芽孢杆菌DZY6715生物膜形成对其抗油茶炭疽病的影响.pdf

Vol.41 No.2Jun.2023第 41 卷 第 2 期2023 年 6 月经 济 林 研 究 Non-wood Forest Research收稿日期：2022-10-16基金项目：国家自然科学基金项目（32160395）；云南省教育厅科学研究基金项目（2018JS327）；西南林业大学科研启动基金项目（111923）。第一作者：董奎奎（），硕士研究生。通信作者：王芳（），副教授，博士，硕士研究生导师。引文格式：董奎奎,刘地,李绕勇,等.芽孢杆菌 DZY6715 生物膜形成对其抗油茶炭疽病的影响 J.经济林研究,2023,41(2):91-101.DONG K K,LIU D,LI R Y,et al.The effect of biofilm formation on antagonistic ability of Bacillus spp.DZY6715 against anthracnose of Camellia oleiferaJ.Non-wood Forest Research,2023,41(2):91-101.芽孢杆菌 DZY6715 生物膜形成对其 抗油茶炭疽病的影响董奎奎，刘 地，李绕勇，伍建榕，邓 佳，王 芳（西南林业大学 a.西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室；b.西南地区生物多样性保育国家林业和 草原局重点实验室；c.云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224）摘 要：【目的】探究内生芽孢杆菌 DZY6715 生物膜的形成对其抗油茶炭疽病的影响情况，为油茶炭疽病的绿色防控提供参考依据。【方法】选取分离自油茶健康叶片的内生芽孢杆菌 DZY6715 为出发菌株，对其进行化学诱变，从中筛选出 3 株生物膜存在缺陷的突变菌株（其编号分别为-4、15、21）。然后观察 DZY6715 野生菌株和-4、15、21 号突变菌株的生物膜生长特性，测定其群游能力及生物膜形成能力，在此基础上，通过平板对峙实验、扫描电镜观察和油茶离体叶片回接实验，测定不同菌株对油茶炭疽病的抑制能力和生防效果。【结果】DZY6715 野生菌株和-4、15、21 号突变菌株的生长趋势基本一致，但是，与 DZY6715 野生菌株相比，3 株突变菌株的群游能力均较弱，其生物膜的生长速度均较慢，其生物膜的结构强度均较弱。平板对峙实验结果表明，突变菌株对油茶炭疽病菌的抑制能力随着其生物膜形成能力的降低而降低，其中-4 号突变菌株对油茶炭疽病菌的抑制率最低，为 57.44%，显著低于 DZY6715 野生菌株的抑制率（65.70%）。扫描电镜观察中发现，DZY6715 野生菌株对油茶炭疽病菌菌丝的破坏力最强，能使菌丝内含物严重渗漏。油茶离体叶片回接实验结果表明，DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株均能不同程度地降低油茶炭疽病的发病率和病情指数，但 DZY6715 野生菌株的防治效果更好，接种处理 7 d 后的发病率和病情指数分别为 20.22%和 5.55，均显著低于突变菌株的。【结论】内生芽孢杆菌 DZY6715 生物膜的形成，能使其在油茶炭疽病的生物防治中发挥出重要作用。关键词：内生芽孢杆菌；生物膜；油茶；炭疽病；生物防治中图分类号：S608；S794.4 文献标志码：A 文章编号：10038981(2023)02009111The effect of biofilm formation on antagonistic ability of Bacillus spp.DZY6715 against anthracnose of Camellia oleiferaDONG Kuikui,LIU Di,LI Raoyong,WU Jianrong,DENG Jia,WANG Fang(a.Key Laboratory of Conservation and Utilization of Forest Resources in Southwest Chinas Mountains,Ministry of Education;b.Key Laboratory of the State Forestry and Grassland Administration for Biodiversity Conservation in Southwest China;c.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Higher Education Institutions,Southwest Forestry University,Kunming 650224,Yunnan,China)Abstract:【Objective】The aim was to investigate the effect of biofilm formation on antagonistic ability of endophytic Bacillus spp.DZY6715 against anthracnose of Camellia oleifera,which would provide a reference basis for green control of C.oleifera anthracnose.【Method】Three biofilm-deficient mutant strains(their numbers were-4,15 and 21)were derived from wild-type strain DZY6715 isolated from healthy leaves of C.oleifera by using the treatment of chemical mutagen.Then the biofilm-related characteristics of the wild strain DZY6715 and the mutant strains-4,15 and 21 were observed to determine their swarming ability and biofilm formation ability.On this basis,the inhibition ability and Doi:10.14067/ki.1003-8981.2023.02.010http:/92第 2 期董奎奎，等：芽孢杆菌 DZY6715 生物膜形成对其抗油茶炭疽病的影响油茶 Camellia oleifera 为山茶科 Theaceae 山茶属 Camellia 油料树种，具有悠久的培育和利用 历史1-2。茶油营养丰富，被人们誉为“东方橄榄油”3。油茶产业的发展对于我国乡村振兴、农村经济发展、生态环境改善均有重要贡献4。炭疽病严重危害油茶生长，给我国油茶种植业的发展造成了不利影响。炭疽病主要发生在油茶的叶片和果实上5，引起果实和花蕾的凋落及枝梢的枯死，病害严重时会使整株衰亡，造成重大经济损失6。目前，油茶炭疽病的防治方法仍以化学防治为主，但是，化学农药的长期使用不仅会增强病原菌的耐药性，还会污染环境。因此，选取安全性好、防效高、成本低的生物防治以代替化学防治，生物防治是油茶炭疽病的最佳防治措施7-8。芽孢杆菌 Bacillus spp.是被广泛应用于植物病害防治的生防菌，芽孢杆菌的生防机制主要包括 4 种：营养和空间位点竞争、分泌抗菌物质、溶菌作用，诱导植物抗病性9。Chen 等10报道，贝莱斯芽孢杆菌 LM2303 能通过产生抗菌物质而诱导植物系统的抗性，促进植物生长及其与空间的竞争和对营养物质的吸收，从而防治小麦赤霉病。生防菌能够充分发挥生防作用的前提是其能在植物根际或体内有效定殖11-12。而生防菌生物膜（biofilm）的形成显著影响其在植物的定殖，进而直接影响生物防治效果13。Klein等14研究发现，ACBL-77 出芽短梗霉菌 Aureobasidium pullulans 生物膜的形成能显著增强柑橘对柑橘酸腐病的抵抗力。Timmusk 等15比较了生物膜形成能力不同的多粘类芽孢杆菌对拟南芥瓜果腐霉病的防治效果，结果发现，生物膜形成能力强的多粘类芽孢杆菌对拟南芥瓜果腐霉病的防治效果更好。前期研究发现，分离自油茶健康叶片的 1 株芽孢杆菌 DZY6715 对油茶炭疽病病原菌具有很好的抑制作用，且该菌株可以形成明显的生物膜。为了给油茶炭疽病绿色防治技术的开发提供参考依据，本研究以该菌株为出发菌株，对其进行化学诱变，从诱变菌株中筛选出生物膜存在缺陷的突变菌株，进而比较野生菌株和突变菌株的生物膜特性，并采用平板对峙法、离体叶片回接实验和扫描电镜观察比较分析两者抑制油茶炭疽病菌的能力，以探究内生芽孢杆菌 DZY6715 生物膜的形成与其防治油茶炭疽病的关系，从而为其生防机制的深入研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 供试的菌株供试的 DZY6715 生防菌 Bacillus tequilensis 为分离自油茶健康叶片的内生芽孢杆菌，现保存于西南林业大学生物多样性保护与利用学院病理学实验室，由西南林业大学生物多样性保护与利用学院的伍建榕教授提供。供试的病原菌为果生炭疽病菌 Colletotrichum fructicola，分离自油茶炭疽病病斑的病原菌，现保存于西南林业大学生物多样性保护与利用学院病理学实验室，由西南林业大学生物多样性保护与biocontrol effect of different strains on C.oleifera anthracnose were determined by the dual-culture plate assay,scanning electron microscope observation and tie-back on the C.oleifera detached leaves.【Result】The growth trends of wild strain DZY6715 and mutant strains-4,15 and 21 almost the same,however,compared with the wild strain DZY6715,3 mutant strains had weaker swarming ability,and their biofilm growth rates were relatively slow as well as their biofilm structural strengths were relatively weak.The result of dual-culture plate assay showed that the inhibitory ability against Colletotrichum fructicola for the mutant strains decreased with their biofilm-forming ability,and mutant strain-4 had the lowest inhibition rate of 57.44%,which was significantly lower than that of wild strain DZY6715 of 65.70%.Using scanning electron microscope observed the hyphae of C.fructicola,and it showed that the hyphae affected by the wild strain DZY6715 were seriously damaged,with severe leakage of mycelial contents.The tie-back on the C.oleifera detached leaves showed that the incidence and disease index of C.oleifera anthracnose decreased treated with wild strain DZY6715 and the three mutant strains,while the wild strain DZY6715 was more effective,with the incidence and disease index of 20.22%and 5.55,respectively,after 7 d of inoculation,which were significantly lower than those of the mutant strains.【Conclusion】Biofilm formation of the endophytic Bacillus sp.DZY6715 plays an important role in the biological control of C.oleifera anthracnose.Keywords:endophytic Bacillus spp.;biofilm;Camellia oleifera;anthracnose;biological control93第 41 卷经 济 林 研 究利用学院的伍建榕教授提供。1.1.2 供试的油茶植株供试的油茶 Camellia oleifera 植株为云南省德宏傣族景颇族自治州油茶基地的2年生油茶幼苗，已移栽种植于西南林业大学大棚内。1.2 方 法1.2.1 突变菌株的筛选及其菌落形态的观察将DZY6715野生菌株置于28 的温度条件下过夜培养，然后以 5 000 r/min 的转速离心 5 min，收集菌体，再将其溶解于 1.0 mg/mL 的 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）中，于 28 的温度条件下孵育 30 min 进行化学诱变，然后将其稀释涂布于 LB 平板上，结果获得 200 株突变菌株，再根据生物膜不同褶皱的分化表型16，从 200 株突变菌株中筛选出3株生物膜存在缺陷的突变菌株，其编号分别为-4、15、21。最后将 DZY6715 野生菌株和筛选出的 3 株突变菌株分别划于 LB 固体培养基上，置于 28 的培养箱中培养 48 h，以 Zeiss体视显微镜观察拍照并记录其菌落形态。1.2.2 DZY6715 野生菌株和突变菌株生长能力的检测采用平板计数法17分别检测 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生长能力。取培养 24 h 后的菌落，将其转移至 100 mL 的 LB 液体培养基中培养，分别于培养 6、12、24、48、72、96、120 h（共 7 个时间点）各取 100 L 菌液，适度稀释后，选择合适的稀释度（106、107、108）在 LB固体培养基上涂布，再置于 28 的培养箱中培养48 h 后计数，然后根据计数结果计算每毫升菌液中的活菌数量：每毫升菌液中的活菌总数（CFU）=同一稀释度 3 次重复检测到的菌落平均数 稀释倍数 10。最后，以培养时间为横坐标，以每毫升菌液中活菌数（CFU）的对数值为纵坐标，绘制不同菌株的生长曲线。1.2.3 DZY6715 野生菌株和突变菌株生物膜形成能力的检测采用结晶紫染色法18分别检测 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生物膜形成能力。取 LB平板培养基上的 DZY6715 野生菌株和突变菌株的单菌落，将其转移至 100 mL 的 LB 液体培养基中，置于转速为 120 r/min 的摇床上，于 28 的温度条件下培养 24 h。先在聚苯乙烯 24 孔培养板上加入 1 000 L 的 LB 液体培养基，再加入已培养好的细菌菌悬液 1 000 L，以不加菌悬液的 2 000 L的 LB 液体培养基为对照，每个菌株处理各设 3 次重复，于 28 的培养箱中培养，分别于培养 3、6、9、12、24、48、72、96、120 h（共 9 个时间点）测定野生菌株和突变菌株的生物膜形成能力。培养结束后，用移液枪缓慢移除每孔中的液体和沉淀物，加入 0.1%的结晶紫溶液，将生物膜染色 10 min，再以无菌水洗脱 5 次，然后加入 40%的醋酸溶液 2 mL 以溶解生物膜，经无菌水稀释后，以紫外可见分光光度计定量检测波长为 560 nm 处的吸光度（A560 nm）。1.2.4 DZY6715 野生菌株和突变菌株群游能力的检测采用半固体平板法19分别检测 DZY6715野生菌株和 3 株突变菌株的群游能力。先将DZY6715 野生菌株和生物膜存在缺陷的突变菌株过夜培养 24 h，取已培养好的菌悬液 3 L 点接于含有 0.7%琼脂的 LB 半固体培养基上，然后将其置于 28 的培养箱中培养，每个菌株处理各设 3 次重复，分别在培养 6、12、18 h 后拍照并记录菌落形态。1.2.5 DZY6715 野生菌株和突变菌株抑菌能力的检测1）采用平板对峙法20分别测定 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株体外对炭疽病菌的抑制作用。以油茶果生炭疽病菌为指示菌，先将活化后的炭疽病菌制成直径为 5 mm 的菌饼，将其接种至PDA 培养基中央，在距离炭疽病菌 3 cm 处接种待测菌株的菌悬液，以无菌水处理为对照，每个处理各设 3 次重复，然后置于 28 的培养箱中培养，定期记录病原菌直径，并按此公式计算抑菌率：抑菌率=（对照病原菌的直径-处理病原菌的直径）/对照病原菌的直径 100%。2）将 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株回接油茶离体叶片，分别检测其生防效果。实验共设 10 个处理，每个处理各设 3 次重复，各处理所用材料分别说明如下：处理 1，无菌水；处理 2，DZY6715 菌悬液；处理 3，-4 号菌悬液；处理 4，15 号菌悬液；处理 5，21 号菌悬液；处理 6，油茶炭疽病菌菌块；处理 7，DZY6715 号菌悬液+油茶炭疽病菌菌块；处理 8，-4 号菌悬液+油茶炭疽病菌菌块；处理 9，15 号菌悬液+油茶炭疽病菌菌块；处理10，21号菌悬液+油茶炭疽病菌菌块。先将培养 24 h 的菌悬液均匀地喷施到经无菌接种针刺伤的健康的油茶叶片上，喷施 24 h 后再将直径为 5 mm 的油茶炭疽病菌菌块接种至叶片被94第 2 期董奎奎，等：芽孢杆菌 DZY6715 生物膜形成对其抗油茶炭疽病的影响刺伤处（处理 1 5 只喷施所用菌液，不接种炭疽病菌；处理 6 不喷施菌液，只接种炭疽病菌），将处理后的油茶叶片置于室温条件下培养，定期记录其发病情况，并计算病情指数和发病率21，其中，叶片质量的等级标准见表 1，病情指数和发病率的计算公式如下：K=(K1/K2)100%；G=(at)/(AT)100。式中：K 表示发病率，K1表示每次重复的发病叶片数，K2表示每次重复的叶片总数；G 表示病情指数，a 表示每次重复的各质量等级叶片数，t 表示叶片质量等级的代表数值（表 1），A 表示每次重复的叶片总数；T 表示叶片质量最高等级的代表数值（表 1）。表 1 油茶叶片质量分级标准Table 1 Grade standard for C.oleifera leaves quality级别Level分级标准Grading criteria代表数值Representative values0无病斑0病斑面积 0.2 cm21病斑面积整个叶片的 1/102病斑面积整个叶片的 1/23病斑面积整个叶片的 1/241.2.6 DZY6715 野生菌株和突变菌株抑制炭疽病菌效果的扫描电镜观察选取突变菌株中生物膜形成能力和抑菌效果最差的菌株，参照 1.2.5 中所述方法对其进行平板对峙培养，培养 10 d 后，利用解剖刀切取芽孢杆菌与炭疽病菌菌丝交接处 0.5 1.0 cm2的菌块，经固定、脱水、干燥和镀膜处理后，使用 Hitachi Regulus 8100 扫描电镜对其进行观察22-23。1.2.7 数据处理与分析采用 Excel 2010 软件对实验数据进行初步处理，采用 SPSS 17.0 软件中的 Duncans 检验法检测不同处理间的差异，差异水平为 P 0.05。2 结果与分析2.1 突变菌株的筛选结果及其菌落形态将 DZY6715 野生菌株进行化学诱变处理，结果获得 200 株突变菌株，观察其生物膜形态后，从中筛选出了 3 株生物膜存在缺陷的突变菌株，其编号分别为-4、15、21。DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的菌落形态如图 1 所示。从图 1 中可以看出，DZY6715 野生菌株菌落的立体形态褶皱最多，其生物膜延展性最强；-4 号突变菌株菌落的褶皱最少，其延展性最弱；15 和 21 号突变菌株菌落的褶皱量均处于前两者之间，都只在菌落中间才有褶皱，也都有一定的延展性。4 株菌株的生物膜延展性由强到弱依次为 DZY6715、15、21、-4，3 株突变菌株在生物膜形成上均有不同程度的缺陷。图 1 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的菌落形态Fig.1 Colony morphology of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains2.2 DZY6715 野生菌株和突变菌株的生长能力DZY6715 野生菌株突变为生物膜存在缺陷的突变菌株后是否能正常生长，这是决定后续实验是否能完成的关键因素。DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生长曲线如图 2 所示。从图 2 中可以看出，DZY6715 野生菌株和-4、15、21 号突变菌株的生长趋势基本一致，即培养 12 24 h 均为其对数生长期，培养 24 72 h 均为其稳定生长期，培养 72 h 后均进入衰亡期。这一实验结果说明，此次诱变处理对菌株的生长基本没有影响。2.3 DZY6715 野生菌株和突变菌株的生物膜形成能力DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生物膜形态如图 3 所示，其在培养不同时间后的生物膜生产量见表 2，而其生物膜生产量随着培养时间的延长而变化的趋势如图 4 所示。由图 3 可知，DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株均能形成生物膜，但是，不同菌株之间生物膜的生长速度和结构强度均有显著差异，与 DZY6715 野生菌株相比，3 株突变菌株的生物膜结构均更加松散。由图95第 41 卷经 济 林 研 究4 可知，DZY6715 野生菌株的生物膜生产量，培养 0 24 h 快速增长，培养 24 96 h 趋于稳定，培养 96 120 h 却逐渐下降；除培养 120 h 的生物膜生产量外，其余各个培养时间点的生物膜生产量均显著高于 3 株突变菌株的。-4 号突变菌株的生物膜生产量，培养 0 48 h 逐渐增长，培养48 72 h 趋于稳定，培养 72 120 h 却逐渐下降，培养 24 h 后其生物膜生产量低于其他突变菌株 的；15 号突变菌株的生物膜生产量，培养 0 24 h 快 速 增 长，培 养 24 72 h 趋 于 稳 定，培 养72 120 h 却逐渐下降；21 号突变菌株的生物膜生产量，培养 0 48 h 逐渐增长，培养 48 96 h趋于稳定，培养96120 h却逐渐下降。总体而言，4 株菌株的生物膜生产量均呈现出“先上升然后趋于稳定最后下降”的变化趋势。DZY6715 野生菌株生物膜的生长最快，其生产量也最高，其生物膜的形成能力最强；而-4 号突变菌株与其相差最大，其生物膜形成能力最差。图 2 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生长曲线Fig.2 Growth curves of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains图 3 培养不同时间后 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生物膜形态Fig.3 Biofilm morphology of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains after different incubation time96第 2 期董奎奎，等：芽孢杆菌 DZY6715 生物膜形成对其抗油茶炭疽病的影响图 4 培养不同时间后 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株 的生物膜生产量Fig.4 Biofilm production of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains after different incubation time2.4 DZY6715 野生菌株和突变菌株的群游能力DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株在培养不同时间后的群游能力如图 5 所示。由图 5 可知，DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株均能发生群游，但是，不同菌株的群游能力有显著差异。培养 0 6 h，4 株菌株均处于粘附阶段，皆未发生群游；培养 6 h 18 h，4 株菌均发生群游，其中，DZY6715 野生菌株生长扩展的速度最快，-4 号突变菌株生长扩展的速度最慢，3 株突变菌株的群游直径皆远小于野生菌株的群游直径。总体而言，DZY6715 野生菌株的群游能力明显强于 3 株突变菌株的，尤其强于-4 号突变菌株的，这一现象可能与其鞭毛运动能力有关。由此推测，与 3 株突变菌株相比，DZY6715 野生菌株生物膜的形成能力更强，其鞭毛运动能力也更强，故其群游能力更强。2.5 DZY6715 野生菌株和突变菌株的抑菌能力1）DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株在培养第 10 天的体外抑菌结果分别如图 6 与图 7 所示。DZY6715 野生菌株和-4、15、21 号突变菌株对果生炭疽病菌均有较强的抑制效果（图 6），其抑菌率分别为 66.00%与 57.00%、63.00%、60.00%（图 7）。总体而言，DZY6715 野生菌株的抑菌率最高，显著高于-4 和 21 号突变菌株的；15 号突变菌株的抑菌率低于 DZY6715 野生菌株的，但两者间的差异不显著；而-4 号突变菌株的抑菌率最低。2）DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株回接油茶离体叶片第 10 天其对油茶炭疽病的抑菌效果如图 8 所示，而回接第 7、第 10 天其发病率和病情指数见表 3。由图 8 可知，处理 1 5 的各组叶片在整个实验周期均未发病，说明 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株均不致病。由表 3 可知，回接后第 7 天，处理 7 油茶叶片的发病率（20.22%）与病情指数（5.55）均最低，均显著低于其余各处理组的；处理 6 和处理 8 两组油茶叶片的发病率均为 100%，均显著高于其余各处理组的，处理 6 和处理 8 油茶叶片的病情指数分别为 30.55 与27.78，也均高于其余各处理组的。回接后第 10 天，续图 3Continuation of Fig.3表 2 培养不同时间后 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生物膜生产量 Table 2 Biofilm production of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains after different incubation time mL 菌株编号Strain No.培养不同时间后的生物膜生产量 Biofilm production after different times of incubation3 h6 h9 h12 h24 h48 h72 h96 h120 hDZY67150.65 a2.60 a2.65 a5.16 a13.99 a14.89 a14.64 a14.99 a9.32 b-40.29 c1.38 c1.92 c3.10 b6.06 c13.16 d12.40 d9.86 c8.49 d150.40 b1.44 b2.46 b2.85 c11.02 b13.27 c13.00 c9.73 d8.68 c210.12 d0.95 d1.37 d2.21 d3.84 d13.91 b13.91 b13.33 b9.36 a 同列数据后的不同小写字母表示不同菌株之间生物膜生产量的差异显著（P 0.05）。Different lowercase letters following the same column of data indicate significant difference in biofilm production between strains(P 0.05).97第 41 卷经 济 林 研 究处理 6 10 各组油茶叶片的发病率均为 100%；处理 7 油茶叶片的病情指数（30.55）最低，处理9 和处理 10 油茶叶片的病情指数分别为 33.33 与36.11，处理 7 和处理 9、处理 10 之间其病情指数的差异均不明显，但其病情指数均显著低于处理 6（其病情指数为 50.00）和处理 8（其病情指数为47.22）。总体而言，处理 8 的油茶叶片的病情指数仅次于处理 6 的，这表明 4 株菌株中只有-4 号突变菌株对油茶炭疽病的生防效果最差。图 5 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株在培养不同时间后的群游能力Fig.5 Swarming capacity of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains after different incubation time图 6 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株对炭疽病菌的抑制效果Fig.6 Antagonistic activity of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains against C.fructicola2.6 DZY6715 野生菌株和突变菌株抑制炭疽病菌的微观形态实验结果表明，-4 号突变菌株的生物膜形成能力及其对油茶炭疽病菌的抑制效果均显著低于DZY6715 野生菌株的，因此选取-4 号突变菌株，利用扫描电镜从微观上观察比较其与 DZY6715 野生菌株对炭疽病菌菌丝的破坏能力，观察结果如图 9 所示。由图 9A 可知，正常生长的炭疽病菌菌丝表面光滑，形态结构完整，厚薄均匀；由图9B 可知，被 DZY6715 野生菌株抑制的炭疽病菌菌丝受损严重，表面粗糙且有内含物渗漏；由图9C 可知，被-4 号突变菌株抑制的炭疽病菌菌丝表98第 2 期董奎奎，等：芽孢杆菌 DZY6715 生物膜形成对其抗油茶炭疽病的影响面也较为光滑，菌丝表面轻微受损。总体而言，DZY6715 野生菌株和-4 号突变菌株对油茶炭疽病菌菌丝均有破坏作用，但是，DZY6715 野生菌株对炭疽病菌菌丝的破坏能力更强，显著强于-4 号突变菌株对其的破坏能力。柱状图上的不同小写字母表示不同菌株间抑菌率的差异显著（P 0.05）。Different lowercase letters on the bar graph indicate significant differences in inhibition rate between strains(P 0.05).图 7 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株对炭疽病菌的 抑菌率Fig.7 The inhibition rate of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains against C.fructicola3 讨论与结论3.1 讨 论目前，在林业病害防治中，微生物防治技术得到广泛应用，芽孢杆菌已被确定为一种重要的生物防治细菌。有关研究者发现，芽孢杆菌的生物膜在微生物防治过程中发挥着重要作用24。为了进一步探究内生芽孢杆菌 DZY6715 生物膜的形成对其防治油茶炭疽病的影响情况，本研究以前期分离自油茶健康叶片的内生芽孢杆菌 DZY6715为出发菌株，对其进行化学诱变，根据生物膜形态，从诱变菌株中筛选出 3 株生物膜存在缺陷的突变菌株，其编号分别为-4、15 和 21，然后测定DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株的生物膜相关特性：生长曲线、生物膜形成能力和群游能力等。结果发现，3 株突变菌株和 DZY6715 野生菌株的生长趋势基本一致。在生长状况一致的情况下，细菌的群游能力主要受到细菌自身鞭毛运动能力的影响25，群游能力越强，细菌汇聚越快，生物膜形成也就越快，3 株突变菌株的群游能力和生物膜形成能力较 DZY6715 野生菌株的都差，这与Zhu 等26的研究结果一致。图 8 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株回接油茶离体叶片第 10 天其对油茶炭疽病的抑制效果Fig.8 Inhibition effect of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains against anthracnose on detached leaves of C.oleifera after tie-back 10 day芽孢杆菌对植物病害的生防效果与其本身生物膜形成能力呈正相关。Chen 等27研究了枯草芽孢杆菌对番茄青枯病的防治效果与其生物膜形成的关系，结果发现，生物膜形成存在缺陷的突变菌株其生物防治效果显著下降，而生物膜形成能力强的突变菌株其生物防治效果显著提高。研究中发现，DZY6715 野生菌株与 3 株生物膜存在缺陷的突变菌株对油茶炭疽病菌的抑制能力也随着生物膜形成能力的降低而降低，而且扫描电镜观察结果也表明，DZY6715 野生菌株对油茶炭疽病菌菌丝的破坏力更强，能使菌丝内含物严重渗漏。Zhou 等28研究发现，枯草芽孢杆菌野生菌株Bs916 对水稻纹枯病病原菌具有较高的抗菌活性和较好的生防效果，而生物膜存在缺陷的突变菌株99第 41 卷经 济 林 研 究基本没有抗菌活性，不能有效防治水稻纹枯病。此外，Haggag 等29研究发现，平板对峙实验的抑菌结果，除了与菌株本身的特性有关外，还会受到培养基种类和培养温度的影响。本研究在平板对峙实验的基础上，通过回接油茶离体叶片实验，进一步比较了 DZY6715 野生菌株与 3 株生物膜存在缺陷的突变菌株对油茶炭疽病的防治效果，结果发现，两者在防效上表现出显著差异，以突变菌株处理的油茶叶片其发病率和病情指数均显著高于以 DZY6715 野生菌株处理的，说明其抗病能力较弱。Haggag 等29比较了两株多粘类芽孢杆菌对花生冠腐病的防治能力及其生物膜形成能力，结果发现，以生物膜形成能力较强的多粘类芽孢杆菌处理过的花生种子，其幼苗在生长过程中花生冠腐病的发病率更低，这表明生物膜形成能力较强的多粘类芽孢杆菌对花生冠腐病的防治效果更好。Yang 等30研究发现，枯草芽孢杆菌 1JN2的生物膜形成能力减弱后，经其处理的番茄感染番茄青枯病后其病情指数增大，这表明枯草芽孢杆菌 1JN2 生物膜形成能力的降低使其对番茄青枯病的防治效果也显著降低。综上所述，内生芽孢杆菌 DZY6715 生物膜的形成有助于提高其对油茶炭疽病的生物防治效果。该研究结果可为内生芽孢杆菌 DZY6715 在油茶田间的应用提供理论依据。但是，本研究主要从宏观角度验证了生防菌DZY6715 的生物膜形成能力对其生防效果的影响情况，而对于生防菌 DZY6715 生物膜的形成机制及其对病原菌的抑制机理尚缺乏深入研究。因此，在分子水平上进一步探索生防菌生物膜形成与其发挥生防作用的关系将是今后相关研究的主攻 方向。表 3 DZY6715 野生菌株和 3 株突变菌株回接离体油茶叶片不同天数的发病率和病情指数Table 3 Incidence and disease index of DZY6715 wild strain and 3 mutant strains against anthracnose on detached leaves of C.oleifera after tie-back different days处理编号Treatm