青霉与曲霉分类2009.pdf

青霉与曲霉的系统分类学青霉与曲霉的系统分类学Taxonomy and Phylogenetics of Penicillia and Aspergilli王龙 Wang Long中国科学院微生物研究所真菌地衣系统分类学实验室Systematic Mycology and Lichenology Lab.,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences2009-11-20青霉与曲霉的重要性青霉与曲霉的重要性青霉与曲霉基因组测序青霉与曲霉基因组测序1.Aspergillus clavatus NRRL 12.Aspergillus flavus NRRL3357 3.Aspergillus fumigatus A1163 and Af2934.Aspergillus nidulans FGSC A45.Aspergillus niger ATCC 1015 and CBS513.886.Aspergillus oryzae RIB40 7.Aspergillus parasiticus8.Aspergillus terreus ATCC 20542 and NIH26249.Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-125510.Penicillium marneffei ATCC 18224aflatoxinochratoxinP.marneffeiA.fumigatus条件致病菌条件致病菌内容内容 Contents1.分类地位分类地位 Taxonomic position2.传统分类学传统分类学 Classical taxonomy3.分子种系学分子种系学 Molecular phylogenetics一.青霉与曲霉的分类地位一.青霉与曲霉的分类地位真菌界真菌界(Kingdom Fungi)半知菌门半知菌门(Deuteromycota)丝孢菌纲丝孢菌纲(Hyphomycetes)丛梗孢目丛梗孢目(Moniliales)丛梗孢科丛梗孢科(Moniliaceae)青霉属青霉属(Penicillium)曲霉属曲霉属(Aspergillus)mitosporic fungianamorphic fungi发菌科发菌科(Trichocomaceae)双瓣亚科双瓣亚科Dichlaenoideae发菌亚科发菌亚科Thichocomoideae（取消半知菌门以前）（取消半知菌门以后）（取消半知菌门以前）（取消半知菌门以后）真菌界真菌界(Kingdom Fungi)子囊菌门子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门盘菌亚门(Pezizamycotina)散囊菌纲散囊菌纲(Eurotiomycetes)散囊菌目散囊菌目(Eurotiales)发菌科发菌科(Trichocomaceae)发菌亚科发菌亚科(Thichocomoideae)双瓣亚科双瓣亚科(Dichlaenoideae)青霉青霉Penicillia:篮状菌属篮状菌属(Talaromyces)正青霉属正青霉属(Eupenicillium)曲霉曲霉Aspergilli:毛萨托菌毛萨托菌(Chaetosartorya)裸孢壳裸孢壳(Emericella),散囊菌散囊菌(Eurotium)芬尼菌芬尼菌(Fennellia),半内果菌半内果菌(Hemicarpenteles)新萨托菌新萨托菌(Neosartorya),石座菌石座菌(Petromyces)闭核菌闭核菌(Sclerocleista).新石座菌新石座菌(Neopetromyces)发菌亚科和双瓣亚科的形态学区别发菌亚科和双瓣亚科的形态学区别Morphological differences between Trichocomoideaeand Dichlaenoideae子囊果子囊果 Ascocarps子囊孢子子囊孢子 Ascospores帚状枝和瓶梗帚状枝和瓶梗 Penicilli and phialides（青霉）（青霉）子囊果子囊果 Ascocarps裸囊壳裸囊壳 gymnotheciea闭囊壳闭囊壳 cleistotheciea子囊孢子子囊孢子Ascosporesellipsoidallenticularspikeequatorial furrowvalve椭球形椭球形 ellipsoidal扁豆形扁豆形 lenticular帚状枝和瓶梗帚状枝和瓶梗 Penicilli and phialides篮状菌属篮状菌属 Talaromyces正青霉属正青霉属 Eupenicillium青霉分类系统青霉分类系统(Pitt,1979)EupenicilliumTalaromycesPenicilliumSubgen.AspergilloidesSubgen.FurcatumSubgen.PenicilliumSubgen.Biverticillium曲霉状亚属曲霉状亚属 Subgen.Aspergilloides叉状亚属叉状亚属 Subgen.Furcatum青霉亚属青霉亚属 Subgen.Penicillium双轮亚属双轮亚属 Subgen.Biverticillium2.传统分类学传统分类学 Classical taxonomy显微性状显微性状 Microscopic characters,Table I：无性型无性型 Anamorphic characters:materials from CYA：分生孢子梗分生孢子梗 conidiophores分生孢子分生孢子 conidia有性型有性型 Teleomorphic characters原基原基 initials（Talaromyces)子囊及其着生方式子囊及其着生方式 asci and patterns子囊孢子子囊孢子ascospores（SEM）总体生理学性状总体生理学性状 gross physiological characters,Table II传统分类学性状传统分类学性状 Classical taxonomic characters青霉无性型显微性状青霉无性型显微性状 Anamorphic microscopic characters of penicillia孢梗茎孢梗茎stipe副枝副枝ramus次副枝次副枝ramulus梗基梗基 metula瓶梗瓶梗phialide分生孢子梗分生孢子梗conidiophore分生孢子分生孢子conidium三轮生帚状枝三轮生帚状枝terverticillate penicillus帚状枝帚状枝penicillus双轮亚属双轮亚属 Subgen.Biverticillium叉状亚属叉状亚属 Subgen.Furcatum曲霉状亚属曲霉状亚属 Subgen.Aspergilloides青霉亚属青霉亚属 Subgen.Penicillium单轮生，壁光滑单轮生，壁光滑 Monoverticillate,smooth-walled两轮生，孢梗茎壁粗糙两轮生，孢梗茎壁粗糙Biverticillate,roughened stipes and rami两轮生，孢梗茎壁光滑两轮生，孢梗茎壁光滑Biverticillate,smooth-walled stipes and rami三轮生，壁光滑三轮生，壁光滑 Terverticillate,smooth-walled 三轮生，孢梗茎和副枝壁粗糙三轮生，孢梗茎和副枝壁粗糙Terverticillate,rough-walled stipes and rami球形，壁光滑球形，壁光滑 Spheroidal,smooth-walled卵形，壁光滑卵形，壁光滑 Ovoid,smooth-walled柱形，壁光滑柱形，壁光滑 Cylindrical,smooth-walled梭形，刺状粗糙梭形，刺状粗糙 Fusiform,spinose产囊体产囊体Ascogenium雄器雄器Antheridium膨大细胞膨大细胞 Swollen cells 菌丝结节菌丝结节Hyphal knot 123原基原基 Initials of Talaromyces有性型显微性状有性型显微性状 Teleomorphic microscopic characters卷链生卷链生 Recurved chains单生单生 Singly子囊三种着生方式子囊三种着生方式 Asci borne in three types直链生直链生 Straight chains子囊孢子子囊孢子Ascospores椭球形椭球形 Ellipsoidal扁豆形扁豆形 Lenticular表 I 青霉属及其有性型的显微性状 显微性状 性状状态 1 分生孢子梗 发生部位:2 孢梗茎 大小（m）：壁：3 帚状枝 分枝情况：副枝 形状：数目：大小（m）：壁：次副枝 形状：数目：大小（m）：壁：梗基 形状：数目：大小（m）：壁：瓶梗 形状：数目：大小（m）：壁：梗颈：4 分生孢子 形状：大小（m）：壁：分生孢子链：5 菌核 形状：大小（m）：颜色：6 闭囊壳 形状：大小（m）：颜色：成熟时间：7 裸囊壳 形状：大小（m）：颜色：成熟时间：8 子囊 形状：大小（m）：着生方式：子囊孢子数目：9 子囊孢子 形状：大小（m）：壁：10 原基（篮状菌）形状 大小（m）：构成：总体生理学性状总体生理学性状 gross physiological characters,Table II:1.查氏琼脂（查氏琼脂（Czapek agar,CA）25，7d2.查氏酵母膏琼脂（查氏酵母膏琼脂（Czapek yeast exatract agar,CYA）25、5、37，7d3.麦芽精琼脂（麦芽精琼脂（Malt extract agar,MEA）25，7d4.酵母精蔗糖琼脂酵母精蔗糖琼脂(Yeast extract succose agar,YES)25，7d5.25%甘油硝酸盐琼脂（甘油硝酸盐琼脂（25%Glycerol nitrate agar,G25N）25，7d菌落性状菌落性状 Colony charactersP.macrosclerotiorum:CA,CYA,MEA,YES,25,after 7 days绒状绒状 Velutinous絮状絮状 Floccose绒兼絮状绒兼絮状 Velutinous and floccose绳状绳状 Funiculose簇状簇状 Fasciculate颗粒状颗粒状 Granular具闭囊壳的菌落具闭囊壳的菌落 Colonies with cleistothecia渗出液渗出液 Exudate可溶色素可溶色素 Soluble pigment反面颜色反面颜色 Reverse colour表 II 青霉属及其有性型总体生理学性状 种名：菌号：系：基物：组：地点：亚属：日期：CYA 培养基 性状 CA 257 天 257 天57 天3 77 天MEA/WA257 天YES 257 天G25N 257 天 直径（mm）厚薄 表 面 和 边 缘 质地 分生孢子结构 菌丝体 渗出液 可 溶 性 色 素 反面 曲霉采用的分类系统：(曲霉采用的分类系统：(Gams et al.,1985)1.Subgenus Aspergillus4.Subgenus FumigatiSection Aspergillus(散囊菌散囊菌Eurotium)Section Fumigati(新萨托菌新萨托菌Neosartorya)Section RestrictiSection Cervini5.Subgenus Clavati2.Subgenus NidulantesSection Nidulantes(裸孢壳裸孢壳Emericella)Section Versicolores6.Subgenus CircumdatiSection UstiSection VentiiSection TerreiSection FlaviSection Flavipedes(芬尼菌芬尼菌Fennellia)Seciton NigriSection Circumdati(石座菌石座菌Petromyces)3.Subgenus OrnatiSection Candidi(闭核菌闭核菌Sclerocleista)Section Cremei(毛萨托菌毛萨托菌Chaetosartorya)(半内果菌半内果菌Hemicarpenteles)Section SparsiA.muricatus(新石座菌新石座菌Neopetromyces)曲霉的显微性状曲霉的显微性状 Microscopic characters of Aspergilli,表表IIIvesiclefoot cellmetulaphialideconidiumconidiophorehulle cellstipe曲霉的分生孢子头曲霉的分生孢子头 Conidial heads of Aspergillus曲霉的子囊壳和子囊孢子曲霉的子囊壳和子囊孢子Cleistothecia and ascospores of aspergilli黄曲霉黄曲霉 A.flavus寄生曲霉寄生曲霉A.parasiticus赭曲霉赭曲霉 A.ochraceus黑曲霉黑曲霉 A.niger碳黑曲霉碳黑曲霉 A.carbonarius烟曲霉烟曲霉 A.Fumigatus构巢曲霉构巢曲霉 A.nidulans构巢裸孢壳构巢裸孢壳 Emericellanidulans表 III 曲霉属及其有性型的显微性状 显微性状 性状状态 1 分生孢子头 形状:大小（m）：2 分生孢子梗 发生部位：3 孢梗茎 大小（m）：壁：4 顶囊 形状：直径（m）：5 梗基 形状：数目：大小（m）：壁：6 瓶梗 形状：数目：大小（m）：壁：梗颈：7 分生孢子 形状：大小（m）：壁：分生孢子链：8 菌核 形状：大小（m）：颜色：9 闭囊壳 形状：大小（m）：颜色：成熟时间：10 子囊 形状：大小（m）：着生方式：子囊孢子数目：11 子囊孢子 形状：大小（m）：壁：12 壳细胞 形状 大小（m）：总体生理学性状总体生理学性状 gross physiological characters，表IV:，表IV:1.查氏琼脂（查氏琼脂（Czapek agar,CA）25，7天天2.查氏酵母精琼脂（查氏酵母精琼脂（Czapek yeast exatract agar,CYA）25、37，7天天3.麦芽精或麦芽汁琼脂（麦芽精或麦芽汁琼脂（Malt extract agar,MEA;Wort agar,WA）25，7天天4.查氏酵母精查氏酵母精20%蔗糖琼脂蔗糖琼脂(Czapek yeast exatract agar with 20%succose,CY20S)25，7天天表 IV 曲霉属及其有性型总体生理学性状 种名：菌号：系：基物：组：地点：亚属：日期：CYA 培养基 性状 CA 257 天 257 天 3 77 天 MEA/WA257 天CY20S 257 天直径（mm）厚薄 表 面 和 边 缘 质地 分生孢子结构 菌丝体 渗出液 可 溶 性 色 素 反面 其他分类学性状其他分类学性状 Other taxonomic characters次级代谢产物次级代谢产物(secondary metabolite profile):Frisvad et al.泛醌泛醌(ubiquinone types).同功酶同功酶(isoenzyme profile)RFLP,RAPD,microsatellite DNA,serological methods.3.青霉与曲霉的分子种系学青霉与曲霉的分子种系学Phylogenetic studies of penicillia and aspergilli3.1 遗传表记遗传表记 Genetic markersrDNA ITS1-5.8S-ITS2（ca.600 bp)-tubulin gene(ca.400 bp)calmodulin gene(ca.600 bp)3.2 DNA 提取和扩增提取和扩增 DNA extraction and amplification3.3 纯化和测序纯化和测序 Purification and sequencing3.4.数据处理和统计学分析数据处理和统计学分析 data processing and statistical analysesrDNA ITS1-5.8S-ITS2Primers(White et al.,1990):Sense primers：ITS5:5-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3ITS1:5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3Antisense primer:ITS4:5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3Beta-微管蛋白微管蛋白 Beta-tubulin genePrimers(Glass&Donaldson,1995):Sense primer:Bt2a:5-GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC-3Antisense primer:Bt2b:5-ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC-3钙调蛋白基因钙调蛋白基因 Calmodulin genePrimers(Wang&Zhuang,2004):Sense primers:cmdD3:5-gac tcc ctg acc gaa gag ca-3cmdD4:5-gat tcc ctg acc gag gag ca-3Antisense primers:cmdA1:5-gc ctc acg gat cat ctc gtc-3cmdA2:5-gc ctc gcg gat cat ctc atc-33.2 DNA的提取DNA的提取 DNA extraction3.2 扩增和检测扩增和检测 Amplification and detection降落降落PCR(touch down PCR):95 for 5min;94 for 1min,50 for 1min,-0.5/cycle,72 for 1min,20 cycles;72 for 5min;94 for 1min,40 for 1min,72 for 1min,15 cycles;72 for 5min.电泳电泳 Electrophoresis:2.0%Agarose,80V,20 min;stained in0.5ug/mlethidium bromide3.3 扩增产物纯化和测序扩增产物纯化和测序 Purification and sequencing双向直通测序双向直通测序 Sequenced in double direction3.4 序列数据处理序列数据处理 Sequence processingBioedit 5.0.9。序列对位排列和人工校对序列对位排列和人工校对Alignment and editing ClustalX 1.81,Bioedit 5.0.93.5 统计学分析统计学分析 Statistical analyses系统发育树的建立系统发育树的建立 Phylogenetic tree constructionNJ:ClustalX 1.81MP:PAUP 4.0beta8a(Nexus format)评估评估 bootstrapSchizosaccharomyces pombeSaccharomyces cerevisiaeP.funiculosumP.variabileT.flavus 1T.flavus 2100P.aculeatumT.macrosporusP.pinophilum9874100T.trachyspermusA.nidulansdA.oryzaeP.striatisporumP.vinaceumP.corylophilumP.heteromorphum TP.restrictum100P.macrosclerotium TP.daleae TE.javanicum 1E.javanicum 2P.simplicissimumP.janthinellumE.brefeldianum 1E.brefeldianum 2100100100559510010062100E.sheariiP.waksmanii TP.steckii 1P.steckii 2P.roseopurpureumP.citrinum 1P.citrinum 2P.citrinum 3841001005572P.ellipsoideosporum TE.cinnamopurpureumP.shennongjianum T74P.implicatumE.ochrosalmoneum 1E.ochrosalmoneum 21008893100P.oxalicumP.adametziiP.adametzii T100P.thomiiE.pinetorumP.glabrum6177100P.scabrosum 1P.scabrosum 2P.scabrosum 3100P.brevicompactum 1P.brevicompactum 3P.brevicompactum 2100P.janczewskii 1P.janczewskii 2P.atramentosumE.baarnense 1E.baarnense 2100P.coprophilum 2P.coprophilum 1P.gladioliP.griseofulvumP.glandicolaP.vulpinumP.alliiP.crustosumP.aurantiogriseum 1P.aurantiogriseum 210099P.italicumP.digitatumP.expansum 1P.expansum 2P.expansum 3100P.viridicatcumP.persicinum TP.notatumP.griseoroseumP.chrysogenum99100E.crustaceum 1E.crustaceum 2E.sinaicum 1E.sinaicum 21009966100989192Knuc100991008210010087955360100521000.02IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXIFig.1 NJ tree inferred from the whole sequence data setTalaromyceslineageEupenicilliumlineage10E.sinaicum 1E.sinaicum 298E.crustaceum 1E.crustaceum 2P.griseoroseumP.chrysogenumP.notatum99P.persicinum T9496P.viridicatcum71P.expansum1P.expansum 3P.expansum 2100P.italicum7P.digitatum81P.aurantiogriseumP.aurantiogriseum100P.crustosum100P.allii8958P.coprophilum 1P.coprophilum 298P.griseofulvumP.gladioli82P.glandicolaP.vulpinum80E.baarnense 1E.baarnense 2100P.atramentosum10068P.brevicompactum 2P.brevicompactum 3P.brevicompactum 190P.scabrosum 2P.scabrosum 3P.scabrosum 18466P.janczewskii 1P.janczewskii 210078P.steckii 1P.steckii 2100P.waksmanii TE.shearii0P.citrinum 2P.citrinum 1100P.citrinum 3P.roseopurpureum94E.ochrosalmoneum 1E.ochrosalmoneum 2100P.implicatum68E.brefeldianum 1E.brefeldianum 299P.janthinellumE.javanicum 1E.javanicum 299P.simplicissimum69P.daleae T100P.macrosclerotium T99P.restrictumP.heteromorphum T99P.corylophilum995185E.cinnamopurpureumP.shennongjianum T98P.ellipsoideosporum TP.striatisporumP.vinaceum10072P.glabrumE.pinetorum53P.thomii99P.adametzii TP.adametzii9986P.oxalicum94A.nidulansA.oryzae62T.trachyspermus70P.pinophilumT.macrosporus90P.aculeatum60T.flavus 1T.flavus 26199P.variabile65P.funiculosumSaccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomyces pombe100IVIIIVIVIIVIIIIVIXIIXXIFig.2 MP tree inferred from the whole sequence data set EupenicilliumlineageTalaromyceslineagePublicationsWang L.,Zhuang W-Y.,20092009.Eupenicillium saturniforme,a new species discovered from northeast China.Mycopathologia167:297-305.Wang L.,Zhang X.-M.,Zhuang W.-Y.,20072007.Penicilliummacrosclerotiorum,a new species producing large sclerotiadiscovered in south China.Mycological Research 111:1242-1248.Wang L.,Zhuang W-Y.,20072007.Phylogenetic analyses of penicilliabased on partial calmodulin gene sequences.BioSystems88:113-126.孔华忠、孔华忠、王龙王龙，2007。中国真菌志第35卷。科学出版社。青霉属及其相关有性型属 科学出版社。Email: