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7 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3基金项目：深圳市科技计划资助项目（JCYJ20180306174928402）通信作者：庄鹏，Email： 引用格式：伍芷菁，张文苑，许智淇，等.CRISPR/Cas9沉默Fas可抑制急性肝衰竭细胞线粒体自噬及减轻线粒体损伤J/CD.新发传染病电子杂志，2023,8（3）：7-11.Wu Zhijing,Zhang Wenyuan,Xu Zhiqi,et al.CRISPR/Cas9 silencing Fas inhibits autophagy formation and mitochondrial damage in acute liver failure cellsJ/CD.Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,2023,8(3):7-11.论著伍芷菁，张文苑，许智淇，庄鹏（中山大学附属第八医院感染性疾病科；广东 深圳 518033）CRISPR/Cas9沉默Fas可抑制急性肝衰竭细胞线粒体自噬 及减轻线粒体损伤【摘要】目的 探讨凋亡相关因子(Fas/CD95)在急性肝衰竭疾病进展中的作用及机制。方法 构建刀豆蛋白A诱导的急性肝衰竭小鼠动物模型，通过透射电子显微镜及免疫印迹检测了急性肝衰竭肝细胞内的线粒体自噬发生；在小鼠尾静脉输注靶向Fas基因的CRISPR/Cas9质粒，随后予以刀豆蛋白A诱发急性肝衰竭，检测小鼠肝组织急性损伤情况及肝细胞内线粒体自噬及线粒体损伤的变化，同时体外转染靶向Fas的CRISPR/Cas质粒到细胞内，刀豆蛋白A诱导HepG2肝细胞损伤，验证Fas敲除后对线粒体自噬和线粒体损伤的影响。结果 刀豆蛋白A可诱导小鼠急性肝衰竭，透射电镜观察发现肝细胞中发生了线粒体自噬，肝细胞内p62蛋白水平降低，PINK1/Parkin的蛋白上调，Fas的表达上调；小鼠肝组织和体外肝细胞先予以PX330Fas质粒转染，再予以刀豆蛋白A诱导肝损伤后，LC3II/LC3I表达比值减低，p62蛋白的表达得到恢复，线粒体蛋白COX4I1和线粒体DNA含量的水平下降，Fas表达下调，与转染空白质粒的对照组相比，差异均有统计学意义。结论 CRISPR/Cas9沉默Fas抑制急性肝衰竭进展及肝细胞内线粒体自噬的发生和线粒体损伤，从而减轻急性肝衰竭的细胞死亡，为临床开展急性肝衰竭的新治疗策略提供了新依据和新靶点。【关键词】急性肝衰竭；线粒体；自噬；死亡受体Fas/CD95；线粒体损伤 DOI：10.19871/ki.xfcrbzz.2023.03.002 【中图分类号】R575.3CRISPR/Cas9 si lencing Fas inhibits autophagy formation and mitochondrial damage in acute l iver fai lure cel lsWu Zhijing,Zhang Wenyuan,Xu Zhiqi,Zhuang Peng(Department of Infectious Diseases,The Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Shenzhen,518033,China)【Abstract】Objective In order to explore the role and mechanism of the death receptor Fas/CD95 in the progression of acute liver failure.Method We first established,a mouse animal model of ALF induced by concanavalin A(Con A).The formation of mitophagy in hepatocyte with ALF was detected by Western blot and transmission electron microscopy.Then,Knocking out Fas by administering CRISPR/Cas9 plasmid through the tail vein of mice,and then acute liver failure of mouse was induced by Con A,liver tissue injury,the formation of mitophagy and mitochondrial damage were detected.We treated HepG2 that knocked out Fas with Con A in vitro to detect the expression of mitochondrial autophagy related proteins and mitochondrial damage.Result The results show that after acute liver failure induced by concanavalin A in mice,transmission electron microscopy observation revealed mitochondrial autophagy in liver cells,a decrease in p62 protein levels,upregulation of PINK1/Parkin protein,and upregulation of Fas expression.After transfection with PX330Fas plasmid,the expression ratio of LC3II/LC3I in mouse liver tissue and in vitro liver cells decreased,the expression of p62 protein was restored,the levels of mitochondrial protein COX4I1 and mitochondrial DNA content decreased,and Fas expression was downregulated,with significant statistical significance.Conclusion In this study,we found that CRISPR/Cas9 silencing Fas inhibits the progression of ALF，the formation of mitochondrial autophagy and mitochondrial damage in hepatocytes.【Key words】Acute liver failure;Mitochondria;Autophagy;Death receptor Fas/CD95;Mitochondrial damage新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.38 急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是由多种因素引起的急性肝细胞坏死或肝细胞功能严重障碍导致的临床综合征，内科治疗缺乏特效药物，病情进展迅速1-3，严重影响患者预后。Fas是肿瘤坏死因子受体家族中的重要一员，前期的研究证实Fas参与了ALF的进程4。近来发现Fas通过调控肝细胞自噬可参与肝纤维化的进程5。过度的线粒体自噬会显著降解细胞内的线粒体，从而带来线粒体损伤、细胞能量代谢障碍和细胞死亡6-7。对Fas参与的ALF中是否也存在线粒体过度自噬现象并不清楚，本研究旨在阐明Fas是否可通过自噬影响线粒体质量介导ALF的进程，从而为肝衰竭的发病机制和临床治疗提供新思路。1 资料与方法1.1 一般资料1.1.1 实验动物 SPF级别的C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半，10周龄，体质量2025g，购自广东药康生物科技有限公司。实验前使实验小鼠每天维持在12h（暗）/12h（光）循环环境中。本研究通过中山大学附属第八医院伦理委员会批准（2019-014-01）。1.1.2 仪器和试剂 靶向Fas基因的pX330质粒系统由香港中文大学惠赠；RNA提取试剂盒购自成都福际生物技术有限公司；RNA逆转录试剂盒、SYBR qPCR定量试剂盒购自TAKARA公司；刀豆素A购自Sigma公司，Dneasy Blood&Tissue kit购自QIAGEN公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）检测试剂盒、采用丙二醛（malondialdehyde，MDA）脂质氧化检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。1.2 研究方法1.2.1 刀豆蛋白A诱发小鼠ALF模型的建立 将10周龄的C57BL/6J小鼠随机分为正常组和模型组，每组10只，雌雄各半。模型组使用刀豆蛋白A以15mg/kg的剂量通过尾静脉注射至小鼠体内，分别在0h和4h两个时间点将小鼠处死，分别取小鼠肝脏组织以及血液样本。小鼠肝组织用10%福尔马林固定10min；切片加入60%的异丙醇，油红O染色液中密闭染色1015min，Mayer苏木素复染核5min，甘油明胶封片。血液样本通过ELISA检测ALT和AST的含量。使用总RNA提取试剂盒提取肝组织RNA，将RNA反转录成cDNA，根据荧光定量PCR试剂盒在实时荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR，Fas靶点的PCR引物序列为：5-GCACAGAAGGGAAGGAGTAC-3（正向）和5-ACTGGAGGTTCTAGATTCAGG-3（反向）。1.2.2 靶向Fas基因的CRISPR/Cas质粒尾静脉输注小鼠 将10周龄的C57BL/6J小鼠随机分为实验组（PX330-Fas-G1）和对照组（PX330-GFP），每组10只，雌雄各半。实验组高压尾静脉注射运输CRISPR/Cas系统（PX330-Fas-G1）至小鼠肝脏内部；对照组注射空白质粒PX330-GFP。24h后，小鼠尾静脉注射15mg/kg刀豆蛋白A至小鼠体内。通过油红O染色结合ALT和AST生化指标评估小鼠在CRISPR/Cas系统注射至体内后肝脏的损伤情况；生化实验检测肝细胞内线粒体自噬的发生情况。实时荧光定量PCR法检测Fas基因mRNA的表达。1.2.3 透射电镜检测ALF小鼠线粒体自噬 小鼠肝脏在冰上切块，2.5%戊二醛中固定，4保存；1%锇酸固定2h，于浓度为50%、70%的乙醇内分别浸洗1次，10min/次，于浓度为80%、90%的丙酮内分别洗涤2次，10min/次，于无水丙酮连续洗涤2次，10min/次；采用Epon812环氧树脂包埋，60温箱中聚合8h；超薄切片双重染色后透射电镜观察。1.2.4 HepG2细胞的培养和转染 5%CO2、37培养箱培养HepG2肝细胞。分别转染靶向Fas的PX330-Fas-G1质粒和空白质粒pX330-GFP到细胞。分别设置调零孔、对照孔、加药孔。加药孔接受刀豆蛋白A处理，另设无细胞的培养基为调零孔。细胞分别接种96孔板培养72h，加药孔每孔加入15g/ml的刀豆蛋白A 10l处理6h。1.2.5 蛋白印迹法检测线粒体自噬标志蛋白 收取小鼠肝组织和HepG2肝细胞的蛋白，在二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）定量测定蛋白浓度后，进行蛋白质印迹法检测肝组织和细胞内P62、LC3、PINK1、Parkin、ACTB、COX4I1蛋白表达变化。1.2.6 MDA含量和ATP检测 收集小鼠肝组织和HepG2肝细胞加入适量的裂解液处理后，12 000g、4离心10min；取上清测序其在535nm的吸光值，根据标准曲线计算得到样品中MDA含量。另外按说明书配制好ATP检测工作液，用多功能酶标仪测定RLU值，根据标准曲线计算样品中的ATP浓度。1.2.7 苏木素-伊红（HE）染色 小鼠肝组织石蜡固定切片后脱蜡处理，依次通过100%、90%、80%、70%酒精处理将切片梯度水化（每个梯度2min）；苏木素中浸染12min，清洗后置于伊红溶液中浸染5min，中性树胶封片后拍照。1.3 统计学处理 所有数据均采用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料经检验符合正态分布，采用x-s表示，两样本间比较采用t检验。计数资料采用例（%）表示，进行2检验。组间比较使用单因素方差分析，P0.05为有差异统计学意义。9 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.32 结果2.1 刀豆蛋白A诱导小鼠急性肝衰竭 采用刀豆蛋白A处理小鼠诱导建立小鼠急性肝衰竭模型，提取肝组织进行切片染色观察检测发现，与对照组相比，应用刀豆蛋白A可导致小鼠肝脏淤血沉积，光镜下可见肝窦内红细胞淤积，血清检测ALT、AST明显升高，提示成功构建急性肝衰竭小鼠动物模型（图1）。通过实时荧光定量PCR，发现刀豆蛋白A处理后小鼠肝细胞内Fas的mRNA表达显著上升（图2），与处理前相比，差异有统计学意义（P0.01）。图1 刀豆蛋白A诱导小鼠急性肝衰竭。a：注射刀豆蛋白A，4h后可见小鼠肝脏淤血沉积，肝脏明显变暗。b：光镜下可见肝内淋巴细胞增多，肝窦内红细胞淤积。c：诱导急性肝衰竭后ALT显著上升。图2 诱导小鼠急性肝衰竭后Fas基因mRNA表达显著上升2.2 急性肝衰竭时小鼠肝细胞内线粒体自噬发生情况透射电镜观察发现刀豆蛋白A处理后肝细胞内有线粒体自噬的形成（图3a）；提取小鼠肝组织进行LC3蛋白、p62蛋白表达监测，观察到急性肝衰竭时肝细胞内p62蛋白水平降低（图3b），PINK1/Parkin的蛋白表达呈现上调（图3c）。2.3 CRISPR/Cas9敲除Fas基因抑制ALF小鼠肝细胞坏死凋亡 通过高压小鼠尾静脉注射运输CRISPR/Cas9系统富集到肝组织后，24h后再用刀豆蛋白A处理小鼠，组织染色发现小鼠肝细胞坏死明显减少（图4a、图3 小鼠肝细胞内线粒体自噬发生情况。a：刀豆蛋白A处理6h后，通过透射电子显微镜观察到线粒体自噬结构（黑色箭头，200）。b：免疫印迹显示P62、LC3II在细胞内表达情况。c：免疫印迹检测PINK1、Parkin在线粒体中表达上调。b），且ALT、AST值（图4c、d）两组差异显著（P 0.001)，与空白质粒注射的对照组相比，pX330-Fas-G1质粒注射的实验组Fas基因mRNA和Fas蛋白的表达明显下调(P0.001)（图4ef）。图4 CRISPR/Cas9敲除Fas基因抑制急性肝衰竭小鼠肝细胞坏死凋亡。ab：pX330-Fas治疗的小鼠肝组织缺血坏死减轻。cd：ALT和AST水平明显降低。ef：CRISPR/Cas9系统作用后Fas基因mRNA表达显著抑制，蛋白质印迹法检测结果显示实验组Fas蛋白表达明显下调，且肝细胞内Caspase3蛋白几乎检测不到。(*P0.001)。abccdefab对照组试验组bca模型组正常组浓度（U/L）正常组模型组新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.310 2.4 CRISPR/Cas9质粒系统敲除Fas基因抑制肝细胞线粒体自噬 小鼠肝组织蛋白生化检测结果显示，与对照组（PX330-GFP）相比，靶向Fas的PX330Fas质粒转染后LC3II/LC3I表达比值减低，p62蛋白的表达得到回复（图5a），差异有统计学意义（P0.01）；而线粒体蛋白COX4I1和线粒体DNA含量的水平下降（图5b、c）；进一步检测发现敲降Fas后降低了小鼠肝组织中的脂质氧化物含量（图5d）。同时可上调组织内ATP的含量（图5e），与对照组相比，差异均有统计学意义（P0.01），结果表明敲除Fas后抑制线粒体自噬有助于改善刀豆蛋白A诱导的肝细胞的生物能代谢障碍。图5 CRISPR/Cas9敲除Fas后的小鼠肝细胞的线粒体的损伤。ab：蛋白质印迹法检测敲除Fas后小鼠肝组织中自噬相关蛋白的表达量。c：敲除Fas后，肝细胞内线粒体DNA含量增加。de：试剂盒检测敲除Fas后，肝组织内MDA的释放量及ATP生成量。（与对照组相比，*P 0.001）。2.5 靶向Fas基因的质粒转染后抑制体外肝细胞线粒体自噬和线粒体损伤情况 体外肝细胞敲低Fas后LC3I表达下调，p62蛋白水平升高（图6a），而线粒体自噬蛋白PINK1和Parkin表达明显下调（图6b），与对照组相比，差异有明显统计学意义（P 0.01），说明敲除Fas抑制线粒体自噬发生；与对照组相比，CRISPR/Cas9质粒转染后能显著降低ALF细胞MDA的水平，差异有统计学意义（P0.01），表明氧化应激程度降低（图6c）；同时使ATP的水平回升（图6d），差异显著（P0.01），结果显示敲低Fas有助于改善细胞的生物能代谢障碍。3 讨论近年来线粒体自噬对于线粒体质量控制的重要作用逐渐成为新的研究热点8，持续、过度的线粒体自噬降解细胞内线粒体，从而导致线粒体损伤、细胞能量代谢障碍和细胞死亡。线粒体自噬与细胞的分化存活、发育和内环境的稳态维持密切相关，对许多疾病的发生和进展具有重要作用9-11。我们前期的研究通过CRISPR/Cas9系统靶向下调Fas基因的表达，发现可抑制ALF的细胞凋亡现象4，但是线粒体自噬现象是否也参与到肝衰竭的发生发展进程中并不清楚。本研究在模拟ALF的体内外模型中，观察到LC3I蛋白向LC3II蛋白转换，P62蛋白水平降低代表线粒体能正常完成自噬溶酶体途径的降解功能，PINK1/Parkin的蛋白表达上调提示PINK1在受损线粒体上聚集，进而招募Parkin转位至该线粒体，介导线粒体的自噬。线粒体自噬通过对线粒体的降解，来调控线粒体的数量和质量；过度的线粒体自噬可导致线粒体丢失和细胞死亡。在许多线粒体功能失调相关疾病中，发现线粒体自噬过度降解线粒体这一机制参与了疾病的发生和进展12-14。既往研究证实Fas可通过上调自噬相关蛋白的表达从而诱导自噬的发生15。本研究在小鼠和HepG2肝细胞损伤模型中，通过CRISPR/Cas9系统沉默Fas的表达后发现能有效抑制线粒体自噬发生并减少线粒体损伤，线粒体蛋白COX4I1和线粒体DNA含量的水平下降，提示Fas参与到ALF进程并影响线粒体自噬。本研究同时观察到沉默Fas能一定程度上恢复细胞内线粒体含量和细胞的产能水平，从而抑制过度的线粒体自噬发生，阻断了线粒体的过度清除，逆转了线粒体的丢失。这些发现在一定程度上证明了这一观点：线粒体自噬是ALF细胞线粒体丢失和线粒体损伤的原因。肝衰竭的发生伴随着明显的肝细胞凋亡和坏死，而自噬在肝损伤机制中发挥的作用目前仍有争论16，在同一细胞中，自噬和凋亡机制共同存在。研究表明，适度的自噬被认为可以清除受损的线粒体，但自图6 体外CRISPR/Cas9敲除Fas可抑制刀豆蛋白A对肝细胞线粒体的损伤。ab：试剂盒检测敲降Fas后，肝组织内MDA的释放量及ATP生成量（*P0.001）。abcdeabcd11 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3噬过激活可加重肝衰竭的进展17-18。前期实验我们已证实CRISPR/Cas9系统靶向下调Fas后能有效抑制肝细胞凋亡4。本研究进一步证实沉默Fas后肝细胞线粒体氧化应激程度减低，降低了小鼠肝组织中的脂质氧化物含量。同时可上调组织内ATP的含量，结果表明敲除Fas后抑制线粒体自噬有助于改善刀豆蛋白A诱导的肝细胞的生物能代谢障碍。提示Fas沉默可减少线粒体过度自噬，可能是线粒体损伤减轻的原因。但Fas通过何种信号途径调节线粒体自噬，仍需进一步的研究。综上所述，本研究发现在ALF发展过程中观察到存在线粒体自噬现象，同时CRISPR/Cas9系统靶向下调Fas表达后能抑制过度的线粒体自噬，进而逆转线粒体的丢失，保持细胞内的能量代谢平衡。因此，过度线粒体自噬现象可能是ALF发生发展的一个重要原因，这为ALF的治疗策略提供了新依据和新思路。参考文献1 WENDON J,CORDOBA J,DHAWAN A,et al.EASL Clinical Practical Guidelines on the management of acute(fulminant)liver failure J.J Hepatol,2017,66(5):1047-1081.2 邱自辉,李其彪,陈宇,等.血浆置换联合胆红素吸附治疗肝衰竭的临床研究J/CD.新发传染病电子杂志,2016,1(1):45-47.3 BERNAL W,AUZINGER G,DHAWAN A,et al.Acute liver failure J.Lancet,2010,376(9736):190-201.4 庄鹏，李志莹，罗敏虹.CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用J.热带医学杂志，2019，19（4）：434-437.5 TAN S,LIU X,CHEN L,et al.Fas/FasL mediates NF-Bp65/PUMA-modulated hepatocytes apoptosis via autophagy to drive liver fibrosis J.Cell Death Dis,2021,12(5):474.6 YI L,SHANG XJ,LV L,et al.Cadmium-induced apoptosis of Leydig cells is mediated by excessive mitochondrial fission and inhibition of mitophagy J.Cell Death Dis,2022,13(11):928.7 PI H,XU S,ZHANG L,et al.Dynamin 1-like-dependent mitochondrial fission initiates overactive mitophagy in the hepatotoxicity of cadmium J.Autophagy,2013,9(11):1780-1800.8 PICKLES S,VIGI P,YOULE R J.Mitophagy and Quality Control Mechanisms in Mitochondrial Maintenance J.Curr Biol,2018,28(4):R170-R185.9 SUN C,FUJISAWA M,OHARA T,et al.Spred2 controls the severity of Concanavalin A-induced liver damage by limiting interferon-gamma production by CD4(+)and CD8(+)T cells J.J Adv Res,2022,35:71-86.10 KATAURA T,OTTEN EG,RABANAL-RUIZ Y,et al.NDP52 acts as a redox sensor in PINK1/Parkin-mediated mitophagy J.Embo J,2023,42(5):e111372.11 NARENDRA DP,JIN SM,TANAKA A,et al.PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate Parkin J.PLoS Biol,2010,8(1):e1000298.12 DAGDA RK,ZHU J,KULICH SM,et al.Mitochondrially localized ERK2 regulates mitophagy and autophagic cell stressJ.Autophagy,2008,4(6):770-782.13 CHOUBEY V,SAFIULINA D,VAARMANN A,et al.Mutant A53T alpha-synuclein induces neuronal death by increasing mitochondrial autophagyJ.J Biol Chem,2011,286(12):10814-10824.14 SORIA LR,BRUNETTI-PIERRI N.Targeting autophagy for therapy of hyperammonemiaJ.Autophagy,2018,14(7):1273-1275.15 SIWEI T,XIANZHI L,LINGJUN C,et al.Fas/FasL mediates NF-Bp65/PUMA-modulated hepatocytes apoptosis via autophagy to drive liver fibrosisJ.Cell Death Dis,2020,11(3):225-226.16 FAN XL,MEN RT,WANG HR,et al.Methylprednisolone Decreases Mitochondria-Mediated Apoptosis and Autophagy Dysfunction in Hepatocytes of Experimental Autoimmune Hepatitis Model via the Akt/mTOR SignalingJ.Front Pharmacol,2019,10:1189-1189.17 HONG JM,KIM SJ,LEE SM.Role of necroptosis in autophagy signaling during hepatic ischemia and reperfusionJ.Toxicol Appl Pharmacol,2016,308:1-10.18 徐红瑞,王鑫,王亚东,等.细胞自噬与肝功能衰竭J.中华肝脏病杂志,2020,28(12):1069-1072.【收稿日期】2023-03-21