绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价.pdf

一=J 2D O I：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 5-6 5 2 1 2 0 1 3 1 9 0 0 4绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价熊伟，李雄辉+，胡居吾。付建平，涂招秀，王慧宾(江西省科学院应用化学研究所，江西南昌3 3 0 0 2 9)摘要：采用薄膜一均质法制备绿原酸纳米脂质体，并以脂质体包封率为主要考察指标。通过单因素和响应面实验确定了最佳工艺参数：卵磷脂和胆固醇比为5：1(质量比)，卵磷脂和绿原酸比为8 1 3：1(质量比)，均质压力为6 2 M P a。在此条件下，绿原酸脂质体的包封率为7 6 3 2，平均粒径为2 7 8 1n m，电位为一3 2 6 m V。此法制备的绿原酸脂质体具有包封率高、粒径分布均匀、稳定性好等优点。关键词：绿原酸；纳米脂质体；包封率；评价P r e p a r a t i o no fC h l o r o g e n i cA c i dN a n o l i p o s o m ea n di t sQ u a l i t yE v a l u a t i o nX I O N GW e i，L IX i o n g h u i*H UJ u-w u，F UJ i a n-p i n g，T UZ h a o-x i u，W A N GH u i b i n(I n s t i t u t eo fA p p l i e dC h e m i s t r y，J i a n g x iA c a d e m yo fS c i e n c e s，N a n c h a n g3 3 0 0 2 9，J i a n g x i，C h i n a)A b s t r a c t：T h em e m b r a n e-h o m o g e n i z a t i o nm e t h o dw a su s e dt op r e p a r ec h l o r o g e n i ca c i dn a n o l i p o s o m e a n dt h ee n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c yw a st a k e na si n d e x T h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw a sd e t e r m i n e db yt h eO n e-f a c t o ra n dr e s p o n s es u r f a c et e s t s；t h ep h o s p h a 石d y l c h o l i n e：c h o l e s t e r o lw a s5：1，t h ep h o s p h a t i d y l c h o l i n e：c h l o r o g e n i ca c i dw a s8 3：1，t h eh o m o g e n e o u sp r e s s u r ew a s6 2M P a U n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s，t h ee n c a p s u l a t i o ne f f i e i e n cw a s7 6 3 2，t h em e a nd i a m e t e ro fp a r t i c l e sw a s2 7 8 1n m t h eZ E T Ap o t e n t i a lw a s 一3 2 6m V T h ec h l o r o g e n i ca c i dn a n o l i p o s o m ep r e p a r e db ym e m b r a n eh o m o g e n i z a t i o nm e t h o dh a dh i g he n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y，g o o dp a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o na n ds t a b i l i t y K e yw o r d s：c h l o r o g e n i ca c i d；n a n o l i p o s o m e；e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y；e v a l u a t i o n基金项目：江西省科研院所基础设施配套项目(2 0 1 2 3 B B A l 3 0 4 4)作者简介：熊伟(1 9 8 2 一)，男(汉)，助理研究员，硕士研究生，研究方向：天然产物化学。+通信作者：李雄辉(1 9 6 3 一)，男(汉)，研究员，本科，研究方向：天然产物化学。】I w 一1 1 i i i i，m 4 t-I I i 1 _ I 1 1”1，的研究【J 江苏农业科学，2 0 11，3 9(4)：31 4 3 1 5【5 刘袖洞，于炜婷，王为，等海藻酸钠和壳聚糖聚电解质微胶囊及其生物医学应用(J】化学进展，2 0 0 8，2 0(1)：1 2 6 1 3 9 6】路艳华，林红，陈宇岳，等纳米T i 0 2 一壳聚糖对柞蚕丝结构与性能的影响 J 纺织学报，2 0 0 7，2 8(8)：1 5 1 8【7】Z h e n g-k eW，Q i a o-l i n gH，R u o c h o n gF，e ta 1 C h i t o s a nr o dr e i n f o r c e db ys e l f-c r o s s l i n k i n gt h r o u g ht h e r m a lt r e a t m e n t J M a s t e rS c iC h i n a,2 0 0 8，2(2)：2 0 5-2 0 8 8】I s s a mST，A d e l eMG，A d e l eCP，e ta 1 C h i t o s a np o l y e r a sb i o a c t i v ec o a t i n ga n df i l ma g a i n s tA s p e r g i l l u sn i g e rc o n t a m i n a t i o n J I n tJF o o dS c i，2 0 0 5，7 0(2)：1 0 0 1 0 4【9 任建敏壳聚糖抗菌抗氧化活性及其在食品保鲜中应用【J 食品工业科技，2 0 1 2，3 3(1 6)：4 0 0-4 0 2 1 0 A i d e rM C h i t o s a na p p l i c a t i o nf o ra c t i v eb i o b a s e df i l m sp r o d u c t i o na n dp o t e n t i a li nt h ef o o di n d u s t r y J L W T F o o dS c iT e c h n o l，2 0 1 0，4 3 f 6 1：8 3 7 8 3 9【l1】G i a t r a k o uV，N t z i m a n iA，S a v v a i d i sIN，E f f e c to fc h i t o s a na n dt h y m eo i lo nar e a d yt oc o o kc h i c k e np r o d u c t J I n tJF o o dM i c r o b i o l，2 0 1 0，2 7(1)：1 3 2-1 3 6【1 2 1 李春杰，张久龙，孙忠伟壳聚糖的功能性质及其在微胶囊技术中的应用 J】食品工业科技，2 0 1 0，3 1(1 0)：4 1 8 4 1 9 1 3 闻燕，杜予民，李湛，等壳聚糖纳米T i O：复合膜的制备和性能 J 武汉大学学报，2 0 0 2，4 8(6)：7 0 1 7 0 4【14 王若兰植物蛋白为主的可食用膜的研究f D 无锡：无锡轻工大学2 0 0 0 1 5 陈秀芳，肖刚，许时婴，等可食用膜通透性的测定 J】食品科学，1 9 9 7，1 8(6)：1 2 1 5收稿1 5 1 期：2 0 1 3-0 8 1 5万方数据基础研究熊伟，等：绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价绿原酸是由咖啡酸(c a f f e i ca c i d)与奎尼酸(q u i n i ca c i d)组成的缩酚酸【1】，异名咖啡鞣酸，化学名3-0 一咖啡酰奎尼酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物 2 1。绿原酸广泛存在于金银花、杜仲等植物中，其药用历史悠久，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、保肝利胆之功效阳，是许多药材和中成药的主要有效成分之一，同时也是某些中药制剂质量控制的重要指标【7】。绿原酸为极性有机酸，不太稳定【叼，易溶于乙醇、热水、甲醇和丙酮等溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于氯仿、乙醚等弱极性溶剂p 1 0 1。由于绿原酸脂溶性差，结构不稳定，生物利用度低，易被氧化，这大大限制了其在医药和食品等行业的应用。纳米脂质体作为药物载体，是一种相对较新的微胶囊化技术，具有生物相容性好、生物利用度高、防止药物氧化、提高药物稳定性、使被包裹药物具有靶向性、天然无毒、生物可降解、无免疫抑制作用等优点【1 1 2 1。目前，国内鲜有关于绿原酸脂质体的相关报导。本研究以大豆卵磷脂等作载体材料，将绿原酸制备成脂质体制剂，可提高其稳定性和体内生物利用度及靶向作用，以更好发挥药理功效。有效成分的包封率是评价脂质体的主要质量指标。本实验采用薄膜一均质法尝试将绿原酸制备成脂质体，以绿原酸的包封率为主要考查指标，以响应面分析法对影响脂质体包封率的脂材比例、均质压力等条件进行优化，并对制备的绿原酸脂质体从粒径分布、稳定性等方面进行综合评价，旨在为绿原酸脂质体的制备提供参考，为绿原酸系列产品的开发提供理论依据。1 材料与方法1 1 材料与试剂绿原酸样品(纯度9 9 5)：江西省科学院应化所天然产物化学实验室自制；绿原酸对照品：中国药品生物制品检定所；大豆卵磷脂、胆固醇：南昌绿恒科技有限公司进口分装；无水乙醇、乙醚、曲拉通X 一1 0 0、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾(均为分析纯)：天津永大化学试剂厂；乙腈、磷酸(色谱纯)：江苏汉邦有限责任公司；三蒸水：自制。1 2 仪器与设备A g i l e n t l l 0 0 型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；R E 5 2 C S 型旋转蒸发仪：S H Z m 型循环水真空泵：上海亚荣生化科技有限公司；T D 一5 A 型离心机：上海安亭科学仪器厂；P H S 一3 C 型精密p H 计：上海精密科学仪器有限公司；J M 一1 0 0 0 2 型电子天平：余姚市纪铭称重校验设备公司；A L V 一5 0 0 0 激光散射粒径分析仪：J 3=德国A L V 公司。1 3 方法1 3 1 绿原酸样品的制备采用本实验室专利技术，大孔树脂与混合溶剂分相法制备绿原酸【1 3】，经检测绿原酸纯度为9 9 5。1 3 2 绿原酸纳米脂质体的制备精密称取一定比例的卵磷脂、胆固醇和9 9 5 的绿原酸，将绿原酸溶于无水乙醇，卵磷脂、胆固醇用适量乙醚溶予圆底蒸发瓶中，两样混合振摇均匀，于旋转蒸发仪上5 0 减压蒸发至瓶壁成透明薄膜，然后加入适量磷酸盐缓冲液将膜洗下，放置2h 后使其充分水合后，直接进行高压均质即得均匀的绿原酸脂质体混悬液样。分别考虑不同卵磷脂和胆固醇比，卵磷脂和绿原酸比，均质压力对绿原酸脂质体包封率的影响，在进行响应面实验前先进行单因素试验。1 3 2 1 卵磷脂和胆固醇比对绿原酸脂质体包封率的影响在卵磷脂和绿原酸比为4：1(质量比)，均质压力为4 0M P a，分别取卵磷脂和胆固醇比例为1：1、2：1、4：1、6：1、8：1，考虑不同卵磷脂和胆固醇比对绿原酸脂质体包封率的影响，实验结果见图1。1 3 2 2 卵磷脂和绿原酸比对绿原酸脂质体包封率的影响在卵磷脂和胆固醇比为4：1(质量比)，均质压力为4 0M P a，分别取卵磷脂和绿原酸比例为2：1、4：1、6：1、8：1、1 0：1，考虑不同卵磷脂和绿原酸比对绿原酸脂质体包封率的影响，实验结果见图2。1 3 2 3 均质压力对绿原酸脂质体包封率的影响在卵磷脂和胆固醇比为4：1(质量比)，卵磷脂和绿原酸比为8：1，分别取均质压力为2 0、4 0、6 0、8 0、1 0 0M P a，考虑不同均质压力对绿原酸脂质体包封率的影响，实验结果见图3。1 3 3 绿原酸脂质体制备工艺的优化综合前面单因素实验结果，采用响应面法对结果进行优化，根据B o x B e h n k e n 实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析方法，实验因素水平表见表l。表1 实验因素水平表T a b l e1F a c t o r sa n dl e v e l so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s水平i 丽甄而酒西i 面纂象语面i 丽一13：l7：15 004：18：l6 015：l9：l7 0万方数据=4熊伟，等：绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价基础研究1 3 4 包封率的测定1 3 4 1 色谱条件采用H P L C 法检测(参照中国药典(2 0 0 5 舨)。操作条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈一0 4 磷酸溶液(体积比1 3：8 7)为流动相；检测波长为3 2 7n m。理论板数按绿原酸峰计算应不低于10 0 0。1 3 4 2 包封率的测定方法取4 0 0 斗L 绿原酸脂质体样品，用三蒸水稀释后，13 0 0 0r r a i n 转速下离心3 0r a i n。取上清液进样测定游离绿原酸含量，乘以稀释倍数得游离绿原酸浓度C。另取相应等量样品4 0 0“L，加入1 0 t r i t o nX 一1 0 0 溶液进行破乳，加水稀释同样倍数，测定绿原酸含量，乘以稀释倍数得到脂质体中绿原酸总浓度c：，则包封在脂质体内绿原酸浓度C。=C：一C。根据E E()=C o C：1 0 0，可计算出包封率(E E ol。3 5 脂质体的平均粒径和粒度分布取少量脂质体的混悬液，加入一定缓冲液稀释后，装入瓶中于2 5q C 下激光散射仪中进行检测。1 3 6 脂质体电位的测定取少量脂质体的混悬液，加入一定缓冲液稀释后进行测定。1 3 7 脂质体的稳定性将绿原酸脂质体分装在玻璃瓶中，于室温下和4 冰箱中分别贮藏0、1 0、3 0d 后，每次取5 小瓶检测其包封率，并取其平均值，以此考察脂质体的稳定性。2 结果与分析2 1 绿原酸脂质体的制备工艺2 1 1 不同比例的卵磷脂和胆固醇对包封率的影响胆固醇能够调节卵磷脂的凝聚结构，改变膜的通透性，还能影响脂质体的相变温度，进而引起包封率的变化。但胆固醇含量太高，组成脂质体的磷膜量太少，会使脂质体膜形成困难且不牢固旧。不同比例的卵磷脂和胆固醇对脂质体包封率的影响见图1。零褂藕脚6 46 26 05 85 65 45 25 0脂醇比(质量比)图1 不同卵磷脂和胆固醇比对包封率的影响F i g 1E f f e c t so fr a t i oo fp h o s p h a f i d y l c h o l i n et oc h o l e s t e r o lo nt h ee n c a p s u l a t i o n由图1 可知，随着加入胆固醇量的增多，包封率先提高后降低，当卵磷脂和胆固醇比例为4：1 时，脂质体的包封率最高。2 1 2 不同比例的卵磷脂和绿原酸对包封率的影响制备绿原酸脂质体时，卵磷脂与绿原酸比例不同，对包封率有明显影响。绿原酸加入量太多，超过了脂质体能包埋的最大量，会导致脂质膜难以形成。绿原酸加入量太少，则造成卵磷脂利用度不高。不同比例的卵磷脂和绿原酸对包封率的影响见图2。7 5零7 0谆6 5蟊罢5 0脂药比(质量比)图2 不同卵磷脂和绿原酸比对包封率的影响F i g,2E f f e c t so fr a t i oo f p h o s p h a t i d y l c h o l i n et oc h l o r o g e n i ca c i d 雠t h ee n c a p s u l a t i o n由图2 可知，随着脂药比的增大，包封率先提高后降低，当卵磷脂和绿原酸比例为8：1 时，包封率最高。2 1 3 不同均质压力对包封率的影响不同均质压力对包封率的影响见图3。冰替南固均质压力M P a图3 不同均质压力对包封率的影响F i g 3E f f e c t so fh o m o g e n e o u sp r e s s u r eo nt h ee n c a p s u l a t i o n由图3 可以看出，随着均质压力的增加，绿原酸脂质体的包封率表现出先增后减的趋势。究其原因可能是在均质过程中，均质压力对绿原酸脂质体包封率影响是双方面的。一方面，随着均质压力的增大，挤压作用使得脂质体发生渗漏，导致包封率下降。另一方面，高压挤压时，使渗漏在外的绿原酸发生部分电离而产生表面负电荷，增加的负电荷会对脂质体电位产生影响，从而使脂质体混悬液体系更为稳定。所以，在6 0M P a 时候，这两方面作用达到平衡，是较为适宜的均质压力。2 2 绿原酸脂质体制备工艺的优化响应面实验方案及实验结果见表2，回归模型方差分析见表3。本方案共设1 5 个实验点，其中1 2 个分析因子，3 个零点以估计实验误差，各实验点以随机顺万方数据基础研究熊伟，等：绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价表2 实验方案及实验结果T a b l e2D e s i g na n dr e s u l t so fe x p e r i m e n t s表3 回归模型方差分析T a b l e3A N O N A(a n a l y s i so fv a r i a n c e)o fr e g r e s s i o ne q u a t i o n注：+P O 0 5 表示显著；一P 均质压力 脂药比是相互一致的。2 3 脂质体的平均粒径和粒度分布将最佳工艺条件下制备的5 个绿原酸脂质体进行粒度测定，脂质体的平均粒径和粒度分布见表4。表4 绿原酸纳米脂质体的平均粒径和粒度分布T a b l e 4t h em e a nd i a m e t e ro fp a r t i c l e sa n ds i z ed i s t r i b u t i o no fc h i o r o g e n i ca c i dn a n o l i p o s o m e样品1234 5平均由表4 可知，脂质体的平均粒径为2 7 8 1n m，分散度为o 3 0 3，说明制得脂质体的粒径较小、粒度均匀，并且分布范围窄。2 4 脂质体Z e t a 电位的测定对5 个平行样品的电位进行测定，取其平均值，实验结果为一3 2 6m V。一般认为，电位的绝对值大于3 0m V，体系是稳定的。因而此电位下的脂质体混悬液体系比较稳定。2 5 绿原酸脂质体的稳定性由表5 可知，随着贮藏时间的延长，绿原酸脂质体的包封率并无显著变化，显示出良好的稳定性。比较绿原酸脂质体在4 和常温条件下贮藏结果可知，绿原酸脂质体在4 条件下表现出更好的稳定性。表5 绿原酸脂质体的稳定性实验T a b l e 5T h es t a b i l i t ye x p e r i m e n t so fc h l o r o g e n i ca c i dl i p o s o m e3 结论1)采用薄膜一均质法制备绿原酸纳米脂质体，并借助响应面分析法得到与实际拟和程度较高的模型及优化工艺条件：卵磷脂和胆固醇比为5：1(质量比)，卵磷脂和绿原酸比为8 3：1(质量比)，均质压力为6 2 M P a，在此条件下，绿原酸脂质体的包封率为7 6 3 2，平均粒径为2 7 8 1n m，电位为一3 2 6m V。2)薄膜一均质法制备的绿原酸纳米脂质体具有包封率高、粒径分布均匀、稳定性好等优点，因此，具有良好的应用前景。参考文献：1】邓良，袁华，喻宗沅绿原酸的研究进展叨化学与生物工程，2 0 0 5，7：4-6 2】杨敏丽，郝凤霞金银花中绿原酸的分离纯化工艺研究【J 食品科学，2 0 0 7，2 8(7)：2 5 5 2 5 9【3】3杜延兵，裘爱泳绿原酸生物活性、资源及其提取纯化【J】现代食品科技，2 2(2)：2 5 0 2 5 2 4 王宏军，吴国娟，孙健，等绿原酸的药效学研究【J 中兽医学杂志，2 0 0 5(5)：7-11 5】T s o uMF，H u n gCF，L uHF，e ta 1 C h o l r o n e n i ca c i df e r u l i ca c i do nG r o w t ha n da r y l a m i n eN-a c e t v h r a n s f e r a s ea c t i v i t i e si nS h i g e l l as o n n e i(g r o u pD)J】M i c r o b i o s，2 0 0 0，1 0 1：3 7 4 6 6 D o n a s a k iC，S h i n d oT，F u r u h a t aK，e ta 1 I d e n t i f i c a t i o no fc h e m i c a ls t r u c t u r eo fa n t i b a c t e r i a lc o m p o n e n t sa n a i n s tL e n i o n e l l ap a e u m p h i l ai nac o f f e eb e v e r a g e J Y n a e u g a k uZ n s s h i，2 0 0 2，1 2 2：4 8 7 4 9 4【7 罗思齐中草药活性成分含量测定概述 J 中草药，1 9 8 9 2 0(9)：1 9 2 6【8 8张丹H P L C 测定金银花、菌陈及其l O 种中成药中绿原酸的含量硼药物分析杂志，1 9 9 6，1 6(2)：9 9 1 0 3 9】陈伟杜仲叶片绿原酸、总黄酮的提取分离纯化技术研究 D】南京：南京农业大学，2 0 0 7【l O】罗磊，郭晓园金银花中绿原酸的研究进展田农产品加工，2 0 0 8(8)：6 0-6 2 11】蒋正立，朱萍纳米脂质体研究新进展叨海峡药学，2 0 0 8，2 0(11)：5 7 1 2 AG a m e z-H e n s,JMF e m a n d e z-R o m e r o A n a l y t i c a lm e t h o d sf o rt h ec o n t r o lo fl i p o s o m a ld e l i v e r ys y s t e m s J T r e n d si na n a l y t i c a lc h e m i s t r y，2 0 0 6，2 5(2)：1 6 7-1 7 7 1 3 胡居吾，李雄辉，熊伟，等分相萃取法制备高纯度绿原酸的工艺研究 J】食品科学，2 0 1 0，3 1(1 4)：3 7 4 1【1 4 国家药典委员会中国药典：1 部 S】北京：化学工业出版社，2 0 0 5：1 5 2 1 5 3 1 5】熊伟，胡居吾，李雄辉，等薄膜一超声法制备二氢杨梅素脂质体的工艺研究 J】食品工业科技，2 0 1 2，3 3(5)：2 5 4-2 5 7收稿日期：2 0 1 2 0 6 2 6万方数据绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价绿原酸纳米脂质体的制备及其质量评价作者：熊伟，李雄辉，胡居吾，付建平，涂招秀，王慧宾，XIONG Wei，LI Xiong-hui，HU Ju-wu，FUJian-ping，TU Zhao-xiu，WANG Hui-bin作者单位：江西省科学院应用化学研究所,江西南昌,330029刊名：食品研究与开发英文刊名：Food Research and Development年，卷(期)：2013,34(19)本文链接：http:/