照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中PD-L1介导免疫抑制的影响.pdf

林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响收稿日期:2 0 2 2 1 0 1 5 修回日期:2 0 2 2 1 1 2 6*广西自然科学基金项目(2 0 1 7 J J A 1 0 7 4 8),广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目(S 2 0 1 8 0 8),广西高校生物分子医学研究重点实验室开放课题项目(G X BMR 2 0 1 6 0 4),南宁市武鸣区科学研究与技术开发计划项目(2 0 2 0 0 2 1 3),广西壮族自治区卫生健康委员会西医类别自筹经费科研课题(Z 2 0 2 0 1 3 1 1)和南宁市武鸣区重点研发计划项目(2 0 2 1 0 1 2 4)资助。【第一作者简介】林春香(1 9 9 6-),女,在读硕士研究生,主要从事放射肿瘤学研究。【*通信作者】赵 伟(1 9 8 1-),男,博士,副教授,主要从事放射肿瘤学研究,E m a i l:z w e i 1 1 1 21 2 6.c o m。【引用本文】林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响J.广西科学,2 0 2 3,3 0(3):6 0 5 6 1 3.L I N C X,WE I K X,S ON G Q L,e t a l.E f f e c t o f R a d i a t i o n I n d u c e d A u t o p h a g y o n P D L 1 M e d i a t e d I mm u n o s u p p r e s s i o n i n T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e r J.G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,3 0(3):6 0 5 6 1 3.特邀栏目照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响*林春香,韦可璇,宋秋露,赵 伟*(广西医科大学附属武鸣医院放疗科,广西南宁 5 3 0 1 9 9)摘要:三阴性乳腺癌(T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e r,T N B C)中外泌体(E x o s o m e s)携带的细胞程序性死亡配体1(P r o g r a mm e d C e l l D e a t h L i g a n d 1,P D L 1)与肿瘤微环境(T u m o r M i c r o e n v i r o n m e n t,TME)免疫抑制相关。为探讨照射能否调节P D L 1的表达从而改善TME的作用,本研究首先通过R T q P C R和W e s t e r n b l o t检测自噬抑制剂氯喹(C h l o r o q u i n e,C Q)、自噬激活剂雷帕霉素(R a p a m y c i n,R a p a)及蛋白酶体抑制剂MG 1 3 2在联合或不联合照射下P D L 1、L C 3 B和P 6 2蛋白的表达情况;其次,采用细胞免疫荧光检测照射前后P D L 1的表达及定位改变;再次,采用W e s t e r n b l o t检测照射前后外泌体中P D L 1(s E V s P D L 1)的表达;最后,采用生物信息学对A T G 7与乳腺癌预后、信号通路的相关性进行分析。结果显示:P D L 1在T N B C中的表达高于非三阴性乳腺癌(n o n T N B C);P D L 1可通过自噬溶酶体降解,照射后诱导自噬可以促进P D L 1的胞浆转移及下调s E V s P D L 1的表达,具体机制可能与信号转导和转录激活因子3(S i g n a l T r a n s d u c e r a n d A c t i v a t o r o f T r a n s c r i p t i o n 3,S T AT 3)的激活及外泌体转运相关。上述结果说明照射可以通过影响自噬及外泌体的发生,使P D L 1在微环境中表达下调,进而调控肿瘤介导的免疫抑制。关键词:照射;外泌体;自噬;P D L 1;免疫调控中图分类号:R 7 3 7.9 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 5 9 1 6 4(2 0 2 3)0 3 0 6 0 5 0 9D O I:1 0.1 3 6 5 6/j.c n k i.g x k x.2 0 2 3 0 5 2 3.0 0 1 三阴性乳腺癌(T r i p l e N e g a t i v e B r e a s t C a n c e r,T N B C)是一种特殊亚型的乳腺癌,其 雌激素受 体(E s t r o g e n R e c e p t o r,E R)、孕激素受体(P r o g e s t e r o n e R e c e p t o r,P R)和原癌基因HE R 2均为阴性,极易发生远处转移和复发。T N B C进展快、预后差且缺少特异性治疗手段,因此免疫治疗是T N B C探索的方向之一。长期以来乳腺癌一直被认为是免疫学上的一种“冷”肿瘤,但是与其他亚型的乳腺癌相比,T N B C506广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3免疫原性更强1 3,提示免疫治疗已成为T N B C治疗新的希望。但实际上T N B C免疫检查点抑制剂单药治疗反应率不高,其中的原因尚未明确。信号转导和转录激活因子3(S i g n a l T r a n s d u c e r a n d A c t i v a t o r o f T r a n s c r i p t i o n 3,S T AT 3)的过度表达4、外泌体(E x o s o m e s)携带的细胞程序性死亡配体1(P r o g r a mm e d C e l l D e a t h L i g a n d 1,P D L 1)抑制肿瘤微环境5(T u m o r M i c r o e n v i r o n m e n t,TME)可能是T N B C免疫检查点抑制剂单药治疗效果差的原因。激活的S T AT 3不仅与肿瘤增殖、血管生成和转移有关,还能促进免疫抑制因子的表达,同时阻碍T h 1细胞6,7分泌细胞因子从而抑制T N B C的肿瘤微环境。肿瘤细胞分泌的外泌体富含免疫抑制蛋白,如P D L 1,其能使免疫细胞失活,并进一步阻止免疫细胞识别和杀伤肿瘤细胞8,9。目前,尚无靶向调控P D L 1转运、S T AT 3降解并诱导TME重塑的方法。放射治疗是包括乳腺癌在内多种恶性肿瘤治疗的三大治疗手段之一,对恶性肿瘤细胞有直接杀伤作用,对TME的组成部分也有至关重要的影响。以往的研究认为放射治疗具有免疫抑制作用1 0,包括较大的单组分辐射剂量(1 5-2 0 G y)可能会永久地减少血流1 1;放射治疗会引起免疫抑制相关分子(如肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素1 0和转化生长因子1 2,1 3)及细胞(如肿瘤相关巨噬细胞1 4、髓系抑制细胞和调节性T细胞)的聚集增多,同时引起淋巴细胞亚群损伤和功能受到抑制1 5。然而目前更多的研究认为放射治疗可以增强肿瘤细胞和TME的免疫敏感性,刺激肿瘤中更多的免疫细胞浸润和活化1 6 1 8。另外,照射可以诱导自噬的发生,细胞自噬与肿瘤的发生发展关系密切,并且自噬溶酶体途径参与了多种物质的转运1 9,2 0,但是细胞自噬调控P D L 1转运及与调节S T AT 3的机制尚未明确。本研究利用照射诱导肿瘤细胞发生自噬,探讨自噬对P D L 1和S T AT 3溶酶体降解的影响,为改善肿瘤微环境的免疫抑制及T B N C治疗提供一个新策略。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞与慢病毒载体 人乳腺癌细胞T N B C细胞株(MD A MB 2 3 1、B T 5 4 9)、非 三 阴 性 乳 腺 癌(n o n T N B C)细 胞 株(MC F 7、B T 4 7 4)及J u r k a t购自武汉普诺赛生命科技有限公司。根据A T G 7基因(G e n e I D:1 0 5 3 3)设计的重组慢病毒敲低载体s h A T G 7和空载体v e c t o r(阴性对照)购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。1.1.2 主要材料与试剂 自噬激活剂雷帕霉素(R a p a m y c i n,R a p a)购自美国S i g m a公司,自噬抑制剂氯喹(C h l o r o q u i n e,C Q)及蛋白酶体抑制剂MG 1 3 2、外泌体抑制剂GW 4 8 6 9购自M e d C h e m E x p r e s s,抗体L C 3 B、P 6 2、P D L 1购自美国A b c a m公司,E c a d h e r i n、V i m e n t i n购自赛信通(上海)生物试剂有限公司。GA P DH抗体、山羊抗兔l g G(H+L)和驴抗兔l g G(H+L)均购自上海碧云天生物技术有限公司,a c t i n购自圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司,B C A蛋白定量试剂盒、R I P A裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司,杜尔贝科改良伊格尔培养基(D u i b e c c o s M o d i f i e d E a g l e M e d i-u m,DMEM)、1 6 4 0培养基、胎牛血清(F B S)购自美国G I B C O公司,青霉素、链霉素混合液和P B S缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司,增强型化学发光(E C L)试剂盒(货号3 4 5 7 7)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 乳腺癌细胞培养于含1 0%胎牛血清、1%青霉素和链霉素混合液的DMEM,置于3 7、5%C O2的培养箱中,取对数生长期细胞用于后续研究。雷帕霉素的浓度为2 0 n m o l/L,氯喹的浓度为2 5 m o l/L,MG 1 3 2的浓度为5 mm o l/L,GW 4 8 6 9的浓度为2 0 m o l/L。在 照 射 前6 h加 入 以 上 浓 度 的 药 物,MG 1 3 2在预定的实验终点前2 h加入。照射组细胞采用直线加速器6 MV X进行照射,照射剂量为8 G y2 1,2 2,照射视野为4 0 c m4 0 c m,X射线辐射装置购自瑞典E l e k t a公司。1.2.2 慢病毒转染 选取处于对数生长期的MD A MB 2 3 1细胞进行慢病毒转染,待细胞铺满孔的5 0%时,按照说明书将慢病毒敲低载体s h AT G 7及空载慢病毒分别转染MD A MB 2 3 1细胞,经嘌呤霉素筛选后获得稳定转染的细胞株。采用W e s t e r n b l o t及R T q P C R验证转染效率。1.2.3 R T q P C R检测mR NA表达 使用T R I Z O L法提取细胞中总R NA,并使用5P r i m e S c r i p t R T M a s t e r M i x逆转 录 成c D NA。606林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响根据S Y B R G r e e n q P C R M a s t e r M i x说明书步骤进行R T q P C R检测。1.2.4 W e s t e r n b l o t检测蛋白表达 用R I P A液裂解各组细胞,离心收集蛋白,测定蛋白浓度,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S P AG E)分离蛋白,将蛋白转移到P V D F膜上,T B S T缓冲液洗膜3次,室温封闭2 0 m i n,分别加入一抗P 6 2、L C 3 B(均12 0 0 0稀释),P D L 1、E c a d-h e r i n、V i m e n t i n、a c t i n、GA P DH(均11 0 0 0稀释),4 孵育过夜,加入二抗(11 0 0 0)室温孵育 1 h,使用E C L显色。1.2.5 免疫荧光检测蛋白表达 弃去培养基,用P B S缓冲液洗涤细胞3次,加入4%多聚甲醛固定细胞 1 5 m i n,再用P B S缓冲液洗涤3次,用免疫封闭液封闭1 h。4 孵育相应一抗过夜,用P B S缓冲液洗涤3次,3 7 孵育荧光二抗1 h,再用D A P I染细胞核5 m i n。设置未照射(N C)和照射(I R,8 G y)两个处理。在E VO S F L自动显微镜下观察细胞P D L 1蛋白的绿色荧光焦点数。1.2.6 外泌体的提取与鉴定 将乳腺癌细胞MD A MB 2 3 1置于T 1 7 5培养瓶中培养,使用无外泌体完全培养基培养,当细胞密度达8 0%左右时,给予8 G y X射线照射,继续培养2 4 h,然后收集细胞上清。通过差速超速离心法提取未照射(N C)与照射(I R)处理的外泌体,用透射电子显微镜观察外泌体的形态,纳米颗粒追踪分析(NT A)外泌体的粒径大小,W e s t e r n b l o t检测外泌体标志蛋白C D 6 3、T S G 1 0 1、A L I X的表达。1.2.7 生物信息学分析 通过在线数据库G E P I A(h t t p:/g e p i a.c a n c e r p k u.c n/)的s u r v i v a l模块验证自噬关键基因A T G 7与乳腺癌预后的相关性;利用数据库的C o r r e l a t i o n模块对A T G 7与S T AT 1、S T AT 2、S T AT 3的关联性进行分析。1.3 统计学方法 采用G r a p h P a d p r i s m 8.0进行统计分析作图。采用单因素方差分析或独立性t检验进行数据组间分析,P0.0 5表示有统计学意义。2 结果与分析2.1 P D L 1在乳腺癌细胞中的差异表达 通过R T q P C R 图1(a)和W e s t e r n b l o t 图1(b)检测T N B C细胞株(MD A MB 2 3 1、B T 5 4 9)及n o n T N B C细胞株(MC F 7、B T 4 7 4)中P D L 1的表达,结果表明,T N B C细胞株中P D L 1的mR NA和蛋白表达均高于n o n T N B C。*i n d i c a t e s P0.0 1,*i n d i c a t e s P0.0 0 1.图1 P D L 1在乳腺癌细胞中的差异表达F i g.1 D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f P D L 1 i n b r e a s t c a n c e r c e l l s2.2 蛋白酶体和自噬溶酶体对P D L 1表达的影响 为进一步了解P D L 1降解的主要途径,使用自噬抑制剂C Q、自噬激活剂R a p a及蛋白酶体抑制剂MG 1 3 2进行联合或不联合照射(I R),二甲基亚砜(DM S O)为阴性对照。W e s t e r n b l o t的结果显示,单用MG 1 3 2几乎不能上调P D L 1的表达;而单用C Q虽然可以上调P D L 1的表达,但是效果不显著 图2(a)。当联合照射时,P D L 1的表达明显提高。当使用自噬激活剂R a p a时,P D L 1的表达下调,联合照射不能使P D L 1恢复至DM S O组水平 图2:(b)(c),说明自噬溶酶体途径可能是P D L 1降解的主要途径。2.3 照射对T N B C细胞中P D L 1表达及转运的影响 免疫荧光结果显示,照射后MD A MB 2 3 1细胞的P D L 1蛋白在细胞内的荧光焦点数增多(图3)。免疫荧光结果表明照射促进了P D L 1的内吞并向胞706广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.3n s i n d i c a t e s n o s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e,*i n d i c a t e s P0.0 1,*i n d i c a t e s P0.0 0 1.图2 蛋白酶体和自噬溶酶体对P D L 1表达的影响F i g.2 E f f e c t s o f p r o t e a s o m e s a n d a u t o p h a g y l y s o s o m e s o n P D L 1 e x p r e s s i o nC o m p a r e d w i t h t h e N C g r o u p,*i n d i c a t e s P0.0 5,*i n d i c a t e s P0.0 1.图3 照射对TN B C细胞中P D L 1表达及转运的影响F i g.3 E f f e c t s o f i r r a d i a t i o n o n P D L 1 e x p r e s s i o n a n d t r a n s p o r t i n T N B C c e l l内转移,即照射过程中细胞的内吞外排途径可以调节P D L 1的表达。2.4 照射对T N B C细胞中s E V s P D L 1表达的影响 为确定照射对肿瘤微环境中P D L 1的作用,通过差速超速离心法分离细胞培养上清,获得纯化的外泌体。NT A结果发现外泌体粒径大小为1 6 0 n m左右 图4:(a)(b)。透射电子显微镜下,可见有明显的膜结 构,呈 近 似 半 球 状 的 囊 泡 结 构 图4(c)。W e s t e r n b l o t验 证 了 外 泌 体 蛋 白 标 志C D 6 3、T S G 1 0 1、A L I X的表达呈阳性 图4(d)。同时,透射电子显微镜及NT A发现,与未照射组相比,经过8 G y照射增加了细胞外囊泡的整体释放,然而W e s t-e r n b l o t检测结果显示,8 G y照射后相同数量囊泡下的s E V s P D L 1表达却下降 图4(d)。以上结果提示照射可能促进细胞表面P D L 1内吞并转移至溶酶体降解,促使s E V s P D L 1表达下降从而改善TME。2.5 A T G 7与乳腺癌预后及信号通路的相关性分析 利 用 在 线 数 据 库G E P I A验 证 自 噬 关 键 基 因A T G 7与乳腺癌预后的相关性,结果表明A T G 7的低表 达 与 乳 腺 癌 不 良 预 后 有 关,同 时A T G 7与S T AT 3相 关 性 最 强(图5),说 明A T G 7可 能 与S T AT 3信号通路的调控相关。806林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响图4 照射对TN B C细胞中s E V s P D L 1表达的影响F i g.4 E f f e c t o f i r r a d i a t i o n o n e x p r e s s i o n o f s E V s P D L 1 f r o m T N B C c e l l s图5 A T G 7与乳腺癌预后及信号通路的相关性分析F i g.5 C o r r e l a t i o n a n a l y s i s o f A T G 7 w i t h p r o g n o s i s a n d s i g n a l p a t h w a y o f b r e a s t c a n c e r906广西科学,2 0 2 3年,3 0卷,第3期 G u a n g x i S c i e n c e s,2 0 2 3,V o l.3 0 N o.32.6 抑制自噬和(或)抑制外泌体释放对细胞P D L 1表达及S T A T 3激活的影响 利用慢病毒介导A T G 7的沉默,使用外泌体抑制剂GW 4 8 6 9阻碍外泌体的释放,结果表明,与空白对照组相比,单独照射组可激活S T AT 3,提高P D L 1的表达;与单独沉默A T G 7相比,联合使用GW 4 8 6 9可使P D L 1的表达升高,并且照射可在上述分组中进一步提高P D L 1的表达(图6)。照射、抑制自噬、抑制外泌体释放均可提高P D L 1的表达,其中照射和抑制自噬提高P D L 1的表达与S T AT 3的激活有关。+i n d i c a t e s g e n e k n o c k d o w n/i r r a d i a t i o n u s i n g GW 4 8 6 9 i n h i b i t o r,-i n d i c a t e s n o t u s e d.图6 抑制自噬和(或)抑制外泌体释放对P D L 1表达及S T A T 3激活的影响 F i g.6 E f f e c t s o f i n h i b i t i o n o f a u t o p h a g y a n d/o r e x o c r i n e r e l e a s e o n P D L 1 e x p r e s s i o n a n d S TA T 3 a c t i v a t i o n3 讨论 三阴性乳腺癌被认为是最具致命性的乳腺癌亚型,具有高度侵袭性,而且对当前的治疗方法(包括免疫治疗)反应较差。近几年来肿瘤的免疫治疗如雨后春笋崛起,主流医学曾有过很多关于实体瘤中T细胞浸润与术后预后相关的报道,总体上支持T细胞数量越多,特别是C D 8+T细胞的数量越多预后效果越好的结论2 3。本课题组致力于放射治疗与细胞自噬相互作用的研究2 4,2 5,同时了解到细胞自噬对各种刺激产生的胞外小泡的数量和命运起着决定性的作用2 6 2 8,而这些外泌体9,2 9是TME的重要组成部分。在胶质母细胞瘤3 0以及人类黑色素瘤细胞5等多种肿瘤中的研究显示,外泌体中的P D L 1具有抑制T细胞功能的作用,导致TME处于免疫抑制状态。乳腺癌中还存在S T AT 3的过度激活,而肿瘤细胞中激活的S T AT 3不仅可以抑制免疫刺激介质的产生,还可以促进免疫抑制因子的释放,从而导致TME中S T AT 3相关T细胞免疫抑制3 1。然而细胞自噬与外泌体囊泡的转运关系以及照射诱导细胞自噬与S T AT 3信号通路的关系仍不明确。目前在T N B C中,尚不清楚照射是否能调节P D L 1的转运及表达进而调控TME。本研究在细胞免疫荧光实验中发现,照射处理上调了MD A MB 2 3 1细胞P D L 1的表达,同时使P D L 1发生了核转位,核转位的P D L 1增多意味着细胞内吞而来的P D L 1减少了,进而可能会导致TME中s E V s P D L 1的减少,减轻TME的免疫抑制。本研究虽然对s E V s P D L 1的表达进行了检测,结果也证实了照射可以下调s E V s P D L 1,但是仍缺乏对TME免疫状态的直接检测。而照射诱导的P D L 1核转位可能由于低氧而引起S T AT 3的激活3 2,照射3 3及低氧环境3 4均会诱导自噬的发生,照射联合诱导自噬是否会促进S T AT 3的降解以及它们之间的联系尚未明确。本研究发现,在T N B C中P D L 1的表达受到自噬溶酶体途径及内吞外泌体途径的共同调节,而不是蛋白酶体途径,抑制自噬及抑制外泌体释放均使P D L 1表达增加。为进一步证明抑制自噬与P D L 1的关系,通过沉默A T G 7联合或不联合照射发现,抑制自噬及照射均激活了S T AT 3,上调了P D L 1的表达。从以上结果可以看出,不管是照射还是抑制自噬最终都是S T AT 3的激活使P D L 1表达上调,但是本研究缺乏对过表达A T G 7后是否会降解S T AT 3的研究,后期会继续补充该方面实验。因此,照射联合自噬激活剂或许可以靶向降解S T AT 3,为减轻或解除免疫抑制提供新思路。乳腺癌存在S T AT 3的过度激活,S T AT 3曾被认为是“不可成药”靶点,与化疗耐药、放射抗拒有关;S T AT 3使得巨噬细胞向M 2极化,产生诸如白细胞介素 1 0、白细胞介素 2 3和转化生长因子等免疫抑制因子,S T AT 3促进了免疫抑制的TME,参 与 调 节 早 期 肿 瘤 生 长 和 后 期 转 移阶段3 5。综上可知,照射可以促进P D L 1的核转位,减少TME中s E V s P D L 1的分泌,并且照射诱导的细胞自噬可能会降解S T AT 3,减轻TME的抑制,照射联合自噬诱导可产生协同增效的抗肿瘤作用,为T N B C治疗提供新思考。同时本研究的结果就细胞自噬方面而言,再一次验证了T N B C的治疗不是抑制自噬,016林春香,韦可璇,宋秋露,等.照射诱导自噬对三阴性乳腺癌中P D L 1介导免疫抑制的影响而是利用照射诱导的自噬性细胞死亡,后续还需要更多体内外实验去阐述诱导自噬对杀伤T N B C的影响,并且还需进一步通过细胞实验及体内动物实验证明照射改变外泌体释放及其内容物进而调节肿瘤免疫抑制。4 结论 本研究发现了T N B C细胞中照射诱导P D L 1的降解与细胞自噬相关的可能作用机制。照射过程中,抑制自噬可通过激活S T AT 3上调P D L 1的表达,而激活自噬可通过溶酶体清除P D L 1从而减轻其介导的免疫抑制。此外,照射还可以诱导细胞自噬继而选择性降解照射后转运至胞内的P D L 1,降低外泌体中P D L 1(s E V s P D L 1)的表达。总而言之,本研究以P D L 1为靶点,探索照射过程中其降解减少的主要途径,为分析T N B C中抗P D 1/P D L 1抑制剂疗效低的原因提供了一种新思路,也为T N B C联合免疫治疗策略提供了新依据。参考文献1 B A R R O S O S OU S A R,J A I N E,C OHE N O,e t a l.P r e v-a l e n c e a n d m u t a t i o n a l d e t e r m i n a n t s o f h i g h t u m o r m u t a-t i o n b u r d e n i n b r e a s t c a n c e r J.A n n a l s o f O n c o l o g y,2 0 2 0,3 1(3):3 8 7 3 9 4.2 M I T T E N D O R F E A,P H I L I P S A V,ME R I C B E R N S-TAM F,e t a l.P D L 1 e x p r e s s i o n i n t r i p l e n e g a t i v e b r e a s t c a n c e r J.C a n c e r I mm u n o l o g y R e s e a r c h,2 0 1 4,2(4):3 6 1 3 7 0.3 D E NK E R T C,VON M I N C KW I T Z G,D A R B E S F AH-AN I S,e t a l.T u m o u r i n f i l t r a t i n g l y m p h o c y t e s a n d p r o g-n o s i s i n d i f f e r e n t s u b t y p e s o f b r e a s t c a n c e r:a p o o l e d a-n a l y s i s o f 3 7 7 1 p a t i e n t s t r e a t e d w i t h n e o a d j u v a n t t h e r a-p y J.T h e L a n c e t O n c o l o g y,2 0 1 8,1 9(1):4 0 5 0.4 Z OU S L,TONG Q Y,L I U B W,e t a l.T a r g e t i n g S T A T 3 i n c a n c e r i mm u n o t h e r a p y J.M o l e c u l a r C a n c-e r,2 0 2 0,1 9:1 4 5.5 CHE N G,HUANG A C,Z HANG W,e t a l.E x o s o m a l P D L 1 c o n t r i b u t e s t o i mm u n o s u p p r e s s i o n a n d i s a s s o c i-a t e d w i t h a n t i P D1 r e s p o n s e J.N a t u r e,2 0 1 8,5 6 0(7 7 1 8):3 8 2 3 8 6.6 HA S H I MO TO S,HA S H I MOT O A,MUR OMO TO R,e t a l.C e n t r a l r o l e s o f S T A T 3 m e d i a t e d s i g n a l s i n o n s e t a n d d e v e l o p m e n t o f c a n c e r s:t u m o r i g e n e s i s a n d i mm u n o-s u r v e i l l a n c e J.C e l l s,2 0 2 2,1 1:2 6 1 8.7 KOR T Y L EWS K I M,YU H.R o l e o f S t a t 3 i n s u p p r e s s-i n g a n t i t u m o r i mm u n i t y J.C u r r e n t O p i n i o n i n I mm u-n o l o g y,2 0 0 8,2 0:2 2 8 2 3 3.8 YANG Y,L I C W,CHAN L C,e t a l.E x o s o m a l P D L 1 h a r b o r s a c t i v e d e f e n s e f u n c t i o n t o s u p p r e s s T c e l l k i l l i n g o f b r e a s t c a n c e r c e l l s a n d p r o m o t e t u m o r g r o w t h J.C e l l R e s e a r c h,2 0 1 8,2 8(8):8 6 2 8 6 4.9 CHE N J,S ON G Y,M I AO F,e t a l.P D L 1 p o s i t i v e e x o-s o m e s s u p p r e s s a n t i t u m o r i mm u n i t y b y i n d u c i n g t u m o r s p e c i f i c C D 8+T c e l l e x h a u s t i o n d u r i n g m e t a s t a s i s J.C a n c e r S c i e n c e,2 0 2 1,1 1 2(9):3 4 3 7 3 4 5 4.1 0 F R I E DMAN E J.I mm u n e m o d u l a t i o n b y i o n i z i n g r a d i-a t i o n a n d i t s i m p l i c a t i o n s f o r c a n c e r i mm u n o t h e r a p y J.C u r r e n t P h a r m a c e u t i c a l D e s i g n,2 0 0 2,8(1 9):1 7 6 5 1 7 8 0.1 1 CH I N M S,F R E N I E R E B B,B ONN E Y C F,e t a l.S k i n p e r f u s i o n a n d o x y g e n a t i o n c h a n g e s i n r a d i a t i o n f i b r o s i s J.P l a s t i c a n d R e c o n s t r u c t i v e S u r g e r y,2 0 1 3,1 3 1(4):7 0 7 7 1 6.1 2 H I N I K E R S M,CHE N D S,R E D D Y S,e t a l.A s y s t e m i c c o m p l e t e r e s p o n s e o f m e t a s t a t i c m e l a n o m a t o l o c a l r a d i a t i o n a n d i mm u n o t h e r a p y J.T r a n s l a t i o n a l O n c o l-o g y,2 0 1 2,5(6):4 0 4 4 0 7.1 3 HA R R I S T J,H I P K I S S E L,B OR Z I L L A R Y S,e t a l.R a d i o t h e r a p y a u g m e n t s t h e i mm u n e r e s p o n s e t o p r o s-t a t e c a n c e r i n a t i m e d e p e n d e n t m a n n e r J.T h e P r o s-t a t e,2 0 0 8,6 8(1 2):1 3 1 9 1 3 2 9.1 4 L AOU I D,VAN OV E RME I R E E,D E B A E T S E L I E R P,e t a l.F u n c t i o n a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t u m o r a s s o c i-a t e d m a c r o p h a g e s a n d m a c r o p h a g e c o l o n y s t i m u l a t i n g f a c t o r a s c o n t r i b u t o r s t o c a n c e r p r o g r e s s i o n J.F r o n-t i e r s i n I mm u n o l o g y,2 0 1 4,5:4 8 9.1 5 P A R K E R J J,J ON E S J C,S T R O B E R S,e t a l.C h a r a c-t e r i z a t i o n o f d i r e c t r a d i a t i o n i n d u c e d i mm u n e f u n c t i o n a n d m o l e c u l a r s i g n a l i n g c h a n g e s i n a n a n t i g e n p r e s e n-t i n g c e l l l i n e