信作者：方跃，Email：华西医学 2023 年 7 月第 38 卷第 7 期 1047 http:/www.wcjm.org 内植物表面，并分泌细胞外聚合物基质，形成生物膜，而生物膜通过阻碍抗菌药物渗透，将进一步诱导加重细菌耐药性5。此类感染通常需要手术去除内植物和死骨。因此，探索一种抑制细菌生物膜形成的内植物材料或涂层的重要性不言而喻。目前已有多种材料包括季铵化合物、铜离子、银离子壳聚糖纳米颗粒等6-10被发现有抗菌作用，作为植入物的表面活性物质。银离子已被证明具有较强的抗菌特性，同时银离子还可以制成银纳米颗粒（silver nanoparticle,AgNP），以改善其物理、化学和生物特性11-12。因其抗菌及生物特性，AgNP 在骨科领域可能用途广泛，骨科植入物表面覆盖 AgNP 涂层可能是一个骨科内植物感染预防及治疗方案。本研究通过 AgNP 在体外环境下干预 3 种内植物材料（钛合金、氧化钛和不锈钢）上的金黄色葡萄球菌生物膜实验来评估 AgNP 能否预防或治疗骨科内植物感染。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验菌株金黄色葡萄球菌 ATCC 25923，由四川大学华西医院实验医学科临床微生物室提供，已通过基因测序。1.1.2 AgNP使用的 AgNP 为南京新飞纳米材料科技有限公司的银纳米胶体，产品名称：Nanosilver 胶体银；浓度：0.1 mg/mL；粒子直径：（155）nm；溶剂：水。1.1.3 内植物材料3 种植入物材料分别是氧化钛、钛合金和不锈钢（山东威高控股有限公司提供），大体见图 1。所有圆盘半径 18 mm，厚度3 mm，经过 2 000 粒度砂纸抛光，圆盘浸泡在 0.2%市售洗涤剂中过夜，更换洗涤剂在 40 的超声波浴清洁 5 min，蒸馏水冲洗 3 次，灭菌，备用。1.2 实验方法1.2.1 AgNP 对金黄色葡萄球菌浮游菌及生物膜的药敏试验使用美国临床和实验室标准化协会描述的肉汤稀释方法13确定 AgNP 对金黄色葡萄球菌的最低抑制浮游菌浓度（minimal inhibitoryconcentration,MIC）和最低抑制生物膜浓度（minimal biofilm inhibitory concentration,MBIC），并确定万古霉素对金黄色葡萄球菌的 MBIC。菌株复苏后，于新鲜胰酶大豆肉汤中培养 2 h，至对数生长期，加入适量新鲜 Mueller-Hinton 肉汤（Mueller-Hinton broth,MHB），使用肉汤稀释法制备 AgNP溶液浓度梯度，获得 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 g/mL 的浓度梯度，现用现配。使用麦氏比浊仪将细菌浓度调整至 0.5 麦氏点（约 1108CFU/mL），将 0.5 麦氏点菌液使用 MHB 稀释 50倍，现用现配。将细菌溶液加入不同浓度的 AgNP-MHB 溶液中，比例为 50 L 菌液与 50 L 不同浓度梯度的 AgNP-MHB 溶液。最终细菌初始培养浓度为 5105 CFU/mL。同时建立仅由无菌 MHB 组成的阴性对照组和仅包含细菌溶液的阳性对照组，每组重复 6 次实验。37 静置培养 24 h 后，肉眼观察 MIC。按上述方式，0.5 麦氏点菌液稀释 100 倍，微孔板内每孔加入 100 L 菌液，37 静置培养24 h 后吸去微孔板内的菌液，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）轻柔冲洗 3 次以洗去浮游细菌。每孔加入 150 L AgNP-MHB 溶液以完全浸没生物膜，AgNP-MHB 溶液浓度梯度分别为 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5g/mL，加入不含 AgNP 的 MHB 溶液为阴性对照。每组重复 6 次实验。37 静置培养 24 h，肉眼观察 MBIC。以同法测试出万古霉素 MBIC，以万古霉素 MBIC 为阳性对照。吸去微孔板内的菌液，每个微孔内无菌 PBS 轻柔冲洗 3 次，自然风干使用结晶紫染色法染色，用多功能酶标仪测定 595 nm光密度（optical density,OD）值。1.2.2 扫描电子显微镜（电镜）下观察 AgNP 对生物膜的影响使用直径 10 mm 圆形玻璃盖玻片作为载体培养生物膜，放置在 12 孔微孔板孔底部。将如前 1.2.1 所述制备 500 L 菌液吸入孔中，然后使用 AgNP-MHB 溶液填充至 1 000 L，确保盖玻片完全浸没。AgNP 浓度梯度为 32、16、8、4、2 g/mL，不含 AgNP 的无菌 MHB 为阴性对照，万古霉素MBIC 为阳性对照。以与 MBIC 实验相同的方式培养。培养完成后，盖玻片分别经过 3 次 PBS 缓慢冲洗、2.5%戊二醛固定以及梯度乙醇脱水。实验重复2 次。使用离子溅射仪在每个盖玻片上喷金染色，扫描电镜赛默飞世尔（中国）科技有限公司下观察，随机取视野拍照。氧化钛钛合金不锈钢图 1 3 种内植物材料大体观 1048 West China Medical Journal,Jul.2023,Vol.38,No.7 http:/www.wcjm.org1.2.3 AgNP 对各种骨科生物材料生物膜形成的影响将内植物圆盘置入 12 孔微孔板中，同 1.2.1 制备菌液，每孔加入 1 000 L 菌液，完全浸没圆盘，37 静置培养 24 h，取出圆盘，无菌 PBS 轻轻冲洗3 次，放入新的 12 孔微孔板内，加入 1 000 L 不同浓度梯度的 AgNP-MHB 溶液，AgNP 浓度梯度为32、16、8、4、2 g/mL，每种浓度重复 6 次。37 静置培养 24 h 后获得 AgNP 溶液 MBIC，同时测定生物膜 OD 值。1.3 统计学方法使用 SPSS 25 统计软件进行分析。数据以均数标准差表示，使用单因素方差分析比较实验组间差异，若有统计学意义则使用 Tukey 事后检验法进行组间两两比较，并计算两两之间的均数差和95%置信区间。双侧检验水准=0.05。2 结果2.1 AgNP MIC 实验结果AgNP 对金黄色葡萄球菌的 MIC 为 16 g/mL。2.2 AgNP MBIC 实验结果AgNP 对金黄色葡萄球菌的 MBIC 为 16 g/mL。阳性对照万古霉素的 MBIC 为 64 g/mL。AgNP 干预金黄色葡萄球菌生物膜的 OD 值见表 1。2.3 扫描电镜下观察 AgNP 抑制细菌生物膜在没有 AgNP 的情况下（0 g/mL 浓度，阴性对照组），细菌形成大量簇状结构，证明该菌株在没有任何阻碍因素的情况下具有形成生物膜的能力。除去呈蘑菇状的簇状生物膜结构，还观察到大量的浮游菌。在阳性对照组中无明显簇状生物膜形成，但仍然有一定的菌量。在低浓度的 AgNP（2 g/mL）干预下，形成的细菌数量没有显著减少，大多数细菌仍然存在于形成的生物膜簇中。在4 g/mL 浓度时，尽管周围浮游细菌显著减少，但观察到的情况几乎相同，其中仍观察到生物膜。在8 g/mL 时，生物膜形成减少，大量浮游菌仍可见，且有形成菌落的趋势。在作为 MBIC 值的 16 g/mL时，生物膜形成受到明显抑制，浮游菌明显减少。在 32 g/mL AgNP 的浓度下，未见浮游菌生长。见图 2。2.4 AgNP 对不同骨科生物材料上生物膜的影响AgNP 在氧化钛上 MBIC 为 16 g/mL，在钛合金和不锈钢材料上 MBIC 为 32 g/mL。3 种材料中，氧化钛上 OD 值最低，钛合金上 OD 值最高。在 MBIC 时，钛合金 OD 值几乎是不锈钢的 2 倍，而在低于 MBIC 浓度下钛合金 OD 值是氧化钛和不锈钢材料的 23 倍。单因素方差分析显示，在不同的浓度 AgNP 及阴性对照和阳性对照处理下，3 种生物材料上生物膜 OD 值差异均有统计学意义（P0.05），其余组间两两比较，差异均有统计学意义（P0.05）。见表 2、3。3 讨论银已被证明具有根除多种微生物（包括细菌、真菌和病毒）的能力14。银通过释放银离子，与细菌的各种成分（如细胞壁、细胞膜和细菌 DNA）结合并中断 DNA 的复制而发挥抗菌作用15-16。由于尺寸小，纳米粒子可与周围生物环境相互作用，其中小于 100 nm 的结构被证明可以改变或增强生物反应17-19。颗粒的大小和分布决定了 AgNP 的许多特征，例如毒性、生物学结果和特异性靶向能力20。较小的颗粒更容易与细胞和其他身体成分相互作用，能够轻松穿过血脑屏障、细胞壁和细胞膜等结构。本研究选择使用（155）nm 的颗粒，这一尺寸可以达到理想的效果，文献中使用的颗粒直径范围为 540 nm21-22。本实验通过扫描电镜发现，AgNP 不仅抑制生物膜形成，而且高浓度时还显著降低细菌黏附。值得注意的是，本研究中 MBIC 和 MIC 的浓度基本相等，这表明 AgNP 具有很强的抗生物膜特性。Mala 等23的研究中 AgNP 在尿管涂层表面也显示出这种特性。扫描电镜观察显示，在 32 g/mL 和16 g/mL 的浓度下，AgNP 显示出了完全的生物膜抑制能力；但随着浓度降低，菌落逐渐增加。在某些研究中，浓度低于 50 g/mL 的 AgNP 可以表现出良好的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌生物膜活性24。在另一项使用安息表 1 AgNP 干预金黄色葡萄球菌生物膜的 OD 值（n=6）干预方式OD 值32 g/mL AgNP0.2010.01716 g/mL AgNP0.2470.0208 g/mL AgNP0.2820.0254 g/mL AgNP0.3400.0322 g/mL AgNP0.3530.0331 g/mL AgNP0.3450.0400.5 g/mL AgNP0.3580.0270.25 g/ml AgNP0.3730.0210.125 g/mL AgNP0.3660.0270.062 5 g/mL AgNP0.3620.0330 g/mL AgNP0.5800.05064 g/mL 万古霉素0.3260.018AgNP：银纳米颗粒；OD：光密度华西医学 2023 年 7 月第 38 卷第 7 期 1049 http:/www.wcjm.org 32 g/mL16 g/mL8 g/mL4 g/mL2 g/mL0 g/mL万古霉素 64 g/mL图 2 AgNP 生物膜处理的扫描电子显微镜结果a.32 g/mL AgNP 干预（1 000）；b.32 g/mL AgNP 干预（3 000）；c.16 g/mL AgNP 干预（1 000）；d.16 g/mL AgNP 干预（3 000）；e.8 g/mL AgNP 干预（1 000）；f.8 g/mL AgNP 干预（3 000）；g.4 g/mL AgNP 干预（1 000）；h.4 g/mL AgNP 干预（3 000）；i.2 g/mL AgNP 干预（1 000）；j.2 g/mL AgNP 干预（3 000）；k.无 AgNP 干预（1 000）；l.无 AgNP 干预（3 000）；m.64 g/mL 万古霉素干预（1 000）；n.64 g/mL 万古霉素干预（3 000）。AgNP：银纳米颗粒表 2 不同浓度 AgNP 时不同骨科生物材料上生物膜 OD 值比较（n=6）干预方式氧化钛圆盘钛合金圆盘不锈钢圆盘P 值32 g/mL AgNP0.6140.0291.1190.0330.6570.0160.00016 g/mL AgNP0.6680.0461.6610.0440.8640.0620.0008 g/mL AgNP0.8890.0332.7970.0850.9250.0510.0004 g/mL AgNP1.1050.0323.3500.0381.5010.0290.0002 g/mL AgNP1.4430.0693.0630.0301.9410.0870.0000 g/mL AgNP1.7230.0213.4230.0292.0110.0600.00064 g/mL 万古霉素0.9320.0362.8270.0491.2910.0430.000AgNP：银纳米颗粒；OD：光密度表 3 不同浓度 AgNP 时不同骨科生物材料上生物膜 OD 值的两两比较（n=6）干预方式氧化钛 vs.钛合金氧化钛 vs.不锈钢钛合金 vs.不锈钢均数差及 95%置信区间P 值均数差及 95%置信区间P 值均数差及 95%置信区间P 值32 g/mL AgNP0.506（0.547，0.464）0.0000.044（0.085，0.002）0.0400.462（0.420，0.504）0.00016 g/mL AgNP0.994（1.074，0.914）0.0000.196（0.276，0.116）0.0000.798（0.717，0.878）0.0008 g/mL AgNP1.908（2.007，1.809）0.0000.036（0.135，0.062）0.6141.872（1.773，1.970）0.0004 g/mL AgNP2.246（2.610，1.883）0.0000.405（0.768，0.411）0.0281.842（1.478，2.205）0.0002 g/mL AgNP1.620（1.725，1.515）0.0000.498（0.603，0.393）0.0001.122（1.017，1.227）0.0000 g/mL AgNP1.700（1.760，1.640）0.0000.288（0.348，0.228）0.0001.412（1.352，1.472）0.00064 g/mL 万古霉素1.895（1.960，1.830）0.0000.359（0.423，0.294）0.0001.537（1.472，1.602）0.000AgNP：银纳米颗粒；OD：光密度 1050 West China Medical Journal,Jul.2023,Vol.38,No.7 http:/www.wcjm.org香胶提取物形成的 AgNP 干预大肠埃希菌生物膜研究中，研究者发现 AgNP 在 10 g/mL 浓度时就表现出了抗生物膜活性25。AgNP 抑制细菌生物膜的机制尚不清楚。Qin 等26在钛内植物表面修饰 AgNP的研究表明，AgNP 可抑制细菌对内植物表面的黏附，这一作用可能是通过抑制 icaAD 基因的转录来实现的。本实验中，我们将 MBIC 浓度的万古霉素设置为阳性对照。虽然在阳性对照中可以看到抗菌作用，但在同样的浓度与 AgNP 相比，抑菌效果欠佳。钛及其变体和不锈钢是最常用的骨科生物材料。钛由于其良好的生物相容性而成为目前应用最广泛的生物材料27。Arens 等28的动物实验研究报道，不锈钢接骨板的感染率远高于纯钛，可能与钛的表面光滑度、表面电荷和疏水性有关29。因此，为了获得公正客观的结果，本研究中的所有内植物必须事先抛光以获得均匀的表面光滑度，以尽可能减少由材料表面光滑度引起的误差。Schildhauer等30研究表明，与纯钛相比，金黄色葡萄球菌对钛合金的黏附性明显更高。Malhotra 等31研究也表明，与其他生物材料相比，细菌对钛合金的附着力较高。本研究结果也发现，细菌对钛合金的附着力较高，MBIC 为 32 g/mL，其生物膜 OD 值最高；而氧化钛 MBIC 为 16 g/mL，这也表明细菌对氧化钛的附着力较低。氧化钛是通过钛原子电解成四价钛离子，与氧结合，在表面形成氧化层32。与钛合金和不锈钢相比，氧化钛 OD 值最低。钛氧化过程中形成的氧化膜可能是细菌在表面附着减少的原因。Sharma 等33提出了银纳米与氧化钛的相互作用：氧化钛能促进 AgNP 释放银离子，从而增加纳米颗粒的杀菌作用，并且具有降低 AgNP 毒性的能力。这跟我们的结果相符而且能解释为什么氧化钛具有最低的生物膜附着力。相关临床研究表明，使用银处理医疗器械后细菌污染可有所减少34-36。Panek 等37研究发现 AgNP不同于一般抗菌药物抗感染等机制，使其可作为一种治疗耐药菌株（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）的有效替代方案。但 AgNP 的主要缺点是其潜在的毒性，但这还具有争议。大多数研究认为 AgNP 具有毒性，毒性取决于其大小、形状和浓度38。有研究在大鼠中静脉注射 AgNP 以监测 20100 nm 大小颗粒的毒性作用，结果显示脾脏显著增大，T 和B 细胞数量增加，表明较大的颗粒具有严重的副作用39。本研究使用 AgNP 多在 1020 nm，这一规格的 AgNP 毒性还需要后续实验继续研究。综上所述，与氧化钛和不锈钢相比，钛合金上生物膜形成最多，而氧化钛上最少，不锈钢则介于两者之间。AgNP 具有很强的抗菌和抗生物膜特性，可有效抑制内植物上的生物膜形成，但其生物毒性还需进一步研究。根据本研究结果，氧化钛最适合进行表面改性，因为它与 AgNP 的协同作用具有最好的结果。AgNP 直接修饰植入物以及它们在体内环境中的行为有待进一步研究。利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。参考文献Ridgeway S,Wilson J,Charlet A,et al.Infection of the surgical siteafter arthroplasty of the hip.J Bone Joint Surg Br,2005,87(6):844-850.1Olsen MA,Nepple JJ,Riew KD,et al.Risk factors for surgical siteinfection following orthopaedic spinal operations.J Bone JointSurg Am,2008,90(1):62-69.2Mahan J,Seligson D,Henry SL,et al.Factors in pin tract infections.Orthopedics,1991,14(3):305-308.3Lee-Smith J,Santy J,Davis P,et al.Pin site management.Towardsa consensus:part 1.J Orthop Nurs,2001,5(1):37-42.4Zimmerli W,Moser C.Pathogenesis and treatment concepts oforthopaedic biofilm infections.FEMS Immunol Med Microbiol,2012,65(2):158-168.5Nohr RS,Macdonald JG.New biomaterials through surfacesegregation phenomenon:new quaternary ammonium compoundsas antibacterial agents.J Biomater Sci Polym Ed,1994,5(6):607-619.6Nganga S,Travan A,Marsich E,et al.In vitro antimicrobialproperties of silver-polysaccharide coatings on porous fiber-reinforced composites for bone implants.J Mater Sci Mater Med,2013,24(12):2775-2785.7Tyagi M,Singh H.Preparation and antibacterial evaluation ofurinary balloon catheter.Biomed Sci Instrum,1997,33:240-245.8Akiyama T,Miyamoto H,Yonekura Y,et al.Silver oxide-containing hydroxyapatite coating has in vivo antibacterial activityin the rat tibia.J Orthop Res,2013,31(8):1195-1200.9An YH,Stuart GW,McDowell SJ,et al.Prevention of bacterialadherence to implant surfaces with a crosslinked albumin coatingin vitro.J Orthop Res,1996,14(5):846-849.10Kelkawi AHA,Abbasi Kajani A,Bordbar AK.Green synthesis ofsilver nanoparticles using Mentha pulegium and investigation oftheir antibacterial,antifungal and anticancer activity.IETNanobiotechnol,2017,11(4):370-376.11Li Y,Lin Z,Zhao M,et al.Silver nanoparticle based codelivery ofoseltamivir to inhibit the activity of the H1N1 influenza virusthrough ROS-mediated signaling pathways.ACS Appl MaterInterfaces,2016,8(37):24385-24393.12Clinical and Laboratory Standards Institute.Methods for dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically;approved standard,7th ed.CLSI document M7-A7.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute,2006.13Brennan SA,N Fhoghl C,Devitt BM,et al.Silver nanoparticles14华西医学 2023 年 7 月第 38 卷第 7 期 1051 http:/www.wcjm.org and their orthopaedic applications.Bone Joint J,2015,97-B(5):582-589.Chaloupka K,Malam Y,Seifalian AM.Nanosilver as a newgeneration of nanoproduct in biomedical applications.TrendsBiotechnol,2010,28(11):580-588.15Yin IX,Zhang J,Zhao IS,et al.The antibacterial mechanism ofsilver nanoparticles and its application in dentistry.IntJ Nanomedicine,2020,15:2555-2562.16Xiang Y,Li J,Liu X,et al.Construction of poly(lactic-co-glycolicacid)/ZnO nanorods/Ag nanoparticles hybrid coating on Tiimplants for enhanced antibacterial activity and biocompatibility.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2017,79:629-637.17Sato M,Webster TJ.Nanobiotechnology:implications for thefuture of nanotechnology in orthopedic applications.Expert RevMed Devices,2004,1(1):105-114.18Singh R,Lillard JW.Nanoparticle-based targeted drug delivery.Exp Mol Pathol,2009,86(3):215-223.19Panyam J,Labhasetwar V.Biodegradable nanoparticles for drugand gene delivery to cells and tissue.Adv Drug Deliv Rev,2003,55(3):329-347.20Rodrguez-Len E,Iiguez-Palomares R,Navarro RE,et al.Synthesis of silver nanoparticles using reducing agents obtainedfrom natural sources(Rumex hymenosepalus extracts).NanoscaleRes Lett,2013,8(1):318.21Shankar SS,Ahmad A,Sastry M.Geranium leaf assistedbiosynthesis of silver nanoparticles.Biotechnol Prog,2003,19(6):1627-1631.22Mala R,Annie Aglin A,Ruby Celsia AS,et al.Foley cathetersfunctionalised with a synergistic combination of antibiotics andsilver nanoparticles resist biofilm formation.IET Nanobiotechnol,2017,11(5):612-620.23Ansari MA,Khan HM,Khan AA,et al.Anti-biofilm efficacy ofsilver nanoparticles against MRSA and MRSE isolated fromwounds in a tertiary care hospital.Indian J Med Microbiol,2015,33(1):101-109.24Du J,Singh H,Yi TH.Antibacterial,anti-biofilm and anticancerpotentials of green synthesized silver nanoparticles using benzoingum(Styrax benzoin)extract.Bioprocess Biosyst Eng,2016,39(12):1923-1931.25Qin H,Cao H,Zhao Y,et al.In vitro and in vivo anti-biofilm effectsof silver nanoparticles immobilized on titanium.Biomaterials,2014,35(33):9114-9125.26Long M,Rack HJ.Titanium alloys in total joint replacement-a materials science perspective.Biomaterials,1998,19(18):1621-1639.27Arens S,Schlegel U,Printzen G,et al.Influence of materials for28fixation implants on local infection.An experimental study of steelversus titanium DCP in rabbits.J Bone Joint Surg Br,1996,78(4):647-651.Ha KY,Chung YG,Ryoo SJ.Adherence and biofilm formation ofStaphylococcus epidermidis and Mycobacterium tuberculosis onvarious spinal implants.Spine(Phila Pa 1976),2005,30(1):38-43.29Schildhauer TA,Robie B,Muhr G,et al.Bacterial adherence totantalum versus commonly used orthopedic metallic implantmaterials.J Orthop Trauma,2006,20(7):476-484.30Malhotra R,Dhawan B,Garg B,et al.A comparison of bacterialadhesion and biofilm formation on commonly used orthopaedicmetal implant materials:an in vitro study.Indian J Orthop,2019,53(1):148-153.31Pedeferr