TNF-α对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用.pdf

麓零攀奈漆熊套秦w c j d 叫g n e t c o m基础研究B A S T CR E S E A R C H世界华人消化杂志2 0 0 7 年6 月8 日；1 5(1 6)：1 7 8 8 1 7 9 3正l S N1 0 0 9 3 0 7 9C N1 4 1 2 6 0 RT NF 一仪对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用崔巍，刘冬妍，马力，刘沛一背景资料炎症性肠病时肠上皮细胞旁路通透性的增高是其重要的发病基础，T N F 一可能发挥重要作用目前体内、体外的多项研究已经证实，T N F a 可以增加肠上皮细胞旁路的通透性但具体作用机制还不十分清楚肠上皮细胞旁路通透性主要受紧密连接调控而紧密连接由多种紧密连接蛋白组成c l a u d i n 一1是最重要的一种紧密连接蛋白，其表达量的高低直接影响肠上皮细胞屏障的跨上皮细胞电阻那么T N F 一增加肠上皮细胞旁路的通透性是否是由于破坏紧密连接蛋白c l a u d i n 1而造成的呢?本文就这一问题研究了T N F 一0 L对肠上皮细胞紧密连接蛋白c l a u d i n I 表达的影响崔巍，刘沛，中国医科大学附属第一医院消化内科辽宁省沈阳市1 1 0 0 0 1刘冬妍，马力中国医科大学盛京医院感染科实验室辽宁省沈阳市1 1 0 0 0 1崔巍，在读博士生讲师中国医科大学附属第一医院消化内科，主要从事肝脏病的临床和科研工作国家自然科学基金资助项目，N o 3 0 6 7 0 9 4 7通讯作者：刘沛，110 0 0 1，辽宁省沈阳市南京街15 5 号，中国医科大学附属第一医院消化内科s 训u p e i 2 0 0 3 y a h o o c o m c n电话：0 2 4 8 3 9 5 6 9 6 2 传真：0 2 4 8 3 9 5 6 4 5 1收稿日期：2 0 0 7 0 2 2 5 接受日期：2 0 0 7 0 3 3 1E f f b c to ft u m o rn e c r o s i sf a C t o r _ 仅o np r o t e i ne x p r e s s i o no ft i g h tj u n c t i o np r o t e i ni ni n t e S t j n a Ie p i t h e l i a lC e SW e iC u，D o n g 二丫a nL i u，L iM a，P e iL i uW 色iC u i，P e iL u，D e p a r 七m e n to fD i g e s t i v ed i s e a s e s，t h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fC h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t v。S h e n y 锄嚷1 1 0 0 0 l，L i a o n i n gP r o v i n c e，C 1 l i n aD 0 n g _ Y a nU u，L M a，D e p a r 咖e n to fI I l f e c t i o u sD i s e a s e s，吐l eS e c o n dA 伍I i a t e dH o s p i t a lo f C h i n aM e d i c a lU n i v e r s 盹S h e n y a n gl1 0 0 0 1，L i a o n i n gP m v i n c e，C h i n aS u D p O r t e d b yN a t i o n a lN a t l l r a lS c i e n c eF o u n d a t i o no f(m i l l 乱N o 9 7 1 0 0 2 5 2C O r r e s p o n d e n c et 0：P e iL i u，D e p a n I l l e n to fD i g e s t i v eD i s e a s e s，t h eF i r s tA 伍l i a t e dH o s p i t a lo fC h i n aM e d i c a lU n i v e r s 峨1 5 5N a n j i n gN o n hS t r e e t，S h e n y a n g1 1 0 0 0 l，L i a o n i n gP r o 们n c e，C h i l l a s y l i u p e i 2 0 0 3 v a h o o c o m c nR e O e i v e d：2 0 0 7 0 2 2 5A O c e D t e d：2 0 0 7 一0 3 3 1A b s t r a C tA lM：T oe x p l o r et h em e c h a n i s mo fi n t e s t i n a le p i t h e l i a lb a r r i e rd i s r u p t i o ni n d u c e db yt u m o rn e c r o s i sf a c t o ra l p h a(T N F d)W ed e t e c t e dt h ee x p r e s s i o no fm et i g h tj u n c t i o np r o t e i nc l a u d i n 一1i nC a c o 一2c e U sw i t hT N F 一t r e a t m e n t M E T H O D S：C a c o 一2c e l l sb e t w e e np a s s a g e s2 0a n d3 0w e r ec u l t u r e dw i t hD M E Mi n c l u d m 22 0 f e t a lb o v i n es e r u ma n d2m m o l L2 l u t a m i n ef o r7d a v s C e l l sw e r et h e nt r e a t e dw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fT N F 一(0，1 0，a n d1 0 0p g L)f o r2 4h o u r sw h e nt h e vb e c a m ef u s e d。P r o t e i nw a se x t r a c t e df r o mc e st op r e p a r eN P 一4 0d e t e r g e n t s 0 1 u b l ea n di n s 0 1 u b l ep r o t e i nf r a c t i o n s W e s t e r nb l o tw a su s e dt om e a s u r et h eD r o t e i nI e V e l so fp h o s p h o r y l a t e da n du n p h o s p h o r y I a t e dc l a u d i n 一1 I n d i r e c ti r n m u n o f l u o r e s c e n c ew a sa D p l i e dt ot h e1 0 c a l i z a t i o no fc l a u d i n 一1 R e a l 一t i m eq u a n t i t yp 0 1 y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n(R Q P c R)w a su s e dt od e t e c tt h em R N Ae x P r e s s i o no fc l a u d i n 一1 R E S U L T S：I m m u n o f l u o r e s c e n c es h o w e dt h a tc l a u d i n 一1w a sd i s 仃i b u t e da r o u n dt h ec e l lm e m b r a n ea n dp r e s e n t e ds c r o b i c u l a t el i n e a rf l u o r e s c e n c e A1 0“g Lc o n c e n t r a t i o no fT N F ac a u s e dw e a k e n e dn u o r e s c e n c es i 霉州st h a tw e r ea b n o r m a l l vd i s t r i b u t e dd e n t a t e l v C l a u d i n 一1h a st w om o l e c u l a rf o r m s：o n ei st h en o n p h o s p h o r y l a t e df o r m(2 0k D a lt h a tp r i m a r i l ve x i s t si nN P _ 4 0s o l u b l ep r o t e i l l s；t h eo t h e ri st h ep h o s p h o r y l a t e df o r m(2 5k D a)t h a to n l ve x i s t si nN P 4 0i n s o l u b l ep r o t e i n s T N F O Ld i dn o ta f f e c tt h ep r o t e i ne x p r e s s i o no f6 5-k D ac l a u d i n-1b u td e c r e a s e d8 0 一k D ac l a u d i n 一1p r o t e i ne x p r e s s i o ni nac o n c e n 缸a t i o n d e p e n d a n tm a n n e rc o m p a r e dw i t ht h ec o n h o l(1 0，1 0 0“g L：0 3 1 土0 0 2，0 2 4 0 0 5 口s0 4 3 0 0 9，P 0 0 5，P o 0 5)C O N C L U S l o N：T N F ad o e sn o ta f f e c tt h en 1 R N Ae x p r e s s i o no ft h et i 曲tj u n c t i o np r o t e i nc l a u d i n 一1b u td e c r e a s et h ee x p r e s s i o no ff u n c t i o n a lc l a u d i n 一1i nC a c o 一2c e s K e yW o r d s：T i s s u en e c r o s i sf a c t o r-；T i g h tj u n c t i o np r O t e i nc I a u d i n-1；C a c O 一2c e；I m m u n O f I u o r e s-c e n c e；W e s t e r nb I O t；R e a I-t i m eq u a n t l t yp O l y m e r-a s e c h a i nr e a c t i O nC u iW，L i uD Y，M aL，L i uP E f f e c to ft u m o rn e c r o s i sf a c t o r 一0 已o np r o t e i ne x p r e s s i o no ft i g h tj u n c t i o np r o t e i ni ni n t e s t i m Ie p i m e l i a lc e s s 蛐i eH u a r e n a o h u az a 抽2 0 0 乃1 5(1 6)：1 7 8 8 1 7 9 3摘要目的：研究肿瘤坏死因子仪(T N F 0 1)对肠上皮细胞紧密连接蛋白c l a u d i n 1 定位和表达的影响，探讨T N F 一伐增加肠土皮细胞屏障通透性的作用机制 万方数据崔巍，等T N F a 对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用1 7 8 9方法：C a c o 一2 细胞(2 0 3 0 代)应用含有2m m 0 1 L 谷氨酰胺、2 0 胎牛血清的D M E M 培养液培养7d，细胞生长达到融合后加入不同浓度的T N F 0 l(0，1 0，1 0 0u g L)继续培养2 4h，提取细胞蛋白制备N P 4 0 可溶性及不溶性蛋白框架，W e s t e r nb l o t 检测磷酸化和非磷酸化的c l a u d i n 一1 蛋白含量，并应用间接免疫荧光法检测c l a u d i n 一1 的定位实时定量P C R 技术检测c l a u d i n 一1m R N A 的表达结果：免疫荧光染色可见对照组c l a u d i n l 沿细胞膜分布，呈蜂巢状线性荧光，1 0 儿Ln 师一仪引起c l a u d i n 1 荧光信号减弱，并呈锯齿状异常分布：W e s t e r nb l o t 分析显示c l a u d i n 一1 蛋白有两种表达形式，一种为2 0k D a(非磷酸化c l a u d i n 一1)，主要存在于N P 4 0 可溶性蛋白样品中；另一种为2 5k D a(磷酸化c l a u d i n 1)，只存在于N P 一4 0 不溶性蛋白样品中T N F 一不影响2 0k D ac l a u d i n 一1 蛋白的表达但可使2 5k D ac l a u d i n 一1 蛋白表达下降且具有浓度依赖性(1 0，1 0 0u 叽：0 3 l 0 0 2，0 2 4 0 0 5 珊0 4 3 O 0 9p-0 0 5，P 0 0 5)：实时定量P C R 结果显示不同浓度的T N F 一仪(1 0，1 0 0u g L)作用2 4h 或1 0 0 g LT N F 一0 L 作用不同时间(4，8 和2 4h)与正常对照组相比均不能引起c l a u d n lm R N A 的改变结论：T N F 0 c 对C a c o 2 细胞紧密连接蛋白c l a u d i n 一1n 武N A 的表达没有影响，但可以引起有功能的磷酸化c l a u d i n l 蛋白表达减少关键词：肿瘤坏死因子一仪；紧密连接蛋白c l a u d i n l；c a c o 一2 细胞；免疫荧光；免疫印迹；实时定量聚合酶链式反应崔巍，刘冬妍，马力，刘沛T N F 一0【对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用世界华人消化杂志2 0 0 7：1 5(1 6)：1 7 8 8 1 7 9 3h t f p：y，V 哪v v j g n e l c o m，10 0 9 3 0 7 9 15，17 8 8 a s pO 引言肠黏膜屏障功能损害被认为是炎症性肠病的始动因素 1】，可引起肠黏膜屏障通透性增高，使正常情况下不能通透的各种毒性物质、微生物进入肠壁，诱发炎症反应炎性细胞因子T N F 仪在这一过程中占据重要位置，已有研究表明炎症性肠病患者T N F 一仪异常增高，并伴随肠黏膜屏障通透性的增高，应用T N F 一伐抗体可以降低这些患者肠黏膜屏障的通透性口】，但是T N F 一仪引起肠黏膜屏障通透性增高的具体机制还不十分清楚炎症性肠病时肠黏膜屏障通透性增高的特征是肠上皮细胞旁路的通透性明显增高，而肠上皮w w w。叼g n e t c o m接由多种紧密连接蛋白组成，c l a u d i n 1 是最重要兼羔翕冬焉萎的一种紧密连接蛋白，对于屏障功能的维持和鬟繁害裳鬈善紧密连援的完整性具有重要作用有研冗表明，高密切相关但c l a u d i n 一1 表达异常可使肠上皮细胞跨上皮细胞翟算器量耋鬈耄电阻(仃a n s e p i t h e l i a le l e c t r i c a l r e s i s t a n c e，T E E R)降高的机批尤其是低，肠黏膜通透性增高嘲因此我们检测了n 盯仅霉粪霉篓显霎苫对紧密连接蛋白c l a u d i n 一1 表达的影响，以探讨前研究的热点n 师吨增加肠E 皮细胞屏障通透性的机制1 材料和方法1 1 材料D M E M 高糖培养基，F c S 购自美国G i b c o b r l 公司，非必须氨基酸、丙酮酸钠购自美国 I v c l o n e 公司，谷氨酰胺、重组人T N F 伐购自美国S i g n l a 公司，兔抗c l a u d n l 多克隆抗体购白美国z y m e d 公司，F I T c、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I g G 购自美国S a n t aC m z 公司，P C R 试剂盒、T 7体外转录试剂盒、定时定量P C R 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司1 2 方法1 2 1 细胞培养c a c o 2 细胞应用含有2 0 0m L L 胎牛血清、1 0g L 非必须氨基酸、4m m o l L 谷氨酰胺和青霉素链霉素双抗液的D M E M 培养液，在3 7、5 0m L LC O，条件下进行培养，每7 天按1：2 的比例传代传代后7d 左右细胞生长达到融合，加入不同浓度的T N F 伐(0，1 0，1 0 0u g 几)培养2 4h 后，进行免疫荧光检测，并收集C a c o 一2 细胞提取蛋白及总R N A，一1 3 0 保存待用每种实验均选取3 组非同代细胞进行1 2 2 免疫荧光取同代细胞接种于盖玻片上，待细胞生长融合7 0 左右加入处理因素，取出盖玻片，P B s 漂洗3 次(每次1 0m i n)后，用4 0g L 多聚甲醛固定1 5m i n，P B S 漂洗，加入5g LT r i t o nx 1 0 0处理1 0m i n，P B S 漂洗，1 0 0m L L 小牛血清白蛋白室温封闭3 0m i n，加入c l a u d i n l 抗体(1：5 0)，4 过夜，P B S 漂洗后加入F I T C 标记二抗(1：2 0 0)室温孵育1h，再用P BS 漂洗，蒸馏水洗后用甘油封片，荧光显微镜下观察P BS 液代替一抗作为空白对照1 2 3N P 4 0 可溶性及不溶性蛋白框架的制备细胞用冰P BS 洗3 遍，然后用N P 4 0 蛋白裂解液(2 5m m 0 1 LH E P E S，p H7 4，1 5 0 儿N a C l，4m m o l LE D T A，1 0g 几N o n i d e tP _ 4 0，2 5m m o 忱N a F，1m m o 儿N a 3 V 0 4，1On n o l Ls o d i u l np y r o p h o s p h a t e，1m m o l LP M s F)冰上裂解细胞2 0m i n，4，1 20 0 0占离心3 0m i n，上清即为N P 4 0 可溶性蛋白，转移 万方数据1 7 9 0I S S N1 0 0 9-3 0 7 9C N1 4 一1 2 6 0 R世界华人消化杂志2 0 0 7 年6 月8 日第15 卷第16 期相关报道在体外细胞培养中，T N F 一仪对紧密连接蛋白c l a u d i n l 表达的影响，国内尚未见相关报道国外研究存在不同的结果有研究认为T N F a 可以使c l a u d i n l 表达减少，也有研究认为1 N F d 对c l a u d i n 一1的表达没有影响图1 各组免疫荧光染色结果(4 0 0 1 A：对照组可见沿细胞膜分布的蜂巢状线性荧光；B：低浓度T N F 一仪组可见荧光信号呈锯齿状异常分布；c：高浓度T N F c L 组荧光信号明显减弱，锯齿状异常分布更加明显；D：空白对照至新的M i c r o t u b e 内剩余沉淀应用s D s 蛋白裂解液(2 5m m o。H E P E s，p H7 4，4m m o 儿E D T A，1 0g LS D S，2 5m m o 儿N 啦!I 砌。儿N a 3 V 0 4，1 0m m o l Ls o d i u mp)，r o p h o s p h a t e，1m m 0 1 LP M S F)冰上裂解细胞2 0m i n，超声波粉碎5s 5 次，4，1 20 0 0 占离心3 0m i n，所得上清即为N P _ 4 0 不溶性蛋白，两种蛋白的混合物即为总蛋白采用B C A法对蛋白样品进行定量，用蒸馏水将蛋白样品调成相同浓度，加入相同体积上样缓冲液，沸水煮5m i n 进行蛋白变性1 2 4w e s t e r nb l o t 每个样本取等量蛋白(约5 0g)进行8 0g LS D S P A G E 凝胶电泳，电压1 0 0V，2 5h，电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，电压5 0V2h，脱脂奶粉4 封闭过夜，T B S 洗5m i n 3 次，加入多克隆兔抗c l a u d i n l 抗体(1：5 0 0)室温2h，T T B S 洗5m i n 3 次，然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔I g G 抗体(1：1 00 0 0)室温2h，T T B S-创新盘点洗5 m i n 3 次，E C L 显色以同一样本的p a c t i n 作目前关于T N F 为内参结果通过天能图像分析系统进行分析，篓善气麓量霎c l a u d i n 1 蛋白含量：样本c l a u d i n 1 蛋白灰度值紧密连接蛋白c l a u d i n 一1 蛋白含量2 样本c l a u d i n 一1 蛋白灰度值藉蓑熊重但j 墨袈萎；警患姚沪步法提取细胞葛嚣筹凳墨萎巢总R N A 采用s Y B RG r e e nI 荧光染料嵌合法中在肠上皮细胞检测c l a u d i n 1m R N A 简言之先构建目的基因篓銎言羔篓言蔫(c l a u d i n 1 基因)和管家基因(G A P D H)的R N A 标准品，制作标准曲线，利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量通过管家基因的校正，检测各组大肠组织中c l a u d i n 一1 目的基因的相对表达量C 1 a u d i n 一1m R N A 的相对表达量=c l a u d i n 1 基因拷贝数G A P D H 基因拷贝数P C R 反应体系的组成参照说明书进行，反应条件为逆转录反应4 2 1 0m i n，9 5 2m i n，P C R 扩增9 5 1 0s1 个循环，9 5 5s，6 0 2 084 5 个循环C l a u d i n 一1 和G A P D H 引物序列如下：C 1 a u d i n 一1 引物：5 f _ A A G A G T T G A C A G T C C C A TG G C A T A C 一3(上游)，5 t-A T C C A C A G G C G A A G TT A A T G G A A G 3(下游)；G A P D H 引物：5 AAA T G G T G A A G G TC G G T G T G 3(上游)，5 T G A A G G G G T C G T T G A T G G 一3(下游)C l a u d i n 1产物片段1 3 3b p，G A P D H 产物片段1 4 4b p 统计学处理实验结果以m e a n s D 表示，采用S P S S l 0 0 统计软件对各组问数据进行单因素方差分析，每种实验均选取3 组数据进行分析2 结果2 1 免疫荧光染色结果对照组c l a u d i n-1 蛋白主要沿细胞膜分布，呈蜂巢状线性荧光；加入T N F a1 0 g L 可使c l a u d i n-1 蛋白荧光信号减弱，并呈锯齿状分布；增加T N F 一仪浓度到1 0 0u g L 发现c l a u d i n 1 蛋白荧光信号进一步减弱，锯齿状分布更加w w w 叼g n 甙c o m 万方数据崔巍，等T N F 一对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用明显，并且在胞浆内可见阳性染色以上结果提示T N F 一仪可引起c l a u d i n 一1 分布异常，由膜顶端向膜下及胞浆转移，并具有浓度依赖性(图1)2 2w e s t e r nb l o t 结果各组蛋白样品分为N P 一4 0可溶性与N P 4 0 不溶性两个框架分别进行蛋白杂交，结果发现N P 4 0 可溶性标本仅在2 0k D a处见一特异性的蛋白条带，对各条带进行灰度分析发现各组c l a u d i n 1 蛋白的表达无明显差异N P 一4 0 不溶性标本可见两条蛋白条带，分别在2 0k D a 和2 5k D a，对各条带进行灰度分析发现各组标本2 0k D a 的蛋白含量无统计学差异，但是对于2 5k D a 的蛋白含量，T N F 仪组较对照组明显下降并呈剂量依赖性f 0 31 0 0 2，0 2 4 0 0 5W0 4 3 0 0 9，p，0 0 5，P 0 0 5，图2)2 3 实时定量P C R 结果电泳结果和0 D 值结果显示。构建的人c l a u d i n 一1 基因和G A P D H 基因R N A 标准品片段长度分别为3 5 8b p 和1 0 4 3b p 其质量良好，所获得的标准曲线相关系数为0 9 9 8，线性关系良好，融解曲线显示特异性良好利用标准曲线对样品中的c l a u d i n 1 基因和G A P D H 基因进行定量，结果发现不同浓度T N F 一0【组与正常对照组比较c l a u d i n lm R N A 的水平没有统计学差异(0 6 30 1，0 6 1 0 0 6 珊0 6 0 0 7，D-0 0 5)进一步我们检测了T N F 一仪1 0 0u g L 作用不同时间(4，8，2 4h)c l a u d i n 1m R N A 水平的变化，与正常对照组相应时间点相比，c l a u d i n _ 1m R N A 水平仍然没有统计学差异(0 9 0 4，1 0 2 O 6，0 9 2 0 3 恪0 9 4 O 4，D，0 0 5)这些结果提示T N F u 对c l a u d i n l 的调节不发生在转录水平f 图3 1 3 讨论T N F a 已被证实是炎症性肠病时引起肠黏膜屏障功能损伤的重要启动因子，这可以从下面几点证明：(1)炎症性肠病患者T N F 仅水平异常增高，并与肠黏膜损伤的程度直接相关嗍；(2)抗T N F 一仪抗体治疗炎症性肠病患者有效【5 1；(3)T N F 一仪可引起其他细胞因子如I L 一1，6，8，一1 2、C S F等增高，这些细胞因子被证实参与了炎症性肠病的发生【4 6】T N F 仪引起肠黏膜屏障通透性增高的机制还不十分清楚，与N F K B 活化有关【9】，M L C K，M A P KP K C 等信号途径皆参与其调拶1 0。1 引最近越来越多的研究表明，T N F a 可以增加肠上皮细胞细胞旁的通透性，降低肠上皮细胞屏障的跨上皮电阻，并认为这是T N F 仪引起肠黏膜屏障通透性增高的主要原因口7 J9 1 正常情况下肠上皮细胞细胞旁问隙是由连接复合体封，W、f 叼g n 或，m图2 各组W e s f e mb I o t 结果 o 0 5w 对照组闭的，其中最重要的是紧密连接(t i 曲tj u n c t i o n，T J)睥紧密连接由多种紧密连接蛋白分子组成，包括跨膜蛋白c l a u d i n 一1、c l a u d i n s、连接黏附分子(j u n c t i o n a la d h e s i o nm o l e c u l e，J A M)和胞质附着蛋白z o s、A F 6、7 H 6 等C l a u d i n 1 是最先分离出来的T J 跨膜蛋白，分子量为2 0k D a，形成两个细胞外环和一个短的细胞内环相邻细胞间通过外环以“拉链”状结合产生细胞旁封闭C 1 a u d i n 一1 蛋白对于上皮细胞屏障功能的维持和紧密连接的完整性具有重要作用有研究表明，用c l a u d i n l 转染L 一纤维母细胞(缺乏T J)后，相邻细胞之间可以形成T J 样结构【2”另外在M D C K(犬肾上皮)细胞中增加c l a u d i n 1 表达可以增加上皮细胞的T E E R【2 2 2 3 1，而在蟾蜍胚胎中，转入缺乏完整结构的c l a u d i n 一1 片段可破坏屏障功能【2 4】这提示c l a u d i n 1 是T J 的主要功能蛋白，参与屏障功能的调节因此我们推测T N F 一伐是通过影响紧密连接蛋白的表达，从而破坏紧密连接的完整性，增加肠黏膜屏障的通透性为了验证这一假设，我们检测了T N F 一伐对T J 中最重要的跨膜蛋白c l a u d i n-l 表达和定位的影响我们首先应用免疫荧光染色对c l a u d i n 1 蛋白的定位进行研究正常情况下，c l a u d i n 1 定位在细胞膜顶端，交织成网状，加入T N F 后，c l a u d i n 一1 由膜顶端向膜下转移，表现为荧光信号呈锯齿状分布并有中断现象这说明T N F 吨可以引起c l a u d i n 1蛋白分布异常，使其不能定位在紧密连接上发挥功能，从而引起紧密连接的断裂这与H a n和S a p p i n g t o n 在C a c o 一2 细胞中的研究结果相一致2 5。2 6 1 C 1 a u d i n 1 存在磷酸化和非磷酸化两种形式，磷酸化是其活性形式，在A T P 或钙转移实验中发现T J 的组装和高T E E R 的形成有赖一应用要点本研究发现在体外培养肠上皮细胞T N F a 可以引起紧密连接蛋白c l a u d i n 1 异常分布及磷酸化减少而对c l a u d i n 1m R N A 的表达没有影响，为进一步深入研究T N F 0【损伤肠黏膜屏障的机制提供了基础 万方数据1 7 9 2I S S N1 0 0 9-3 0 7 9C N1 4-1 2 6 0 R世界华人消化杂志2 0 0 7 年6 月8 日第15 卷第16 期名词解释紧密连接存在于各类上皮细胞及血管内皮细胞间的顶端，形成一个顶端闭锁结构且发挥“屏障”和“防御”功能以控制细胞问的通透性和保持细胞的极性紧密连接由多种紧密连接蛋白组成包括c l a u d i n c l a u d i n l以及Z o 一1 Z o 2 z o 3 等，在不同的组织结构，各种紧密连接蛋白的表达亦存在差别图3 各组实时定量P c R 结果可见不同浓度的T N F a 作用2 4h 或T N F a1 0 0“g L 作用不同时间后，c l a u d i n 一1m R N A 的相对含量没有明显差异于c l a u d i n 1 酪氨酸残基的磷酸化口”有研究表明磷酸化的c l a u d i n 1 定位在T J 上，而非磷酸化c l a u d i n 1 沿膜的基底侧分布，并且磷酸化会使c l a u d i n 1 分子量上调并不溶于N P 4 0 2 引利用这一特性我们制备了N P 4 0 可溶性和不溶性蛋白框架，分别进行c l a u d i n 1 蛋白杂交结果发现在N P 一4 0 可溶性蛋白框架内只存在一种蛋白，分子量在2 0k D a，T N F 0【不能影响其表达：而在N P 一4 0 不溶性蛋白框架内存在两种蛋白，一种为2 0k D a 的非磷酸化c l a u d i n 1 蛋白，一种为2 5k D a的磷酸化c l a u d i n 1 蛋白，T N F 可以下调后者的表达并具有浓度依赖性这也进一步解释了免疫荧光中T N F 伐为何会引起c l a u d i n 一1 蛋白的分布异常一是T N F 减少c l a u d i n 一1 蛋白磷酸化的结果在目前研究中，T N F 一伐对c l a u d i n 1 蛋白含量的影响存在不同结果，有研究表明T N F u 或细胞因子混合物(T N F 队I F N 小I L 1 B)可以减少c l a u d i n 1 蛋白的表达2 5。2 6 1，也有研究认为T N F 仪对c l a u d i n 1 蛋白总量没有影响2 钆3 们我们实验中发现T N F a 不影响c l a u d i n 一1 蛋白的总量，但可以减少c l a u d i n 1 蛋白的磷酸化，这些结果上的差异可能与选择的细胞系及细胞因子的作用时间有关，单一细胞因子及较短的作用时问(2 4h)不引起c l a u d i n 一1 蛋白总量的改变有报道称T N F 0【可以下调肠上皮细胞H T-2 9 B 6c l a u d i n 1 基因启动子的表达3 卜3 2 ，提示c l a u d i n 一1 蛋白表达亦受转录水平的调节，因此我们应用实时定量P C R 技术检测了T N F 伐对c l a u d i n 1m R N A 的影响，结果表明无论哪种浓度的T N F 一均不能引起c l a u d i n 1m R N A 水平的变化对于蛋白分子调控，其转录水平的调节与蛋白水平的调节具有一定的时相性，因此我们又检测了T N F 仪1 0 0u g L 作用不同时间(4，8，2 4h)c l a u d i n 一1m R N A 水平的变化，同样没有发现任何阳性结果提示在C a c o 2 细胞中，T N F a 对c l a u d i n 一1 的调节发生在蛋白水平，而不是转录水平。这一结果也与W e s t e r nb l o t 实验中c l a u d i n 一1 蛋白的总量没有变化相一致在本实验中，我们证明T N F 一仪可以减少紧密连接蛋白c l a u d i n 一1 磷酸化，使其从紧密连接上解聚，紧密连接断裂，并认为这是T N F。增加肠上皮屏障通透性的作用靶点为进一步研究T N F O【增加肠上皮细胞屏障通透性的分子机制提供基础参考文献1M aT Y I n t e s 血a 1e p i t h e l i a lb a r r i e rd y s f u n c t i o ni nC r o h n sd i s e a s e P r D cS o cE z pB i o fM P d1 9 9 7；2 1 4：3 1 8 3 2 72S u e n a e r tP，B u l t e e lV，L e m m e n sL，N o m a nM，G e y p e n sB，V a nA s s c h eG，G e b o e sK，C e u p p e n sJ L，R u t Z e e r t sP A n t i t u m o rn e c r o s i sf a c t o rt r e a t m e n tr e s t o r e st h eg u tb a r r i e ri nC r o h n。sd i s e a s e A mfG 口s f 加P n 把加12 0 0 2：9 7：2 0 0 0。2 0 0 43H o P k i n sA M，W a l s hS V，V e r k a d eP，B o q u e tP，N u s r a tA C o n s t i t u t i v ea c t i v a t i o no fR h oD r o t e i n sb yC N F