Kv7通道开放剂瑞替加滨对小鼠炎症性疼痛的镇痛作用研究.pdf

云南师范大学学报(自然科学版),2 0 2 3,4 3(5):7 4-7 8 h t t p s:/q k g j.y n n u.e d u.c nJ o u r n a l o fY u n n a nN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e sE d i t i o n)D O I:1 0.7 6 9 9/j.y n n u.n s-2 0 2 3-0 7 1K v 7通道开放剂瑞替加滨对小鼠炎症性疼痛的镇痛作用研究*陈衍铭,黄超男,肖欣怡,庄涛*(江苏海洋大学 药学院,江苏 连云港2 2 2 0 0 0)摘要:通过醋酸扭体模型、福尔马林致痛模型和角叉菜胶诱导的炎症性疼痛模型评价K v 7通道开放剂瑞替加滨对炎症性疼痛的镇痛作用.此外,使用K v 7通道拮抗剂X E 9 9 1来评估瑞替加滨对角叉菜胶诱导的机械痛的镇痛作用是否能被逆转.在上述三种炎症性疼痛模型中,瑞替加滨均能以剂量依赖性方式发挥镇痛作用.瑞替加滨(1 0m g/k g)的镇痛作用能被X E 9 9 1(3m g/k g)显著拮抗.瑞替加滨能有效抑制小鼠炎症性疼痛,证明靶向激活K v 7通道的策略可能对治疗炎症性疼痛有效.关键词:K v 7钾通道开放剂;瑞替加滨;炎症性疼痛;镇痛;X E 9 9 1中图分类号:R 9 7 1+.1 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 7-9 7 9 3(2 0 2 3)0 5-0 0 7 4-0 5 疼痛已成为紧随心脑血管疾病和肿瘤之后的第三大健康问题1.慢性疼痛持续时间长,严重影响患者日常工作及生活质量,同时也会影响患者的精神状态,带来了全球性的医疗负担,中国大约有8 0%的慢性疼痛患者尚未获得足够的镇痛治疗2.炎症性疼痛是临床上较常见的慢性疼痛之一3,临床治疗主要有3个难点,一是患者对现有治疗方案存在耐受;二是现有治疗药物副作用多,如阿片类药物的耐受性与成瘾性、非甾体抗炎药带来的胃溃疡及心血管疾病并发症;三是炎症性疼痛持续时间长且周期性发作4.因此开发安全有效的炎症性疼痛治疗药物具有极大的临床意义.瑞替加滨(R e t i g a b i n e,R e t,化学结构式见图1)是首个经美国F D A批准使用的K v 7通道开放剂,具有广谱抗惊厥特性,在绝大多数癫痫动物模型中都表现出活性5-6.此外,瑞替加滨在很多疼痛模型中也是有效的,包括偏头痛和神经性疼痛等,并有望用于炎症性疼痛7.本研究旨在探讨K v 7钾离子通道开放剂瑞替加滨能否有效抑制炎症性疼痛,为炎症性疼痛的临床治疗给予新的靶点和药物支持.图1 瑞替加滨的化学结构F i g.1 C h e m i c a l s t r u c t u r eo f r e t i g a b i n e1 材料与方法1.1 实验动物I C R小鼠购自江苏省邳州市东方养殖有限公司,生产许可证号S C X K(苏)2 0 1 7-0 0 0 3,小鼠体重2 22 8g,雌雄兼用.1.2 药物瑞替加滨(纯度9 9%)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司.角叉菜胶购自杭州晶茂生物科技有限公司;醋酸(分析纯)和福尔马林(分析纯)购自北京市通广精细化工公司.X E 9 9 1购自常州翔龙医药科技有限公司(纯度9 9%).所有化*收稿日期:2 0 2 3-0 5-0 7基金项目:江苏省高等学校重点学科发展计划资助项目(2 0 2 2 J S P A P D 0 0 6);江苏省高等学校自然科学研究面上资助项目(2 1 K J B 3 5 0 0 0 2).作者简介:陈衍铭(1 9 9 5-),男,江苏徐州人,硕士研究生,主要从事镇痛药物药效评价方面研究.通信作者:庄涛.E-m a i l:z h u a n g_t a o h o t m a i l.c o m.合物 均 在 临 用 前 用 无 菌 生 理 盐 水 配 制,按0.1m L/1 0g体重给药.1.3 内脏性疼痛试验I C R小鼠称重并随机分为4组(瑞替加滨5m g/k g组、瑞替加滨1 0m g/k g组、瑞替加滨2 0m g/k g组、模型组和空白对照组),每组8只.各组小鼠灌胃给药或生理盐水3 0m i n后,腹腔注射1%醋酸溶液.每只小鼠置于一个便于观察的透明有机玻璃圆筒中,观察并记录注射醋酸后4 5m i n内小鼠扭体总次数.阳性反应行为(扭体反应行为)包括腹部肌肉的收缩和后肢的伸展等反应.1.4 福尔马林试验4 0只I C R小鼠随机分为空白对照组、模型组、瑞替加滨5m g/k g组、瑞替加滨1 0m g/k g组和瑞替加滨2 0m g/k g组.实验当天,在小鼠右后足套一个小金属环,然后置于透明有机玻璃观察室中适应3 0m i n.各组在灌胃给药或生理盐水3 0m i n后,于小鼠右后足底皮下注射1%福尔马林溶液,然后立即将动物放入Z H-P AN 8 0 1自动疼痛分析系统(安徽正华生物仪器设备有限公司)中,记录4 5m i n内小鼠每分钟抬脚的次数8.福尔马林致痛实验的特征是对疼痛的双相反应:I相(01 0m i n),I I相(1 04 5m i n).镇痛效果=(模型组小鼠的抬脚次数-瑞替加滨治疗组小鼠的抬脚次数)/模型组小鼠的抬脚次数1 0 0%.1.5 角叉菜胶诱导的炎症性疼痛试验角叉菜胶诱发的炎症性疼痛模型模拟临床中的急性炎性疼痛,被广泛运用于药物研究9.使用Z H-Z K L动态足底感觉刺激器(安徽正华生物仪器设备有限公司)的自动化v o nF r e y型系统进行机械超敏反应/异常性疼痛的行为测试1 0.小鼠随机分为空白对照组、模型组、瑞替加滨5m g/k g组、瑞替加滨1 0m g/k g组和瑞替加滨2 0m g/k g组,每组8只.将小鼠置于观察室,用机械针刺激每只小鼠右后足垫.金属针施加的压力(机械力)使小鼠后足突然缩回、抬起或轻弹定义为阳性反应,记录为机械缩足阈值(m e c h a n i c a lw i t h d r a w a lt h r e s h o l d,MWT).在足底皮下注射1%角叉菜胶(2 0L)前测量MWT以获得造模前基线值,3h后重复测量MWT以得到造模后基线值1 1.为了确定瑞替加滨对炎症性机械超敏反应的影响,在给药后3 0、6 0、9 0、1 2 0m i n和1 8 0m i n测定小鼠的机械缩足阈值.镇痛效果=(瑞替加滨治疗后最大机械缩足阈值-造模后基线)/(造模前基线-造模后基线)1 0 0%.1.6 数据处理数据以m e a n S EM表示,并采用G r a p h P a dP r i s m7.0(S a nD i e g o,C A,U S A)进行分析,多重比较采用单因素或双因素方差分析(ANOVA),然后采用D u n n e t t检验进行多重比较.2 结果2.1 瑞替加滨对内脏性疼痛的影响由图2可知,空白对照组小鼠没有发生任何扭体行为.与模型组相比,瑞替加滨剂量依赖性的抑制了醋酸诱导的扭体反应行为,5m g/k g和1 0m g/k g瑞替加滨治疗组小鼠扭体次数分别为3 2.7 5次(P 0.0 1)和2 7.5 0次(P0.0 5),但仍能观察到其对疼痛缓解的趋势.与模型组相比,*P0.0 1,*P0.0 0 1,比较采用单因素方差分析,然后进行D u n n e t t检验.图2 瑞替加滨对小鼠扭体次数的影响F i g.2 E f f e c t o f r e t i g a b i n eo n t h en u m b e r o f t w i s t s i nm i c e2.2 瑞替加滨对福尔马林致痛的影响在实验小鼠的右后足底皮下注射1%福尔马林后会产生双相疼痛反应,即相急性疼痛和相炎症性疼痛1 2.如图3所示,与模型组相比,瑞替加滨给药组小鼠相急性疼痛期阈值无显著性差异,三种剂量的瑞替加滨仅以剂量依赖性的方式抑制了福尔马林诱导的相疼痛,表现为小鼠抬脚 次 数 的 减 少.经 计 算 得 到5、1 0 m g/k g和2 0m g/k g的瑞替加滨对相疼痛的镇痛效果分别为2 1.9 1%、3 6.2 9%和5 5.4 6%(P0.0 5).57 第5期 陈衍铭,等:K v 7通道开放剂瑞替加滨对小鼠炎症性疼痛的镇痛作用研究与模型组相比,*P0.0 5,比较采用单因素方差分析,然后进行D u n n e t t检验.图3 瑞替加滨对福尔马林致痛的影响F i g.3 A n a l g e s i ce f f e c to f r e t i g a b i n e i nf o r m a l i nt e s t2.3 瑞替加滨对角叉菜胶诱导的炎症性疼痛的影响角叉菜胶诱导的痛觉过敏的动物模型模拟了临床炎症条件1 3,实验显示机械过敏发生在角叉菜胶足底皮下注射后3h,小鼠平均机械缩足阈值显著降低.在小鼠表现出炎症性痛觉过敏后,在瑞替加滨治疗后的5个时间点(3 0、6 0、9 0、1 2 0m i n和1 8 0m i n)评估机械性疼痛行为,并将这些时间点的疼痛行为值与基线(0m i n)值进行比较(图4).5、1 0m g/k g和2 0m g/k g瑞替加滨均能以剂量依赖性关系逆转机械性超敏反应行为,最大镇痛效果发生在给予药物9 0m i n时,镇痛持续时间超过1 8 0m i n.与模 型 组 相 比,*P 0.0 5,*P0.0 1和*P0.0 0 0 1,采用双因素差分析,然后进行D u n n e t t检验.图4 瑞替加滨在角叉菜胶诱导的炎症性疼痛中的镇痛作用F i g.4 A n a l g e s i ce f f e c t so fr e t i g a b i n ei nac a r r a g-e e n a n-i n d u c e d i n f l a mm a t o r yp a i n2.4 K v 7通道拮抗剂X E 9 9 1可逆转瑞替加滨在角叉菜胶诱导的炎症性疼痛中的镇痛作用如图5 A和5 B所示,与模型组相比,瑞替加滨(1 0m g/k g)对机械缩足阈值的影响被X E 9 9 1(3m g/k g)显著拮抗.此外,作为对照,还检测了瑞替加滨和X E 9 9 1对正常小鼠机械缩足阈值的影响(图5 C和5 D).结果显示,与空白对照组相比,瑞替加滨或X E 9 9 1对基线均无任何影响,表明瑞替加滨的镇痛作用可能是由激活K v 7钾离子通道介导的.与瑞 替 加 滨1 0 m g/k g组 相 比,#P0.0 5,#P0.0 1,#P 0.0 0 01,采用双因素方差分析,然后进行D u n n e t t检验(图A和图C);与瑞替加滨1 0m g/k g组相比,*P0.0 0 0 1,采用单因素方差分析和D u n n e t t检验(图B和图D).图5 X E 9 9 1可逆转瑞替加滨在角叉菜胶诱导的炎症性疼痛中的镇痛作用F i g.5 X E 9 9 1r e v e r s e s t h e a n a l g e s i c e f f e c t o f r e t i g a b i n e i nc a r r a g e e n a n-i n d u c e d i n f l a mm a t o r yp a i n67云南师范大学学报(自然科学版)第4 3卷 3 讨论钾通道被认为是近年来开发镇痛药的一个很有前途的靶点,神经元K v 7通道的强效非选择性开放剂瑞替加滨的镇疼作用引起了广泛关注.本研究旨在评估瑞替加滨能否有效减弱炎症性疼痛,为炎症性疼痛的临床治疗给予新的靶点和药物支持.研究中使用的三种动物模型均为评价炎症性疼痛镇痛药药效的经典模型且具有互补性,操作简便、动物反应灵敏且重复性好.醋酸诱导的扭体模型常被用来筛选炎症性疼痛镇痛药,因为它能立即激活支配腹膜的内脏痛觉感受器,并引起皮下肌壁和膈下内脏器官的炎症1 4.福尔马林实验的相依赖于神经递质(如5-羟色胺、缓激肽和组胺)的释放以及神瞬态电压感受电位锚定蛋白1(T R P A 1)的激活.相也被称为炎症阶段,涉及炎症介质,例如细胞因子(I L-1、T N F-和I L-3 3)和前列腺素,这是在福尔 马林刺激下 产生的1 5.实验动物足底皮下注射角叉菜胶时会出现局部毛细血管扩张、血管通透性增高、渗出和水肿等一系列类似于人体急性炎症的反应1 6.研究结果表明,瑞替加滨灌胃给药后,可显著抑制醋酸诱导的小鼠痛觉行为、福尔马林致痛行为和角叉菜胶诱导的小鼠机械性痛觉过敏.为了探讨瑞替加滨的镇痛作用是否由K v 7通道的激活所介导,使用X E 9 9 1来评估瑞替加滨对角叉菜胶诱导的炎症性疼痛的镇痛作用是否能被逆转.X E 9 9 1是一种被广泛认可的K v 7/M通道阻断剂,可有效抑制K v 7.1、K v 7.2、K v 7.2+K v 7.3通道和M电流,半抑制浓度值分别为0.7 5、0.7 1、0.6m o l/L和0.9 8m o l/L1 7.据文献报道,3m g/k g的X E 9 9 1可以有效地阻断K v 7通道,因此它常被用来研究神经元电压门控钾K v 7/K C NQ/M-电流与疾病之间的关系1 8-1 9.研究结果表明,X E 9 9 1几乎完全逆转了瑞替加滨的抗机械性痛敏作用,表明K v 7通道的激活可能是瑞替加滨发挥镇痛作用的重要原因之一.在课题组前期的研究中发现,K v 7钾离子开放剂氟吡汀对炎症性疼痛的抑制作用同样被X E 9 9 1几乎完全拮抗2 0.由此可知,靶向激活K v 7通道的策略可能在治疗炎症性疼痛中有效.综上,瑞替加滨能有效抑制小鼠炎症性疼痛,靶向激活K v 7通道的策略为炎症性疼痛的临床治疗给予新的靶点和药物支持.参考文献:1 T R E E D ERD,R I E FW,B A R K EA,e t a l.Ac l a s s i f i-c a t i o no f c h r o n i cp a i nf o r I C D-1 1J.P a i n,2 0 1 5,1 5 6(6):1 0 0 3.2 TUR KDC,F I L L I N G I M RB,OHR B A CH R,e ta l.A s s e s s m e n t o f p s y c h o s o c i a l a n d f u n c t i o n a l i m p a c t o fc h r o n i cp a i nJ.T h eJ o u r n a lo fP a i n,2 0 1 6,1 7(9):T 2 1-T 4 9.3 B URMA N E,L E D U C-P E S S AH H,F AN C Y,e ta l.A n i m a l m o d e l so fc h r o n i c p a i n:a d v a n c e sa n dc h a l l e n g e s f o r c l i n i c a l t r a n s l a t i o nJ.J o u r n a l o fN e u-r o s c i e n c eR e s e a r c h,2 0 1 7,9 5(6):1 2 4 2-1 2 5 6.4 MU L E Y M M,K R U S T E V E,MC D OUG A L LJJ.P r e c l i n i c a l a s s e s s m e n t o f i n f l a mm a t o r yp a i nJ.C N SN e u r o s c i e n c e&T h e r a p e u t i c s,2 0 1 6,2 2(2):8 8-1 0 1.5 R I V E R A-A R C ONA D AI,V I C E N T E-B A ZJ,L O P-E Z-G A R C I AJA.T a r g e t i n g K v 7c h a n n e l si np a i np a t h w a y sJ.O n c o t a r g e t,2 0 1 7,8(8):1 2 5 5 4.6 S H IS,L IJ,S UN F,e ta l.M o l e c u l a rm e c h a n i s m sa n ds t r u c t u r a lb a s i so f r e t i g a b i n ea n a l o g u e s i nr e g u-l a t i n gK C NQ 2c h a n n e lJ.T h eJ o u r n a lo f M e m-b r a n eB i o l o g y,2 0 2 0,2 5 3:1 6 7-1 8 1.7 MA TH I A SSV,A B OU-KHA L I LB W.E z o g a b i n es k i nd i s c o l o r a t i o ni sr e v e r s i b l ea f t e rd i s c o n t i n u a t i o nJ.E p i l e p s y&B e h a v i o rC a s eR e p o r t s,2 0 1 7,7:6 1-6 3.8 HAYA S H IH,I WA T A M,T S U CH I MO R IN,e t a l.A c t i v a t i o no fp e r i p h e r a lK C NQc h a n n e l sa t t e n u a t e si n f l a mm a t o r yp a i nJ.M o l e c u l a rP a i n,2 0 1 4,1 0:1-9.9T AMA D D O N F A R D E,F A R S H I D A A,E GH D AM IK,e t a l.C o m p a r i s o no f t h e e f f e c t s o f c r o c i n,s a f r a n a l a n dd i c l o f e n a co n l o c a l i n f l a mm a t i o na n d i n f l a mm a t o r yp a i nr e s p o n s e s i n d u c e db yc a r r a g e e n a n i nr a t sJ.P h a r m a c o-l o g i c a lR e p o r t s,2 0 1 3,6 5(5):1 2 7 2-1 2 8 0.1 0T S A IDS,HUAN G M H,T S A I JC,e t a l.A n a l g e s i ca n da n t i-i n f l a mm a t o r ya c t i v i t i e so fR o s a t a i w a n e n s i sn a k a i i nm i c eJ.J o u r n a l o fM e d i c i n a l F o o d,2 0 1 5,1 8(5):5 9 2-6 0 0.1 1D J OUHR IL.P G 1 1 0,ah u m a n i z e da n t i-N G Fa n t i-b o d y,r e v e r s e se s t a b l i s h e dp a i nh y p e r s e n s i t i v i t yi n77 第5期 陈衍铭,等:K v 7通道开放剂瑞替加滨对小鼠炎症性疼痛的镇痛作用研究p e r s i s t e n ti n f l a mm a t o r y p a i n,b u t n o t p e r i p h e r a ln e u r o p a t h i cp a i n,r a t m o d e l sJ.P a i n M e d i c i n e,2 0 1 6,1 7(1 1):2 0 8 2-2 0 9 4.1 2G ON GN,HUAN G Q,CHE N Y,e ta l.P a i na s s e s s-m e n t u s i n g t h e r a t a n dm o u s e f o r m a l i n t e s t sJ.B i o-p r o t o c o l,2 0 1 4,4(2 1):e 1 2 8 8.1 3S T E P ANOV I C-P E T R OV I C R M,M I C OV A M,T OM I CM A,e t a l.A n t i h y p e r a l g e s i c/a n t i n o c i c e p t i v ee f f e c t so f c e f t r i a x o n ea n di t ss y n e r g i s t i c i n t e r a c t i o n sw i t hd i f f e r e n t a n a l g e s i c s i n i n f l a mm a t o r yp a i n i nr o-d e n t sJ.A n e s t h e s i o l o g y,2 0 1 4,1 2 0(3):7 3 7-7 5 0.1 4AKUO D ORGC,MB AHCC,ANYA L EWE CH INA,e ta l.P h a r m a c o l o g i c a lp r o f i l eo fa q u e o u se x t r a c to fB r i d e l i a f e r r u g i n e as t e mb a r k i nt h er e l i e fo fp a i na n df e v e rJ.J o u r n a lo fM e d i c i n a lP l a n t sR e s e a r c h,2 0 1 1,5(2 2):5 3 6 6-5 3 6 9.1 5B A G D A SD,A L S HA R A R ISD,F R E I T A SK,e t a l.T h er o l eo fa l p h a 5n i c o t i n i ca c e t y l c h o l i n er e c e p t o r si nm o u s em o d e l so fc h r o n i ci n f l a mm a t o r ya n dn e u-r o p a t h i cp a i nJ.B i o c h e m i c a lP h a r m a c o l o g y,2 0 1 5,9 7(4):5 9 0-6 0 0.1 6F E R NAN D O MP,A L B E R T OHL,GUA D A L U P EVD M,e ta l.N e o-c l e r o d a n ed i t e r p e n i ci n f l u e n c ei nt h ea n t i n o c i c e p t i v ea n da n t i-i n f l a mm a t o r yp r o p e r t i e so fS a l v i a c i r c i n n a t aC a vJ.J o u r n a l o fE t h n o p h a r m a-c o l o g y,2 0 2 1,2 6 8:1 1 3 5 5 0.1 7CHE N Y,X I AO X,HUAN GC,E T A L.F l u p i r t i n ea n da n t i h i s t a m i n e se x e r ts y n e r g i s t i ca n t i-n o c i c e p t i v ee f f e c t s i n m i c eJ.P s y c h o p h a r m a c o l o g y,2 0 2 3,2 4 0(4):8 8 1-8 9 7.1 8WAN GJ,L I U Y,HUF,e ta l.A c t i v a t i o no fn e u r o-n a l v o l t a g e-g a t e dp o t a s s i u m K v 7/K C NQ/M-c u r r e n tb yan o v e l c h a n n e l o p e n e rS C R 2 6 8 2 f o r a l l e v i a t i o no fc h r o n i cp a i nJ.J o u r n a lo fP h a r m a c o l o g ya n dE x-p e r i m e n t a lT h e r a p e u t i c s,2 0 2 1,3 7 7(1):2 0-2 8.1 9L IH,WANGF,WANGX,e t a l.A n t i n o c i c e p t i v ee f-f i c a c yo fr e t i g a b i n ei nt h em o n o s o d i u ml o d o a c e t a t er a tm o d e l f o ro s t e o a r t h r i t i sp a i nJ.P h a r m a c o l o g y,2 0 1 5,9 5(5-6):2 5 1-2 5 7.2 0CHE N Y M,X I AO X Y,HUANGC N,e ta l.F l u-p i r t i n ea n da n t i h i s t a m i n e se x e r ts y n e r g i s t i ca n t i-n o-c i c e p t i v ee f f e c t si n m i c eJ.P s y c h o p h a r m a c o l o g y,2 0 2 3,2 4 0(4):8 8 1-8 9 7.A n a l g e s i cE f f e c t so f t h eK v 7C h a n n e lO p e n e rR e t i g a b i n eo nI n f l a mm a t o r yP a i n i nM i c eC H E NY a n m i n g,H U A N GC h a o n a n,X I A OX i n y i,Z H U A N GT a o*(S c h o o l o fP h a r m a c y,J i a n g s uO c e a nU n i v e r s i t y,L i a n y u n g a n g2 2 2 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:T h ea n a l g e s i ce f f e c t so fK v 7c h a n n e l o p e n e r r e t i g a b i n eo ni n f l a mm a t o r yp a i nw e r ee v a l u a t e db yaa c e t i ca c i dw r i t h i n gt e s t,a f o r m a l i n-i n d u c e dp a i nm o d e l,a n dac a r r a g e e n a n-i n d u c e d i n f l a mm a t o r yp a i nm o d e l i n t h i s s t u d y.I na d d i t i o n,t h eK v 7c h a n n e l a n t a g o n i s tX E 9 9 1w a su s e d t oa s s e s sw h e t h e r t h ea n a l g e s i ce f f e c to fr e t i g a b i n eo nc a r r a g e e n a n-i n d u c e d m e c h a n i c a la l l o d y n i ac o u l db er e v e r s e d.I na l lt h r e e i n f l a mm a t o r yp a i nm o d e l sd e s c r i b e da b o v e,r e t i g a b i n ee x e r t e da n a l g e s i c e f f e c t s i nad o s e-d e p e n d-e n tm a n n e r.T h ea n a l g e s i ce f f e c to fr e t i g a b i n e(1 0m g/k g)w a ss i g n i f i c a n t l ya n t a g o n i s e db yX E 9 9 1(3m g/k g).R e t i g a b i n ew a s e f f e c t i v e i ns u p p r e s s i n g i n f l a mm a t o r yp a i n i nm i c e a n d t h e s t r a t e g yo f t a r g e t e da c t i v a t i o no fK v 7c h a n n e l sm a yp r o v e t ob ee f f e c t i v e i nt h e t r e a t m e n to f i n f l a mm a t o r yp a i n.K e y w o r d s:K v 7c h a n n e l o p e n e r;R e t i g a b i n e;I n f l a mm a t o r yp a i n;A n a l g e s i a;X E 9 9 187云南师范大学学报(自然科学版)第4 3卷