叶绿素含量测定.doc

一、叶绿素提取方法（直接浸提法）（植物生理学实验技术，高俊凤主编，北京：高等教育出版社，2006）

（1） 取烤烟中部幼嫩叶片，去除叶脉后剪成0.2cm左右的细丝或小块混合均匀后，称取0.10~0.20g，放入50mL离心管中；
（2） 在离心管中加入0.5mL纯丙酮和10~15mL80%的丙酮，并仔细将粘附在瓶壁边缘的叶片碎末洗到丙酮溶液中去，盖上瓶塞，室温下置暗处浸提过夜，其间摇动3~4次；
（3） 次日取出离心管，观察叶组织已全部变白时，表示叶绿素已浸提干净，然后用80%丙酮定容至25mL刻度，过滤或离心（25℃，3~5min,12000r·min-1)后，进行比色测定。
（4） 比色测定：将叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯 内，用分光光度计分别在波长645nm、663nm和652nm下测定吸光度，以80%丙酮为空白对照。
（5） 按下列公式分别计算叶绿素a、b和叶绿素的总浓度（mg·L-1)
Ca=12.72×A663-2.59×A645（叶绿素a的浓度）
Cb=22.88×A663-4.67×A645（叶绿素b的浓度）
CT=Ca+Cb=20.29×A645+8.05×A663
由于叶绿素a、b在652nm处的吸收峰相交，二者具有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A652）而求出叶绿素含量：

（6） 求得色素浓度后再按下式计算组织中各色素含量（用mg·g-1鲜重或干重表示)

式中，C：叶绿体色素的浓度（mg·L-1)；FW:鲜重（g）；VT：提取液总体积（mL)；n：稀释倍数（在此处为1）。

二 、丙酮乙醇混合液法（植物生理学实验技术，郝建军主编，辽宁科学技术出版社，2001年再版）
1、将丙酮、无水乙醇按1:1体积混合成浸提液
2、称取0.1g，剪成细丝置于盛混合液的试管中，加塞置于暗处，于室温（10~30℃）条件下浸提，每个一定时间观察浸提情况，以材料完全变白为准。用混合浸提液作空白调零，测定663nm、645nm和652nm处测光密度（一般隔夜测定）。
注意事项 
(1) 为了避免叶绿素光解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些，以不超过两分钟为宜。 
(2)  叶绿体色素提取液不能 浑浊。可在710nm或750nm下测量吸光度，其值应小于当波长为叶绿素a吸收峰时消光度值的5%，否则应重新过滤。 
(3)用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nm,则叶绿素a的测定误差为2%，叶绿素b为19%，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素a和叶绿素来来校正。因为即使使用国产仪器中性能较好的7200型分光光度计，经校正后再600~700nm波段中的读数误差还可能有±2nm，这对测定叶绿素a：b值已有影响。

叶绿素含量测定记载表
处理
时间（h）
重复
FW(g）
VT（mL）
吸光度
色素浓度mg·L-1
色素含量mg·g-1
A645
A652
A663
Ca
Cb
CT
Ca'
Cb'
CT'
CK
0
1

2

3

平均值

CK+Cd
24
1

2

3

平均值

48
1

2

3

平均值

96
1

2

3

平均值

+P
0
1

2

3

平均值

+P+Cd
24
1

2

3

平均值

48
1

2

3

平均值

96
1

2

3

平均值