响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究_谢海伟.pdf

化学与生物工程 ，基金项目：惠州学院教授博士科研启动基金项目（），惠州市科技专项项目（），惠州学院教学质量与教学改革工程项目（惠院发 号，），国家自然科学基金面上项目（），广东省基础与应用基础研究基金联合基金项目（）收稿日期：作者简介：谢海伟（），男，吉林桦甸人，博士，教授，研究方向：发酵工程，：。：谢海伟，郑柏曦，陈勇智响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究化学与生物工程，（）：，（）：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究谢海伟，郑柏曦，陈勇智（惠州学院生命科学学院，广东 惠州 ）摘要：在单因素实验的基础上，采用响应面法对石榴皮总黄酮的醇提工艺进行了优化，并对石榴皮总黄酮的抗氧化性能进行了评价。结果表明，石榴皮总黄酮最优醇提工艺条件如下：乙醇体积分数、料液比（）、提取温度 、提取时间，在此条件下，石榴皮总黄酮提取量达到 ，与理论预测值（）的相对误差为 。提取得到的石榴皮总黄酮具有一定的抗氧化活性，对 自由基的清除率随浓度增加逐渐升高。关键词：响应面法；乙醇回流提取；石榴皮；总黄酮；抗氧化性能中图分类号：，（，）：，：，（），（），：；石榴（）属千屈菜科（）石榴亚科（）石榴属（）植物，是集经济、生态、社会效益以及观赏、保健功能于一体的优良落叶果树。从石榴中已分离出的黄酮类化合物有黄酮、黄酮醇、花色素、黄烷醇类等。黄酮类化合物的结构母核是苯基色原酮，以 为骨 架，是 植 物 经光合作 用 产 生 的 一 大 类 化 合物。根据中央三碳链的氧化程度、环连接位置（谢海伟，等：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究 年第期 或位）以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分为黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类、花色素类、黄烷，二醇类、双苯吡酮类、查尔酮类和双黄酮类等 种。研究表明，石榴皮中含有较多的黄酮类物质，普遍具有抗氧化、抗癌、抗诱变、抗血管增生、改善微循环、抑菌消炎、抗衰老、抗病毒等多种生理功能，还具有调节心肌收缩、改善心肌舒张等功能。我国石榴种类繁多，产量丰富，而石榴皮大多被丢弃。为合理利用石榴皮资源，作者在单因素实验的基础上，采用响应面法对石榴皮总黄酮的醇提工艺进行优化，并对石榴皮总黄酮的抗氧化性能进行评价。实验 材料与试剂新鲜石榴，购于网购平台。芦丁标准品 （纯度）；试剂（，二苯基苦基肼）；无水乙醇；氢氧化钠固体（分析纯）；硝酸铝固体（分析纯）。石榴皮提取液的制备选取无虫害、成熟的大石榴，取石榴皮，洗净后于 烘干，粉碎过 目筛，得到石榴皮粉末。精密称取 石榴皮粉末于 圆底烧瓶中，按一定料液比加入一定体积分数的乙醇，摇匀，得到石榴皮溶液。将石榴皮溶液回流提取，趁热抽滤，将滤液置于 容量瓶中，用乙醇定容，即得石榴皮提取液，避光保存，备用。石榴皮总黄酮含量的测定 芦丁标准曲线的绘制精确移取芦丁标准溶液 、，分别置于 容量瓶中，依次加入 乙醇 、；加入亚硝酸钠溶液 ，充分摇匀后放置 ；加入 硝酸铝溶液 ，充分摇匀后放置 ；加入氢氧化钠溶液 ，再加入 乙醇至刻度线，摇匀使其充分反应，放置 ，将溶液倒入比色皿中，以未加芦丁标准溶液作为参比液，测定 处吸光度；以芦丁浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。总黄酮提取量的测定从 容量瓶中移取 石榴皮提取液于 容量瓶中，用 乙醇定容至刻度；再从 容量瓶中移取 石榴皮提取液于 容量瓶中，加入 乙醇 ，按 方法测定 处吸光度，以未加石榴皮提取液作为参比液；依据标准曲线方程计算总黄酮浓度（，），按式（）计算总黄酮提取量（，）：（）式中：为石榴皮粉末质量，。石榴皮总黄酮醇提工艺优化称取石榴皮粉末，按 方法提取石榴皮总黄酮。采用单因素实验，分别考察乙醇体积分数（、）、料液比（、，下同）、提取温度（、）、提取时间（、）对总黄酮提取量的影响。在单因素实验的基础上，选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间为自变量，以总黄酮提取量为响应值，根据 中心组合设计因素水平响应面实验 ，分析各因素交互作用对总黄酮提取量的影响，优化石榴皮总黄酮的醇提工艺。石榴皮总黄酮抗氧化活性测定 通过测定石榴皮总黄酮对 自由基的清除率来评价石榴皮总黄酮的抗氧化性能。准确称取 自由基 ，用无水乙醇溶解并定容至 容量瓶中，配制成浓度为 的 自由基溶液，于冰箱中避光保存，备用。配制梯度浓度（、，）的石榴皮提取液和维生素（）溶液，分别移取各浓度溶液，加入 浓度为 的 自由基溶液，摇匀后避光反应 ，以无水乙醇替代石榴皮提取液或 溶液作为参比，测定 处吸光度，按式（）计算 自由基清除率（）：自由基清除率（）（）式中：为无水乙醇 自由基溶液的吸光度；为无水乙醇样品溶液的吸光度；为样品溶液 自由基溶液的吸光度。结果与讨论 芦丁标准曲线（图）对芦丁标准曲线进行拟合，得到线性回归方程：.，.。醇提工艺的优化 单因素实验结果 乙醇体积分数对石榴皮总黄酮提取量的影响（图）谢海伟，等：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究 年第期 图芦丁标准曲线 图乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响 由图可知，随着乙醇体积分数的增加，石榴皮总黄酮提取量先升高后降低，在乙醇体积分数为 时，总黄酮提取量达到最高。这是因为，当乙醇体积分数较低时，黄酮类化合物未完全溶出，导致总黄酮提取量较低；增加乙醇体积分数，黄酮类化合物的溶解性不断提高，使得黄酮类化合物迅速溶出，导致总黄酮提取量升高；但继续增加乙醇体积分数，溶出的脂溶性物质含量增多，给分离造成困难，影响了总黄酮提取量。因此，确定 为响应面实验乙醇体积分数的中心点。料液比对石榴皮总黄酮提取量的影响（图）图料液比对总黄酮提取量的影响 由图可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，石榴皮总黄酮提取量先升高后降低，在料液比为 时，总黄酮提取量达到最高。这是因为，随着溶剂用量的增加，石榴皮中的黄酮类化合物逐渐溶出，当料液比为 时，扩散达到平衡，黄酮类化合物已基本溶出；继续增加溶剂用量会溶解已经溶出的黄酮类化合物，导致总黄酮提取量降低。因此，确定 为响应面实验料液比的中心点。提取温度对石榴皮总黄酮提取量的影响（图）图提取温度对总黄酮提取量的影响 由图可知，随着提取温度的升高，石榴皮总黄酮提取量先升高后降低，在提取温度为 时，总黄酮提取量达到最高。这可能是因为，升高温度促进了黄酮类化合物的溶出，导致总黄酮提取量升高；但当提取温度超过 时，蛋白质易发生变性或凝固，影响溶出，导致总黄酮提取量下降。因此，确定 为响应面实验提取温度的中心点。提取时间对石榴皮总黄酮提取量的影响（图）图提取时间对总黄酮提取量的影响 由图可知，当提取时间从 延长至 谢海伟，等：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究 年第期 时，石榴皮总黄酮提取量显著升高；之后，继续延长提取时间，总黄酮提取量升幅趋缓，在提取时间为 时达到最高。可能是因为，随着提取时间的延长，石榴皮中的黄酮类化合物溶出量增多，可溶性物质减少，导致总黄酮提取量升高；但当扩散达到平衡后，黄酮类化合物已基本溶出，继续延长提取时间对总黄酮提取量影响不大。因此，确定 为响应面实验提取时间的中心点。响应面实验结果 实验设计及结果分析在单因素实验的基础上，进行因素水平响应面实验，共 组实验，每组重复次，取平均值。响应面实验的因素与水平见表，结果见表。表响应面实验的因素与水平 水平因素.乙醇体积分数.料液比 .提取温度.提取时间 使用 软件对表数据进行多元回归分析，得到石榴皮总黄酮提取量（）与乙醇体积分数（）、料液比（）、提取温度（）、提取时间（）等 个 因 素 的 多 元 回 归 模 型 为：.。对多元回归模型进行方差分析，结果见表。由表可知，模型.，差异极显著，表明实验方法可行；失拟项.，不显著，表明误差导致得到不准确结果的概率较小，可以用此模型进行不同提取条件的实验预测；拟合度.，说明该模型拟合程度好；调整后拟合度 ，而变异系数为 （），表明模型的离散程度低，所得实验结果可靠，表明回归方程对实验拟合情况好，误差小，能较好地描述各因素与响应值之间的真实关系；一次项、，交互项 和二次项、对石榴皮总黄酮提取量的影响都达到极显著水平；一次项，交互项、显著，而交互项、不显著。以上数据表明模型预测良好，可用于确定最佳醇提工艺条件。表响应面实验结果 标准序运行序乙醇体积分数料液比 提取温度提取时间总黄酮提取量 响应面分析各因素交互作用对石榴皮总黄酮提取量影响的响应面图如图所示。由图 可知，交互项 的交互作用极显著（）。当料液比保持不变、乙醇体积分数在 范围内增加时，石榴皮总黄酮提取量不断升高，在乙醇体积分数超过 后降低；当乙醇体积分数保持不变时，总黄酮提取量在料液比大于 时升高，而在小于 时降低。谢海伟，等：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究 年第期 表多元回归模型方差分析 方差来源平方和自由度均方值值显著性模型 极显著.极显著 .极显著.极显著.显著 .极显著.不显著.显著.不显著.显著 不显著 极显著 极显著 极显著 极显著残差 失拟项 不显著纯误差 总离差 拟合度 调整后拟合度 变异系数 由图 可知，交互项 的交互作用不显著（）。当提取温 度 保持不变、乙 醇 体 积 分 数 在 的范围内增加时，总黄酮提取量显著持续升高，在乙醇体积分数超过 后不断降低；在乙醇体积分数保持不变时，总黄酮提取量在提取温度低于 时不断升高，而在提取温度超过 时不断降低。由图 可知，交互项的交互作用显著（）。当乙醇体积分数保持不变、提取时间在 范围内延长时，总黄酮提取量不断升高，在提取时间超过 后不断降低；在提取时间保持不变时，总黄酮提取量在乙醇体积分数低于 时不断升高，而在乙醇体积分数超过 时不断降低。由图 可知，交互项 的交互作用不显著（）。当提取温度保持不变、提取时间在 范围内延长时，总黄酮提取量不断升高，在提取时间超过 后不断降低；在提取时间保持不变时，总黄酮提取量在提取温度低于 时不断升高，而在提取温度超过 时不断降低。由图 可知，交互项 的交互作用显著（）。当料液比保持不变、提取时间在 范围内延长时，总黄酮提取量不断升高，在提取时间超过 后不断降低；在提取时间保持不变时，总黄酮图各因素交互作用对石榴皮总黄酮提取量影响的响应面图 谢海伟，等：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究 年第期 提取量在料液比大于 时升高，而在小于 时不断降低。由图 可知，交互项 的交互作用不显著（）。当料液比保持不变、提取温度在 范围内升高时，总黄酮提取量不断升高，在提取温度超过 后不断降低；在提取温度保持不变时，总黄酮提取量在料液比大于 时升高，而在小于 时不断降低。验证实验根据回归模型可以进一步确定石榴皮总黄酮的最优醇提工艺条件为：乙醇体积分数 、料液比 、提取温度 、提取时间 。考虑到实际操作，调整为：乙醇体积分数、料液比 、提取温度 、提取时间，在最优条件下进行次验证实验，所得石榴皮总黄酮提取量为 ，与理论预测值（）的相对误差为 。说明采用响应面法优化得到的醇提工艺预测性有一定的可参考性，最终所得的最优醇提工艺具有一定的实际应用与参考价值。抗氧化性能评价以 为阳性对照，测定最优工艺条件下提取的石榴皮总黄酮对 自由基的清除能力，结果如图所示。图石榴皮总黄酮对 自由基的清除率 由图可知，随着浓度的增加，石榴皮总黄酮和 对 自由基的清除率均逐渐升高，在浓度分别为 、时，石榴皮总黄酮对 自 由 基 的 清 除 率 依 次 为 、，对 自由基的清除率依次为 、。说明石榴皮总黄酮具有一定的抗氧化活性，但低于。结论在单因素实验的基础上，采用响应面法优化了石榴皮总黄酮的醇提工艺。在乙醇体积分数为、料液比为（）、提取温度为 、提取时间为 的最优条件下，石榴皮总黄酮提取量达到 ，与理论预测值（）的相对误差为 ；提取得到的石榴皮总黄酮具有一定的抗氧化活性，对 自由基的清除率随浓度增加逐渐升高。参考文献：罗华，刘娜，郝兆祥，等 我国软籽石榴研究现状、存在问题及建议中国果树，（）：吕琴石榴皮乙醇提取物对小鼠细胞免疫功能的影响中医临床研究，（）：，（）：，：，（），：，：，（），：，：，：程雷，李梓欣，刘传富，等 响应面法优化蒲公英中菊苣酸的超声提取工艺化学与生物工程，（）：，（）：程江华，任琪，丁之恩石榴皮和石榴叶的总黄酮含量及变化研究食品工业科技，（）：谢海伟，等：响应面法优化石榴皮总黄酮提取工艺及其抗氧化性能研究 年第期 ，（）：秦志华，蔡晴霞，王建琳，等 乙醇加热回流法提取构树叶总黄酮工艺优化研究中国农学通报，（）：，（）：张思懿，许宁侠，方晓艾，等响应面法优化婺源皇菊总黄酮的超声辅助溶剂提取工艺 化学与生物工程，（）：，（）：唐远谋，周金洋 响应面法优化石榴皮多酚提取工艺研究 成都大学学报（自然科学版），（）：，（），（）：邓婷婷，李建华，肖本胜，等响应曲面法优化石榴皮总黄酮提取工艺 湖北工程学院学报，（）：，（）：李颖，侯诗，廖婉婷，等 响应面法优化黄晶果果皮总黄酮提取工艺及抗氧化活性食品科技，（）：，（）：王娜，张昊宇，宁灿灿，等艾草黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究 食品与机械，（）：，（）：，（上接第页），：，（）：，：，：，：，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：