工业生物催化技术.doc

- 页面 1- May2023 生 肠 加 工 过 程 第1卷第1期 12 ChineseJournalofBioprocessEngineering 2023年5月 工业生物催化技术 林章凛，曹竹安，邢新会，刘 铮 (清华大学 化工系生物化学工程研究所，北京 100084 摘 要:以蛋白质酶的工程应用为核心的工业生物催化枝术，被认为是生物技术继生物医药和转奏因植物之后的 第三次浪潮。它的发展与应用将对人类的工业化学过程带来主线的变革。工业生物催化的兴起与以下的两个关 健技术因素有密切的关乎:(1)蛋白质定向进化技术的出现，(2)基因组学和蛋白质组学的发展。探讨了工业生粉 催化技术的现状和发展趋势，并对衷国如何发展该领城的基础和应用研究提出一些见解。 关健词:工业生物催化;生物转化;定向进化;基因组学;蛋白质组学 中图分类号:0814.2 文献标记码:A 文章编号:1672一3678(2023)01一0012一05 Industrialbiocatalysis LINZhang-lin,CAOZhu-an,XINGXin-hui,LIJZheng (DepartmentofChemicalEngineering,TonyhuaUniversity,Beijing100084,China) Abstract:Biocatalysis,theuseofenzymesinindustrialprocesses,is ideredthethudwaveofbiotechnol- revol ogy(afterbiomedicineandtransgenicplants).Ithasthepotentialto utionizethetraditionalchemistry一 relatedindustries.Therapidadvanceinbiocatalysissincehate19906hasbeendriven场twocriticalfactors: (1)newtoolsforenzymeengineeringsuchasdirectedevolution,whichmakeitpossibletotailorenzymesfor industrialuses;and(2)thegerromicsandproteomicsresearch,whichhasprovideahugerepertoireofen- zymesaswellasnewbiosyntheticroutes.Currentstatusanddevelopmenttrendsinbiocatalysisarereviewedin thisreport,alongwithseveralstrategicrecommendationsforthisimportantareaofR&DinChina. Keywords:biocatalysis;enzymeengineering;directedevolution;genomics;proteomics 无论是发达国家还是我国，与化学相关的工业 高，这对国民经济结构的改良与社会发展有重要的 (广义的化学工业)都是国民经济的基础支柱产业之 战略意义。 一。当前，化学工业的发展面临着两个巨大的挑战: (2)传统的化学工业过程的低效与污染问题急 (1)现代的化工很大限度上是以石油的加工为 需解决。自然界的化学过程的核心是“蛋白质酶”的 主，随着石油等不可再生资源的日趋紧张，应及时开 催化，其过程高效温和，与环境兼容。而人类开发的 展替代原料的研究。生物可再生原料将也许是一个 工业化学过程则基本依靠人工的化学催化剂来实 必然的选择。同时，对于我国而言，生物可再生原料 现，通常其过程低效耗能耗原料，对环境不和谐。模 的运用也将带动整个农业的提高和农民收人的提 仿自然界，以蛋白质酶(生物催化剂)来取代人工的 收稿日期:2023-03-24 基金项目:清华大学“百人计划”基金 作者简介:林幸凉(1967-)男，福建人，化学工租学士(清华大学,1990)，分子生物学博士(美国马里兰大学,1946),清华大学“百人计划” 引进人才，化工系专家，博士生手师，中国生物工程学会工业生物技术专业委负会委员。研究方向为蛋白质分子定向进化方法基础及其 应用(dewted-deaderevoletiam)、生物催化与转化(braftlyeisendbiommsf-tim). 万方数据 - 页面 2- 2023年5月 林章凛等:工业生物催化技术 化学催化剂，对人类的工业化学过程进行主线的变 刻的变革。 革，是可连续发展的一个重要趋势。 人们对蛋白质酶的工程应用，已有数十年的期 欧美日已不同限度的制定出在此后数十年内 待。但成功的例子并不多。因素在于长期未解决的 用”绿色的生物过程取代化学过程的战略计划。其 州、瓶颈问题:自然界的酶，都是在特定的生物体的 中，一份美国的21世纪发展规划中提出，到2024 条件下进化而来的。当这些酶被用到条件迥然不同 年，通过生物催化技术，化学工业的原料消耗、水资 的工业过程中时，往往稳定性、活性、或溶液的兼容性 源消耗、能量消耗各减少30%，减少污染物的排放 很差。这使得酶的工业应用的梦想很难实现。但是， 和污染扩散30%。人们已在讨论，生物技术是否 酶并非注定的脆弱。只是在一般温和的生物环境下， 将在医药(生物医药，80年代)和农业(植物转基因 酶无需进化到有更强的适应能力而已。近年来，在严 改造，90年代)之后，为工业化学过程带来以蛋白质 酷环境下(如深海或高温)分离出的各类菌体及其蛋 酶的工程应用为核心的第三次”革命”。无论是时机 白质酶，充足说明酶可以变得很坚强，在严酷条件下 还是技术基础，我们和发达国家在该领域的研究基 依旧保持稳定性与活性。90年代中期出现的蛋白质 本处在同一起跑点，积极发展该领域的研究，对在国 定向进化技术临iectedevolution)，提供了一个有效的 际上抢占学科制高点和对我国的经济及社会发展都 对自然界的蛋白质酶按人类的意愿进行“再进化”的 有极为深远的意义。有愈来愈多的迹象表白，工业 技术手段(enablingtechnology)，使其适应工业条件。 生物催化技术是个处在突破边沿的科技领域，我们 蛋白质酶的工程应用得以迅速地崛起。 只要采用有所为有所不为的策略，选择几个我们确 定向进化技术重要涉及以下几步(见图1): 实有需求有优势、影响面广、且带动力量强的重点突 基因 破口，就能在该领域实现跨越发展。 要做的工作，包含如下三个方面:(l)科学与技 随机突变或 随机杂交 术层面的有效的跨学科的组织;(2)与产业以利润为 一-洲一一一一一一 导向的结合;(3)对政府在战略层面的大力游说和推 一 一今E-一一一一一一 销，争取政府的前期研究投人和政策倾斜。 一一一一减一一一一一一-一一拟一 . -一托一 I工业生物催化的可行性 工业生物催化在上世纪90年代的兴起，与以下 的两个关键技术因素有密切的关系:(l)蛋白质定向 进化技术的出现;(2)基因组学和蛋白质组学的发 展。 工业生物催化的核心是蛋白质酶(生物催化剂) 的应用。由于生物催化剂的温和的条件，高效性和 几代 . 高选择性，它在化学工业上的应用已经具有越来越 大的吸引力。生物催化剂易于催化得到相对较纯的 产品，因此可减少资源的浪费和废物排放。生物催 化剂可以完毕传统化学所不能胜任的位点专一性、 化学专一性和立体专一性催化，有着传统的化学催 化剂不可比拟的优势。生物催化剂的应用，同时有 助于以生物可再生原料来取代矿石原料(如石油)， 或直接从阳光，大气，和土壤来合成化学品。以催化 图1定向进化示意图 fiig.1Meflowchatfwetypicddirectedevohgimexpestrumt 作用为基础的化学品占化工产品的印%，其技术渗 人量占目前化工生产技术的90%。以生物催化剂 逐步取代传统的化学催化剂，将对化学工业带来深 万方数据 - 页面 3- 生粉加工过程 第1卷第1期 1.选择目的基因(蛋白质酶); 生物体内的合成途径来生产化学品提供前所未有的 2.构建基因变种库(libraryofgenevariants); 特殊机会。 3.将变种基因擂人表达载体中(expressionvec- tor) 2国内外工业生物催化技术的现状和发展 4.将载体导人细菌或酵母细胞中进行表达，进 趋势 而表达相应的变种蛋白质(酶); 5，在%孔酶标板上分析检测所得蛋白质(酶) 2.1技术现状 的性能，筛选/选择出好的变种，并找出相应基因; 历经十几年的发展，酶的工业应用已取得了令 6.如有必要，反复上述过程。 人瞩目的成就1.41。采用高效、高选择的酶作为工 定向进化技术，简朴的说就是模拟达尔文的自 业催化剂，开发环境和谐的工艺来生产医药化工产 然进化原理，在实验室的试管中针对某一蛋白质酶 品、精细化工产品、传统化工产品等已在逐步的发展 的基因进行随机突变和随机杂交，以产生大量的突 起来，并在有些领域替代了传统的化工方法，显示出 变种，构建突变库，然后根据特定功能指标对这些蛋 了巨大的潜力。随着研究水平的提高，可以预见，将 白质酶的变种逐个进行筛选(screening)或者进行“适 有更多的产品通过酶催化反映生产。在最近的一篇 者生存”式的选择(selection)，从而得到在特定性能 综述中闭，作者列举了来自3家有重要影响的欧洲 上的优良变种。对得到的优良变种再进行多次相应 公司(BASF,DSM,Lonza)的14个实际生产的新例 的突变或杂交、表达、筛选(或选择)，如此循环得到 子。其中，8个工艺采用纯化的酶,6个采用含相关 符合标准的目的蛋白质酶(见图1)。与自然进化不 酶的微生物做为“反映器”。成功的例子涉及以酶法 同的是，定向进化技术是在人为引发条件下发生，并 生产甜味剂aspartame和以微生物发酵制造除草剂 通过选择突变后的突变种群来保存某一方向的进化 中间体HNA。此外，工业酶应用成功的例子还涉及 而排除其他方向突变，整个进化过程完全是被事先 丙烯酞胺,1,3一丙二醇、和生物可降解塑料的生产。 定向的。定向进化技术是由美国工程院院士、加州 丙烯酞胺(acrylamide)是一种用途广泛的重要有 理工学院(CaliforniaInstituteofTechnology)化工系教 机化工原料，广泛应用于石油、造纸、采矿、洗煤和水 授Dr.FrancesArnold于90年代初期开发出来 解决等领域。运用生物法生产丙烯酞胺是工业酶应 的，它标志着人类可以按照自己的意愿和需要改造 用最成功的例子之一。生物法以其转化率高(卯% 蛋白质酶，甚至在不久的将来设计出自然界中原本 以上)、选择性好、成本低等优点迅速取代了传统的 不存在的全新蛋白质酶。 铜催化水合法。近年来聚丙烯酞胺的需要量增长很 定向进化技术最大的优势在于它具有很强的可 快，而新建的生产工艺都采用生物法生产。 操作性，即简朴的通过模拟达尔文自然进化原理，以 1,3一丙二醇(1,3-propanediol)也是一种重要 多步渐进的方式得到性能改良的变种，使蛋白质酶 的化工原料，由1,3一丙二醇合成的聚醋如聚对苯 在自然界需要几百万年才干完毕的进化过程缩短至 二甲酸丙二醇醋(PTT)等具有良好的性能和美好的 几年甚至几个月。进化技术已被成功地用于改造酶 工业化前景。美国的Dupont公司和世界第二大工 的稳定性、活性、和在非水相的反映性能，大大拓宽 业酶制造商Genencor公司合作开发以葡萄糖为底物 了蛋白质酶的工程应用范围。 生产1,3一丙二醇，进一步生产m，树脂的技术。 当前各类生物体的基因组学(genonucs)和蛋白 欧洲等世界其它国家也积极开展通过发酵法生产 质组学(proteonrics)的研究在快速地发展，这为开发 1,3一丙二醇技术的研究。在菌种上，肺炎杆菌属 人类的疾病的新药，改良物种(如农作物)提供了分 (Klebsiellapneumomae)、丁酸梭状芽抱杆菌属 子水平的科学基础。基因组和蛋白质组研究此外还 (Clostridiumbutyricum)以及在此基础上改造得到的 有一个巨大的但尚未被人们普遍结识到的利益:那 基因工程菌都具有工业应用的前景。 就是提供了大量的潜在可用的生物催化剂。基因组 严重的白色污染问题已引起全世界的关注，许 学和蛋白质组学的发展，也将解密各物种体内的越 多国家正在开发可生物降解的塑料来取代由石油合 来越多的合成途径或新陈代谢途径(含多个基因和 成的塑料，用微生物合成的各种聚经基烷酸醋(poly- 相应的蛋白质酶)，这将为人类改造和直接运用这些 hydetxyalkanoate,PHA)就是其中之一。它具有目前 万方数据 - 页面 4- 2023年5月 林章凛等:工业生物催化技术 使用的塑料的各种物理特性，同时具有生物降解性， 酶来自水相，在非水相中通常容易失活，特别是 是名副其实的生物塑料。但目前细菌发酵法因发酵 与水不相容的有机溶液。然而，00%的化学过程涉 底物和复杂的发酵过程而价格昂贵，无法同化学合 及到有机溶液，因此，解决酶在非水相的活性，是实 成塑料相竞争。科研人员正在通过改变菌株的遗传 现化学过程到生物过程转变的一个关键。 结构，如将其合成关键酶基因转人能运用便宜底物 的菌株如大肠杆菌中，以提高产量、减少成本，以及 3关于我国工业生物催化发展策略的几个 寻找具有新的物理机械特性或者特殊用途的生物可 建议 降解塑料等措施，来增强细菌发酵法生产的生物可 降解塑料的市场竞争力。 3.1技术平台研究 2.2国内外技术发展趋势 (1)开展微生物特别是未培养微生物的高通量 在工业生物催化研究领域有四个趋势:(1)结合 筛选。运用中国江河湖海、森林沼泽中丰富的生物 基因组学和蛋白质组学的研究，开拓蛋白质酶的来 种群资源，筛选特种微生物及其酶，为发展有中国自 源和种类;(2)用以定向进化技术为主的分子生物学 主知识产权的生物催化工业奠定资源基础。组建全 手段来开发适应工业条件的蛋白质酶;.(3)以最新的 国性的国家微生物和相关酶种库，并解决好相关的 植物转基因技术开发植物“生物反映器”;(4)在应用 知识产权问题。 上，向手性化合物合成、有机相生物催化、生物能源、 (2)对定向进化技术自身存在的一些技术问题 生物材料和环境保护方面发展。 进行研究，取得在该重要技术领域具有我国自主知 由于菌种及酶的分离、培养和表达的简易，目前 识产权的基础技术专利。定向进化技术出现比较 工业生物催化剂大多来自微生物体(涉及极端微生 晚，还处在起步时期。目前存在一些基本技术问题亚 物)。相应的，传统的比较成熟的生物催化剂应用形 待发展解决 比如变种库的多样性问题，更高效的筛 式(“反映器，)有两种:(1)蛋白质酶经分离纯化后， 选方法，和蛋白质酶的有活性表达。这将为运用该 加人反映溶液中进行生物转化;(2)直接运用含特定 技术来改良蛋白质酶提供良好的技术平台基础。 蛋白质酶的微生物体(microorpnisms)，以发酵的方 (3)结合传统的溶液工程手段(如添加PEG)和 法来进行生物转化。但如年代以来，随着植物转基 定向进化技术，主攻酶在非水相的活性问题。 因技术的成熟，以植物为“生物反映器”的应用在逐 3，2定向进化技术的应用 步兴起51以植物为生物“反映器”有便宜原料(阳 (1)高端酶产品的开发:以酶的定向进化技术， 光，大气，和土壤)和大规模生产的优势。目前，植物 结合我们在发酵工程的传统优势，来开发数个有自 为生物“反映器”重要是用来生产工业酶(如饲料中 主知识产权的、对国民经济有重大意义的支柱酶产 用的植酸酶)和精细化学品(涉及药品)等。但越来 品(涉及中性纤维素酶、淀粉酶和碱性蛋白酶)，从根 越多的研究已投人大宗化学品的生产(如维生素C 本上改变我国的酶制剂产业低档落后，高端酶制剂 和生物材料)。可以预见的是，随着更多的植物内合 为国外产品垄断的局面，提高我国酶制剂的技术水 成途径(和相关的基因和蛋白质酶)被解密，以植物 平和产品的国际竞争力。其中，中性纤维素酶是纺 作为生物反映器的应用将越来越普遍。这同时将对 织、印染、制衣行业的重要酶种。低温碱性蛋白酶则 农业的产业升级有深远的影响。 是开发符合我国国情的高效洗涤剂的一个关键酶。 手性化合物是国外目前生物技术的一类重要产 酶制剂广泛应用于轻工、食品、化工、医药、农业、能 品，占近90%的已工业化生物转化过程和50%的 源及环保等工业，目前市场规模是10亿美元，商业 产值。如其中的合成手性药物的生物转化反映可分 前景广阔。 为两类:一类是把外消旋体拆分为两个光活性的对 (2)以定向进化技术改善已有的酶法和发酵法 映体。另一类是从外消旋或前手性的前体出发，通 工艺。一个可行的例子是对经基苯甘氨酸(D-HPG) 过催化反映得到不对称的光活性产物。蛋白质酶是 工艺的改善。D-FM是半合成抗生素的重要侧链之 由L一氨基酸组成，其活性中心构成了一个不对称 一。2023年D一HP(的需求量全世界为400吨， 环境，酶只对外消旋底物的单一对映体起作用，从而 2023年将增至550吨。我国国内需求2023年900 实现选择。 吨，大部分靠进口。随着半合成抗生素销售市场的 万方数据 - 页面 5- 生肠加工过程 第1卷第1期 日趋增长，D-HPG蕴藏的巨大的商业价值也逐步 解。POP出现的主线因素在于，大自然界还没有足 显露出来。D-HPG可用化学法或酶法合成。化学 够的时间进化出能降解这些人造有机物的微生物 法由于工艺复杂，环境污染等因素导致生产成本较 体。蛋白质定向进化技术能加速这个进化过程，很 高，市场竞争力差。自从70年代起，用微生物细胞 适合用于开发降解“难降解有机污染物(POP)”的超 生物转化D-HPG获得成功。D-HPG的酶法生产需 级菌。我们可以从开发针对三氯乙烯ME)和聚氯 要两个酶:海因酶(HDTase)和N-氨甲酞-D-氨基酸酞 苯类物(PCB)的超级菌开始。 氨水解酶(DCase)，目前该工艺的关键问题是N-氨 3.3植物作为反映器的开发 甲酞-D-氨基酸酞氨水解酶(Dcase)活性低且不稳定， 以植物作为生物反映器的研究，将对我国的农 与海因酶(HDTase)不匹配。我们可在已有的菌种和 业产业结构的升级和农民收人的提高，有重大的战 工艺的基础上，用蛋白质定向进化技术来改善Dease 略意义。我国在该领域的研究比较落后，应当急追 的活性与稳定性，以获得双酶匹配的高效产D- 赶上。我们应当注重如下的几个方面的工作:(1)植 HPG菌。 物基因组的研究;(2)选择几个有商业前景的植物代 (3)以生物法来生产对国民经济有战略意义的 谢途径进行研究和改造;(3)开发以植物生产大宗工 生物能源，特别是生物制氢和生物柴油。其中一个 业酶及化学品的工艺，如氨基酸、维生素C、饲料酶、 有重大意义的项目是以我国糖蜜工业废液为原料， 和生物材料PHB. 以酶的定向进化技术，多菌偶联和分子水平调控的 新型工程过程为手段，以发酵法生产氢气并解决糖 参考文献 蜜工业废液的污染问题。生物制氢另一深具前景的 川 。己rChemicalResrmcb(DS).new6iuatelysis:Fw d 途径是绿藻的光水解法，目前该法的一个关键问题 toolsfwasastwnble21stcennycLe.wlmdasyM.1499. 2AmddFH.Dimcterlev山tian:Cmamigbiocetal州，阮奴brave 是绿藻氢酶对氧气的敏感。采用蛋白质定向进化技 1.Ch.calFgiveemgSci-,1996,15:5091一5102 术对生产氢气的绿藻氢酶进行进化，使其具有抗氧 3知H,linZ,AnnoldFH.labmstwynvhaionofpemride一medist- 克制的功能，将为实现以绿藻为体系的大规模、经济 dcyilv.eP450hydoaxy1atv.1.Nanne,1999,399:67。一673 型生物制氢，提供技术基础。 4WillieD.m.calsfrombiro山nlagy:moleaJmplantSmaim司 (4)环境保护中一个重要问题是如何降解“难降 山Jlengethedie.calandthefean-tationndamy1.Appli己浦- 解有机污染物(POP)。自然界几乎所有的“非人 cmbidogy&Bioteclmdugy1999,52:135一145. 肠SclvnidA,DmdJc1S,HoomB,etal.Imhostrialbiocatalyststoday 造”有机物，都有相应的微生物体(蛋白质酶)能降 midtotamrow1l.Nanne.200,409:258一268 万方数据