长沙地区禽源mcr-1肠杆菌流行病学调查.pdf

Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.4,2023.渊Total No.236冤2023 年第 4 期（总第 236 期）doi:10.3969/j.issn.1006-4907.2023.04.018长沙地区禽源 mcr-1 肠杆菌流行病学调查王文静1,2，杜阳洋1,2,文立华1,杨 俊1,王红兵1，王 慧1，杜丽 飞1,刘俊琦1，周望平1（1.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131；2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128）中图分类号：S852.61文献标识码：B文章编号：1006-4907（2023）04-0044-04摘 要院为研究湖南长沙地区禽源肠杆菌中黏菌素耐药基因 mcr-1 的流行情况，试验以湖南长沙某生鲜市场和禽源屠宰场采集的 123 份禽源泄殖腔拭子和环境样本为研究对象，通过耐药菌株筛选试验、采用 PCR 方法鉴定 mcr-1 耐药基因试验和药敏试验，分析禽源粪便及周围环境中大肠杆菌 mcr-1 阳性细菌耐药率。结果显示：分离到 119 株大肠杆菌，耐药基因 mcr-1 检出率 13.8%（17/123），并对 17 株耐药菌株进行药敏试验，其结果显示，耐药率分别为：林可霉素 100%，阿莫西林 100%，氯霉素 94%，庆大环素 88%，氧氟沙星 76%，噻胞霉素 65%，头孢吡肟 29%，替加环素 0%；对两种药物耐药的菌株为 41.2%（n=7），对三种及以上的药物耐药菌株为 35.3%（n=6）。此研究为掌握长沙地区禽源 mcr-1 耐药菌株的耐药情况和耐药特征奠定了研究基础。关键词院MCR-1；大肠杆菌；流行病学研究；耐药性；黏菌素Epidemiological study of MCR-1-positive enterobacteriaceae of avian originWANG Wen-jin1,2,DU Yangyang1,2,WEN Li-hua1,Yang Jun1,WANG Hong-bing1,WANG Hui1,DU Li-fei1,LIU Jun-qi1,ZHOU Wang-ping1(1.Hunan Institute of Animal and Veterinary Science,Changsha 410131,PCR;2.Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PCR)Abstract:In order to study the prevalence of colistin resistance gene mcr-1 in Enterobacter avia-derived in Changsha,Hunan Province,123 poultry-de-rived cloaca swabs and environmental samples collected from a fresh market and poultry-derived slaughterhouse in Changsha,Hunan Province were usedas research objects,and the MCR-1 resistance gene and susceptibility test were identified by PCR method to analyze the resistance rate of E.colimcr-1-positive bacteria in poultry-derived feces and surrounding environment.The results showed that 119 strains of E.coli were isolated,and the detec-tion rate of drug-resistant MCR-1 was 17.1%(21/123).The results of susceptibility test showed that the resistance rate of ofloxacin was 76%,cefepime29%,lincomycin 100%,thiocitromycin 65%,amoxicillin,tigecycline 0%,gentacycline 88%,chloramphenicol 94%,41.2%(n=7)of strains resistant to twodrugs,and 35.3%(n=6)of strains resistant to three or more drugs.This trial provides a theoretical basis for intervention in colistin drug abuse.Key words:MCR-1;colibacillus;Epidemiological studies;Drug resistance;Colistin基金项目院湖南现代农业产业技术体系项目；湖南省农业农村厅直属单位省级专项项目。作者简介院王文静（2000），女，安徽阜阳人,主要从事细菌耐药性研究，.通信作者院刘俊琦（1984），女，博士，主要从事动物疫病防控及细菌耐药性研究，E-mail:；周望平(1970)，男，研究员，主要从事动物疫病研究，E-mail:。试验研究抗生素一直是人类抵御各种感染性疾病的主要武器，随着耐药菌报道的日益增多，人类健康公共安全受到威胁。2009 年，Yong 等人首次发现“超级细菌”新德里金属 茁-内酰胺酶（NDM-1），并证实 NDM-1 能介导细菌对几乎所有 茁-内酰胺类药物耐药1。2015 年，沈建忠团队在大肠杆菌分离株中发现了一种新的质粒介导的抗多黏菌素基因mcr-12。多黏菌素类药物是治疗碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant enterobacteri原aceae,CRE）最有效的药物，被认为是治疗碳青霉烯耐药菌感染的“最后一道防线”3，然而，当前黏菌素耐药性的流行已经成为一个重大的公共卫生安全问题2。有研究报道，从意大利的住院患者的大肠杆菌样品中检测到了 mcr-1 黏菌素耐药基因，虽然临床分离所得株耐药率较低，不过总体较为稳定4。研究者从食物中分离出 mcr 耐药基因5-7，这表明 mcr-1已经在全球范围内传播8，这些研究都表明了黏菌素耐药基因 mcr-1 传播途径的复杂性。随后研究在野生动物的排泄物中检测到了黏菌素耐药基因9。我国在 2017 年 4 月 30 日正式禁用黏菌素作为动物促生长剂22。但是，随着近年来革兰氏阴性菌多重耐药性（MDR）的产生10，耐药率的激增，让人类着重考虑健康安全问题，因为缺乏可以击败这些“超级细菌”的新抗生素，以及重要的可用和有效的抗生素通常无法对抗 MDR 革兰氏阴性病原体11，故多黏菌素类药物又被重新考虑起来。有研究表明黏菌素耐药的不同机制，包括内在、突变和可转移机制。近年来，从动物食品中分离出的微生物中携带多黏菌素耐药基因，这引发人们对动物未使用抗生44Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.4,2023.渊Total No.236冤2023 年第 4 期（总第 236 期）素却检测出相关抗生素的讨论。所以通过调查研究食源性动物，禽源动物的 MCR-1 阳性肠杆菌的耐药率，可以得知目前多黏菌素的耐药程度，加以干预目前小型鸡场、散鸡养殖户滥用药物的现状，以防对人类生命安全造成威胁，也防止这种抗生素的持续以来并控制黏菌素耐药性的传播12。1 材料与方法1.1 样本来源从湖南长沙某屠宰场采集鸡源泄殖腔拭子 23份，从湖南长沙某生鲜市场采集鸡源泄殖腔拭子52 份、鸽源泄殖腔拭子 8 份、环境样本 40 份。1.2 主要试剂及设备琼脂粉，阿莫西林、噻孢霉素、替加环素、庆大霉素、氧氟沙星、头孢吡肟、氯霉素、林可霉素等药敏试验药物购自 Solarbio；TSB 琼脂购自 OXOID；麦康凯琼脂购自杭州微生物试剂有限公司；琼脂糖购自 Biosharp；SuperRed/GelRed 核 酸 染 料 购 自Biosharp；硫酸粘杆菌素购自麦克林；Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司。立式压力蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BS-600L 电子天平购自上海友声衡器有限公司；H1650-W 医用离心机购自长沙高新技术开发区湘仪离心机仪器有限公司；BHS-1 水浴锅购自 JOANLAB；Opticlean-1300 洁净工作台购自力康精密科技（上海）有限公司；DYY-6C 型电泳仪购自北京市六一仪器厂；AG22331 普通 PCR 仪购自德国 eppendorf；Tanon3500R 凝胶成像系统购自上海天能；Multiskan FC 型酶标仪购自上海赛默飞世尔仪器有限公司。1.3 试验方法样本采集后，加入 2 mL TSB 液体培养基富集化培养 23 h，接种于含有 2 滋g/mL 硫酸多黏菌素药物的麦康凯培养基中，37益温箱培养 1216 h，筛选出黏菌素耐药菌，使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒，按照说明书进行细菌基因组提取。1.3.2 耐药菌株培养与保存将纯化后的菌株接种于普通培养基中富集化，加入 2mL30%甘油和液体培养液 1颐1 混合液，刮取菌落，抽取至离心管中，于-80益冰箱保存。1.2.3 PCR 鉴定据 NCBI 上已发表的大肠杆菌的 MCR-1 基因（参考菌株：KU743383.1，位置 28185-29810），用BLAST 进行特异性和保守型比较分析，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表 1。挑选麦康凯培养基中目的菌落接种于普通培养基中纯化，使用 mcr-1 引物进行鉴定。PCR 反应运行体系 25 滋L，其中模板 2 滋L，mcr-1 上游引物 1 滋L，mcr-1 下游引物 1滋L，2伊Ex Taq Premix12.5 滋L，灭菌纯水 8.5 滋L。1.3.4 抗菌药物敏感性实验按照美国临床和实验室标准协会抗菌药物敏感性试验(Clinical and Laboratory Standards Insti原tute，CLSI）和欧洲临床微生物和感染病学会药敏委员会(EUropean Committee for Antimicrobial Sus原ceptibility Testing，EUCAST）标准13-14，采用微量肉汤稀释法检测耐药菌株对 8 种药物的最低抑菌浓度（MIC）包括氧氟沙星、头孢吡肟、林可霉素、噻孢霉素、阿莫西林、替加环素、庆大环素、氯霉素，药敏试验结果判断参照文献15。2 结果2.1 肠杆菌的分离采集的 123 份样品中，共分离到 119 株肠杆菌，其中禽源屠宰场 22 株、生鲜市场 97 株（包括鸡源 50 株，环境 39 株，鸽源 8 株）。2.2 耐药菌分离鉴定119 株肠杆菌中分离到 21 株含有 mcr-1 耐药基因的肠杆菌（17.6%，21/119），其中屠宰场分离得3 株、生鲜市场分离得 18 株（其中鸡源 14 株，环境3 株，鸽源 1 株），分离结果见表 2。2.3 药敏试验结果17 株 mcr-1 多黏菌是耐药菌对氧氟沙星、头孢吡肟、林可霉素、噻孢霉素、阿莫西林、替加环素、庆大环素、氯霉素等抗生素的 MIC 值见表 3。17 株肠杆菌对林可霉素和阿莫西林耐药率均为 100%，对氯霉素耐药率为 94%，对庆大环素耐药率为88%，对氧氟沙星耐药率为 76%，对噻孢霉素耐药率为 65%，对替加环素耐药率为 0%（图 1）。17 株表 1 细菌核酸检测引物信息扩增大小/bp779引物名称MCR-1FMCR-1R引物序列（53）ACCAAGCCGAGACCAAGGATGCCAACGAGCATACCGACAT退火温度/55表 2 样本分组Table2 GroupingofSamples肠杆菌科2250398119来源屠宰场生鲜市场生鲜市场生鲜市场合计耐药基因数（检出率）3（13.04%）14（26.92%）3（7.5%）1（12.5%）21（17.07%）分类鸡粪便鸡粪便周边环境鸽粪便试验研究45Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.4,2023.渊Total No.236冤2023 年第 4 期（总第 236 期）图 1 药物对耐药菌株的耐药率Fig.1Resistancerateofeightdrugstoresistantstrains表 3 抗菌药物敏感性测试结果Table3 Antimicrobial susceptibility test results注：OFL：氧氟沙星；FEP：头孢吡肟；LCM：林可霉素；CET：噻孢霉素；AML：阿莫西林；TGC：替加环素；GEN：庆大环素；CHL：氯霉素。F5F6F7F21F23F25F29F30F32F37F40F50H12H17H26H27G2OFL166416161616162564326432825642128FEP216256164161625612888822560.250.25128LCM25625625625625625625625625625625625625625625632256CET2561282561283232256256256256256128322560.250.25256AML0.25256256256256256256256256256256256256256256128256TGC12810.50.510.5120.50.250.50.510.510.250.5GEN1281286412864128128128256128128646425684128CHL12812812864646412825664256128641281282560.2564菌株各类抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）/（mg/L）肠杆菌对 2 种药物耐药菌株占 5.9%（n=1），对 3 种药物耐药菌株占 5.9%（n=1），对 5 种药物耐药菌株占 23.5%（n=4），对 6 种药物耐药菌株占 38.9（n=7），对 7 种药物耐药菌株占 23.5%（n=4）。肠杆菌科细菌是一种常见的机会致病菌，主要导致肺炎、腹腔感染等，随着“超级细菌”的出现，人们对多黏菌素药物的依赖日益增加。近年来，由于多黏菌素耐药基因 mcr-1 的出现，人们又开始担忧公众安全问题，在国内颁发黏菌素禁药政策后，黏菌素耐药率也在逐渐下降。本试验中，可以观察到，提取出的 17 株 mcr-1耐药阳性菌株对林可霉素、阿莫西林的耐药率较高，与 Song 等研究结果基本一致23；替加环素耐药率为 0%，说明替加环素还未在本地区大范围使用，可能是碳青霉烯耐药菌感染的理想治疗抗生素。在药敏试验中发现，药敏试验与耐药菌株的结果相一致，大多数 mcr-1 阳性大肠杆菌对氧氟沙星、头孢吡肟及替加环素较为敏感，可能与样本来源地较少使用该类药物有关；同时，这些阳性菌株对噻孢霉素的药敏性呈现出较大差异，而噻孢霉素较青霉素效果较差且较为昂贵，一般很少在养殖业用到，在以往研究中也很少提到，出现差异的原因耐人寻味。值得注意的是，F6、F30、H17、G2 等菌株对试验中八种抗生素中大多数都存在较强的耐药性，说明这几种菌株已经出现多重耐药性，未来可能发展成为“超级耐药细菌”。另外，生鲜市场和屠宰场的鸡粪便中 mcr-1 阳性率都超过 10%，生鲜市场的鸡和鸽子大多来源于散养户，这说明长沙地区大肠杆菌对多黏菌素耐药情况较为严重，家禽养殖户可能存在黏菌素滥用泛用的行为。在生鲜市场周围所采集的环境样本中也检出 3 株 mcr-1 阳性株，可能是人类活动过程中携带的黏菌素耐药基因传播到了自然环境中，或是禽类生活过程中将携带的黏菌素耐药基因传播到了其他自然环境中。屠宰场粪便、生鲜市场粪便和环境中均检测到耐药基因，说明动物与环境之间存在相互传播，且有进一步传染到人体的可能性，这与王警等24研究中提出的观点一致。各类屠宰场应该严格制定管理条例并严格执行，做好动物的健康监测，正确处理排放废水或污水，及时消毒，做好环境保障工作。如今 mcr-1 耐药菌肆虐，危害公共健康，而多黏菌素类药物被限制使用，“最后一道防线”药物所剩无几，为防止人类和动物在往后的疾病侵袭中陷入无药可用的境地，市场要加强药物管理，严格执行兽药专用；养殖户应当加强饲养管理，减少药物滥用。阴参考文献：1 Davin-Regli A,Pag侉s JM.Enterobacter aerogenes and Enterobactercloacae;versatile bacterial pathogens confronting antibiotic treatmentJ.Front Microbiol,2015(6):392.2 Liu YY,Wang Y,Walsh TR,et al.Emergence of plasmid-mediatedcolistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings inChina:a microbiological and molecular biological study J.LJancetInfect Dis,2016(2):161-168.3 谢宁,高源,马藤菲,等.1 株产 NDM-9 和 MCR-1 的鸡源大肠杆菌的分子及生物学特征J.中国兽医杂志,2023,59(01):14-19.4 Gallardo-Godoy A,Muldoon C,Becker B,et al.Activity and Pre原dicted Nephrotoxicity of Synthetic Antibiotics Based on Polymyxin B.JMed Chem.2016 Feb 11;59(3):1068-77.5 Duggett NA,Sayers E,AbuOun M,et al.Occurrence and charac原terization of mcr-1-harbouring Escherichia coli isolated from pigs in试验研究46Hunan Animal Science and Veterinary Medicine,No.4,2023.渊Total No.236冤2023 年第 4 期（总第 236 期）教学天地中图分类号：G712文献标识码：A文章编号：1006-4907（2023）04-0047-04摘 要院 为了解执兽考试新规实施后在校生的执兽考试现状及所面临的困惑，20212022 年分别对徐州生物工程职业技术学院在读高职兽医相关专业学生进行调查访谈。结果发现：新规实施对在校生的报考和专业学习已产生积极影响，报考率和通过率逐年增加，备考优势明显，但仍存在理论重点把握不足，实践缺乏和综合分析能力薄弱等问题。高职院校需结合自身特点对执业兽医资格考试加强宣传和引导，从融入教学改革、强化技能实践，培养临床应用能力等方面入手，完善“岗课赛证”综合育人机制，培养高素质执业兽医人才队伍。关键词院执业兽医资格考试；现状调查；问题分析基金项目：江苏省高校哲学社会科学研究项目（2021SJA1166）；江苏省高校哲学社会科学研究项目（2022SJYB1279）。作者简介：昌莉丽（1982），女，河南信阳人，副教授，硕士，从事动物医学教学研究，。在校高职兽医专业学生执兽考试现状调查与问题分析以徐州生物工程职业技术学院为例昌莉丽，张林吉，李华坤（徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221006）Investigation and Problem Analysis on the Current Situation of Examination for practicing veterinary physiciansfor Veterinary Students in Vocational CollegesCHANG Li-li,ZHANG Lin-ji,LI Hua-kun（Xuzhou Vocational College of Bioengineering,Xuzhou 221006,PRC）Abstract:In order to understand the current situation and confusion faced by students in higher vocational veterinary related majors in our school after theimplementationofthenewregulationsonveterinaryexamination,asurveyandinterviewwereconductedfrom2021to2022.Itwasfoundthattheimplementationof the new regulations has had a positive impact on the application and professional learning of students on campus,with the application and passing ratesincreasing year by year.Although there are obvious advantages in preparation,there is still a lack of grasp of theoretical focus,Due to the lack of practicalexperience and weak comprehensive analysis ability,vocational colleges need to strengthen the promotion and guidance of practicing veterinary qualificationexams,integrateteachingreform,strengthenskillpractice,andcultivateclinicalapplicationabilitiesbasedontheirowncharacteristics.Theyshouldimprovethecomprehensiveeducationmechanismofjobcoursecompetitioncertificateandcultivateahigh-qualityteamofpracticingveterinarytalents.Key words:Examination for practicing veterinary physicians;Current situation investigation;problem analysisdoi:10.3969/j.issn.1006-4907.2023.04.019Great Britain from 2013 to 2015 J.J Antimicrob Chemother.2017,72(3):691-695.6 Luo J,Yao X,Lv L,et al.Emergence of mcr-1 in Raoultella ornithi原nolytica and Escherichia coli Isolates from Retail Vegetables in ChinaJ.Antimicrob Agents Chemother.2017 Sep 22;61(10):e01139-17.7 Monte DF,Mem A,Fernandes MR,et al.Chicken Meat as a Reser原voir of Colistin-Resistant Escherichia coli Strains Carrying mcr-1Genes in South AmericaJ.Antimicrob Agents Chemother.2017,61(5):e02718-16.8 Hernandez-Alonso E,Barreault S,Augusto LA,et al.dnaJ:a NewApproach to Identify Species within the Genus EnterobacterJ.Micro原biol Spectr,2021,9(3):e0124221.9 Wellington EM,Boxall AB,Cross P,et al.The role of the naturalenvironment in the emergence of antibiotic resistance in gram-negativebacteriaJ.Lancet Infect Dis,2013,13(2):155-165.10 Gallardo-Godoy A,Muldoon C,Becker B,et al.Activity and Pre原dicted Nephrotoxicity of Synthetic Antibiotics Based on Polymyxin BJ.J Med Chem,2016,59(3):1068-1077.11 El-Sayed Ahmed MAE,Zhong LL,Shen C,et al.Colistin and itsrole in the Era of antibiotic resistance:an extended review(2000-2019)J.Emerg Microbes Infect.2020,9(1):868-885.12 Nagy 佗,Sz佴kelyhidi R,Hanczn佴 Lakatos E,et al.Review on theoccurrence of the mcr-1 gene causing colistin resistance in cows milkand dairy productsJ.Heliyon.2021,7(4):e06800.13 Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standardsfor antimicrobial susceptibility testing:twenty-fifth informational sup原plement M100-S26 S.CLSI,Wayne,PA,USA,2016援14 EUCAST.European committee on antimicrobial susceptibility 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