长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响.pdf

第 卷第 期黑 龙 江 大 学 工 程 学 报 年 月 .:/长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响朱高强 王庆贵 闫国永 邢亚娟(.黑龙江大学 现代农业与生态环境学院 哈尔滨 .曲阜师范大学 生命科学学院 山东 曲阜)摘 要:植物病原菌在生态系统功能中发挥重要作用 但在全球变化背景下 长期氮沉降如何影响植物病原菌群落尚未得到充分研究 因此 在大兴安岭兴安落叶松林进行了原位氮添加试验 共设置了 个氮添加梯度 年 月 采集了土壤、植物根系和叶片样品 利用 和 测序技术 探讨氮添加对土壤和植物共生病原菌群落的影响及其潜在机制结果表明:氮添加显著增加了叶片细菌和真菌病原菌多样性 降低了土壤细菌病原菌多样性氮添加引起根际和根系内生真菌病原菌群落结构发生了显著变化 但未显著改变土壤、根系和叶片细菌病原菌群落结构 冗余分析表明 土壤、和 是影响土壤和植物细菌和真菌病原菌群落结构的重要环境因子 基于上述 氮添加可能通过改变土壤性质 进而影响土壤和植物病原菌群落结构关键词:氮沉降 病原菌 针叶林 多样性 群落结构中图分类号:文献标志码:文章编号:()收稿日期:修订日期:基金项目:国家自然科学基金项目()作者简介:朱高强()男 硕士研究生 研究方向:森林生态学:通信作者:邢亚娟()女 教授 博士 博士研究生导师 研究方向:森林生态学:引文格式:朱高强 王庆贵 闫国永 等.长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响.黑龙江大学工程学报():.引 言随着工业化、城市化以及农业生产的快速发展 人们对化石燃料的过度燃烧、化肥的过度使用以及汽车尾气的过量排放 导致氮沉降显著增加 据预测 氮沉降的速率到 年可能比目前水平要高 倍左右 近年 随着经济的快速发展 我国氮沉降水平从 世纪 年代的 上升到本世纪初的 成为全球主要氮沉降区域之一 在陆地生态系统中 适量氮沉降可促进植物生长(尤其在土壤氮匮乏的区域)但长期或过量的氮沉降可引起诸多生态后果 例如氮沉降能够提高植物可利用氮素 促进优势植物优势类群和提升郁闭度 导致稀有类群植被的灭亡 氮沉降也能够通过改变土壤环境影响微生物的比例 进而改变植物和微生物的相互作用植物病原菌(病原细菌和真菌)作为微生物自然群落中的一部分 在对植物的生理特性和生产以及植物群落构建中发挥着系列效应 例如 植物病原菌可以侵入植物叶内抑制氮素的运输和吸收 造成寄主植物的光合能力减弱和存活率下降 另外 定植于植物根系内部的植物病原菌可利用活的根组织获取营养物质 导致根系形态发生改变 再者 植物病原菌还通过抑制植物根系分泌物减弱植物益生菌向植物根系聚集 降低植物的防御能力 导致植物生物多样性下降 先前研究表明 氮添加可通过改变土壤性质 影响土壤真菌多样性 增加植物真菌病原菌的相对丰度 等在亚热带森林生态系统研究发现 外源氮可以通过改变土壤环境因子 显著增加植株对病原菌感染的抵抗力 氮添加也可以通过改变自然植物群落结构 加剧病原菌的发生和传播 增强寄主植物的抗性来降低疾病侵染程度 在农田生态系统 有研究表明施氮能抑制土壤病原菌的多样性 并且病原菌多样性的变化和施氮水平显著相关 目前大多数关于氮沉降对植物微生物病原菌群落影响的研究多聚焦于农田、高寒草甸以及草原等生态系统中 然而 氮沉降对森林生态系统土壤和植物病原菌群落结构影响的研究仍不充分北方森林()占据了全球陆森林面积的 在调节全球碳氮平衡和减缓大气中温室气体浓度上升方面发挥着重要作用 大兴安岭地区是我国北方森林分布的主要区域 氮沉降增加能够提高该地区氮的可利用性 缓解该区域的氮限制 提高植物生产力 由于细菌和真菌病原菌侵染植物的方式和氮利用效率不同 植物病原菌多样性和群落结构对于氮沉降的响应可能比较复杂 基于此 在大兴安岭兴安落叶松林内进行了氮添加试验来探究植物病原菌多样性和群落结构对氮沉降的响应 有助于全面了解和准确预测氮沉降对北方森林生态系统功能的影响 由于植物根和叶生理生态功能不同 假设植物叶和根以及土壤致病菌群落结构和多样性对氮添加的响应不同 材料和方法 研究区概况本研究样地位于黑龙江省大兴安岭东北坡林区 地处伊勒呼里山南麓的松岭区境内的南翁河国家级自然保护区()该地区气候属于典型的寒温带大陆性气候 受西伯利亚寒流的影响 冬季异常寒冷和漫长 夏季温暖和短暂 年有效积温为 年日照时数约为 年平均降水量约为 其中 聚集于 月 在研究样地内 兴安落叶松()是主要乔木层树种 伴生有少量白桦()平均林密度为 株 平均胸径为 土层分为 砂壤土和 砂砾土 样地设置 年 月 随机建立了 个 样方 每两个小样方之间至少有 缓冲带隔开 以避免氮肥对地块之间的相互干扰 以往监测数据显示 中国北方地区氮沉降速率为 共设置了 个氮添加水平处理 即低氮()中氮()、高氮()和对照处理(不施氮)每块样地 次重复()氮添加处理以 作为氮肥 每年的 月中旬(生长季节)进行施氮处理 施肥前需将硝酸铵溶解于 的纯净水中 利用肩背式喷雾器将硝酸铵溶液均匀地喷洒于样地表面 对照样地喷洒等量的纯净水以排除水分差异影响 样品采集 年 月进行土壤、根系和叶片样品采集 在每个样方内 随机选取 棵长势一致、成年的兴安落叶松 使用高枝剪对每棵兴安落叶松冠层的 个层面(上、中、下)和 个方向(东、西、南、北)进行取样 相同树的样品装入 离心管 对采集叶片的树木进行根系采集 去除土壤表层凋落物和地表杂质 顺着主根找到着生于侧根上的细根(直径)将细根装入 离心管 在原有细根采集点用不锈钢土钻采集根际土壤样品(土层)放入标记好的自封袋中 所有样品 放入干冰中 冷藏运回实验室备用 实验方法 土壤理化性质测定方法 将取回的土样去除杂质后于室内自然风干 用研钵研磨并过 目筛备用 测定方法为:土壤 值黑 龙 江 大 学 工 程 学 报 第 卷采用电位法测定 和 采用干烧法测定 采用浓 消煮凯士定氮法测定 含量采用硫酸高氯酸酸溶钼锑抗比色法测定 和 含量采用氯仿熏蒸浸提法测定 土壤 和 含量采用浸提法测定 按照水土比例 将 鲜土加入 的 浸提液中转速设置到 震荡 过滤后取上清液用流动分析仪测定 微生物提取和测定方法首先用无菌棉签小心去除植物表面大部分附着物 将叶片和根系用无菌水洗净后进行表面消毒 具体步骤为:用无菌水清洗 把植物样品分别放入酒精和 氯酸钠溶液浸泡 再用酒精浸泡 取出用无菌水清洗 次 使用无菌研钵对处理后植物样本进行研磨 放入 冰箱备用采用 聚合酶 扩增细菌 基因 可变区引物和真菌 基因 内转录间隔区引物 第一轮扩增 控制为 个扩增循环数 以保持样本的一致性 同时设置阴性对照 以检测环境和试剂是否被污染 第二轮扩增 依照初次 扩增为模板进行扩增 以获取连接完整的目的片段 扩增结束后 进行琼脂糖电泳、纯化和高通量测序 生物信息数据筛选方法测序的原始离线数据用 格式保存 使用 工具对原始离线数据切割引物 采用 方法 在 分析平台调用 进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体处理序列 重新生成新的非单列扩增特征序列 利用扩增细菌 基因和真菌 基因分别各获取不同测试数据 重新抽平 数据表 通过线上数据库 原核分类群功能注释和真菌功能注释的数据库进行初步筛选和比对 最终得到植物病原菌数据 统计分析利用 软件进行 检验和 检验分析数据的正态性和方差齐性 采用单因素方差分析(检验)检测氮沉降对土壤性质的影响 采用 距离的非度量多维标度()方法分析氮添加对细菌和真菌病原菌群落机构的影响 用 评估不同氮添加水平的群落结构是否具有显著差异 通过冗余分析()检验影响土壤、根系和叶细菌和真菌病原菌群落结构的土壤因子 试 验 不同氮处理对土壤理化性质的影响土壤理化性质对不同施氮处理存在不同响应(表)与对照相比、处理下土壤 值显著降低()而土壤 显著增加()在 和 处理下 显著增加()而 在 处理下显著降低()处理下土壤微生物氮()显著增加()不同氮处理对植物病原菌多样性的影响与 相比 和 处理下叶片细菌病原菌多样性 显著增加()而 处理下无显著差异(图()在根系中 细菌病原菌多样性随氮水平的增加呈上升趋势 但不同氮水平处理间却无显著差异(图()与此相反 根际土壤中的细菌病原菌多样性随氮水平的增加呈下降趋势 且不同氮处理间无显著差异(图()与 相比 叶片真菌病原菌多样性在 和 处理中均显著增加 且随氮水平的增加呈上升趋势(图()根际和根系真菌病原菌的多样性在不同氮处理下无显著变化 但其随氮水平的增加呈上升趋势(图()、()第 期 朱高强 等.长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响表 土壤理化性质对氮添加的响应 /()./()./()./()./()./()./()./().注:对照组()低氮组()中氮组()高氮组()数值为平均值(标准差)()不同小写字母表示不同氮处理之间的显著差异()图 氮添加对土壤和植物细菌和真菌病原菌多样性的影响 注:、分别代表细菌和真菌()、()代表土壤细菌和真菌多样性指数()、()代表根系细菌和真菌多样性指数()、()叶片细菌和真菌多样性指数、分别代表对照组、低氮组、中氮组、高氮组 点代表不同的处理方式()显著性水平为 显著性水平为 黑 龙 江 大 学 工 程 学 报 第 卷 不同氮处理对植物病原菌群落结构的影响不同氮添加对根际土壤和根系以及叶片属水平相对丰度的变化趋势见图 在细菌的相对丰度中 与 相比 土壤和叶片假单胞菌属()随氮添加的增加呈下降趋势 而在根系中随氮梯度先升高后降低再升高的趋势 且 处理的相对丰度呈最高趋势 在叶片细菌中 鞘氨醇单胞菌属()和雷尔氏菌属()对氮添加的响应趋势相同 随氮添加的增加呈上升趋势 在土壤中的欧文氏菌属()随氮添加的增加呈上升趋势 并且叶片中的欧文氏菌属()的相对丰度趋势与土壤细菌的相对丰度呈相反趋势(图()在真菌的相对丰度中 与 相比 灵芝属()在土壤和根系中的相对丰度随氮添加的增加呈下降趋势 并且与叶片的相对丰度呈相反的趋势 叠孢属()的相对丰度 在叶片中随氮添加呈先升高后降低再升高的趋势 且 处理的相对丰度呈最高趋势 球腔菌属()的相对丰度随氮添加整体呈下降趋势(图()图 氮添加对土壤和植物细菌和真菌病原菌属水平上的影响 注:()、()分别代表的是属水平 植物病原细菌和真菌的平均相对丰度()()代表细菌的缩写 代表真菌的缩写第 期 朱高强 等.长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响 土壤、根系和叶片细菌与真菌病原菌非度量多维度()的应力系数()值均小于 因此 分析的结果能够准确反映样品之间的差异程度(图)根据 检验 土壤和根系真菌病原菌群落结构均发生了显著变化()而细菌病原菌群落结构均没有发生变化()叶片细菌和真菌病原菌均未发生显著变化 根据 检验结果显示(表)在土壤和根系中 与 相比 和 处理下真菌病原菌群落结构差异显著()而 处理下真菌病原群落结构差异不明显()图 氮添加对土壤和植物细菌和真菌病原菌群落结构的影响 注:、分别代表细菌和真菌、分别代表对照组、低氮组、中氮组、高氮组 病原菌和土壤环境因子的关系在土壤、根系和叶片细菌和真菌病原菌群落中、和 个土壤环境因子的箭头较长 说明对病原细菌和真菌群落结构的解释量较大 且与第一轴的夹角最小 是第一轴的主要影响因子 也是影响病原细菌和真菌群落结构的主要因素(图)通过蒙特卡罗置换检验可知 影响根际土壤、根系和叶内细菌和真菌病原菌群落结构的重要因素有、(表 )而 与土壤病原细菌有显著相关性()黑 龙 江 大 学 工 程 学 报 第 卷表 检验结果比较了不同氮处理下细菌和真菌病原菌群落的相似性 注:结果的结果显示 值越接近 组间差异越大于组内差异 具有显著性 检验结果显示 值代表分组因素对样品差异的解释度 越大表示分组因素解释度越高 表示影响显著、分别对照组、低氮组、中氮组、高氮组 结果与讨论 氮添加对植物病原菌多样性的影响研究结果表明 长期的氮添加导致北方森林针叶植物细菌和真菌病原菌多样性显著增加 与前期的研究结果一致 研究结果表明 在长期模拟氮沉降的处理下 氮添加显著增加了加拿大北方森林根系病原菌的多样性 在群落水平上 长期的氮添加可能通过提高易患病的亲硝植物的主导性 来增加病原菌的多样性 本次实验中 发现长期氮添加导致土壤中硝态氮显著增加(表)进而提高了土壤中植物可利用氮的含量 可能促进植物病原菌相关的类群的生长 结果也证实了上述结论 例如固氮相关的 相对丰度随着施氮水平的增加而上升(图)土壤细菌病原菌多样性随氮添加水平的增加呈下降趋势 而土壤真菌病原菌多样性呈上升趋势(图)先前研究证实 土壤 是造成土壤微生物多样性、群落结构改变以及影响植物病原菌存活的重要环境因子 在本研究中 发现氮添加导致土壤 显著降低(表)首先 较低 环境通常不利于土壤细菌类群 而有利于土壤真菌类群的生长 酸性环境能够改变土壤微生物群结构 导致土壤环境第 期 朱高强 等.长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响图 土壤理化因子与病原菌群落结构的相关性 注:、分别代表细菌和真菌()、()分别为土壤细菌和真菌群落结构(属水平)与土壤理化因子的 ()、()分别为根系细菌和真菌群落结构(属水平)与土壤理化因子的 ()、()分别为叶片细菌和真菌群落结构与土壤理化因子的 分别代表对照组、低氮组、中氮组、高氮组()中有益菌和病原菌比例失调 因此 氮添加导致的土壤酸化可能抑制根际土壤细菌病原菌多样性 而促进根际土壤真菌病原菌多样性 氮添加对植物病原菌群落的影响 处理对土壤细菌病原菌群落结构产生了显著影响(表)与先前的研究结果相似 长期施氮引起土壤硝态氮含量的变化是造成土壤细菌群落结构发生改变的有效土壤环境因子 在本试验中、等养分指标显著影响根际土壤病原细菌群落结构 另外 研究结果发现低水平氮添加能够影响细菌病原菌类群 而 和 没有影响 表明土壤微生物群落结构和功能对于氮添加水平的响应存在着阈值效应 过量的氮添加将增加细菌微生物群落对土壤环境因子的抵抗力 从而抵消对氮添加响应的胁迫 因此随着施氮水平升高 根际土壤病原细菌类群趋于稳定在土壤和根系真菌病原菌中 和 水平下群落结构均发生显著改变 且 处理下群落结构变化比 水平更加明显(表)正如“氮病假说”所提出一样 氮添加可有效增加病原菌的易感性 因为土壤氮有效性越大导致植物组织氮含量越高 而且氮又是病原真菌的限制元素 当氮变得丰富时 真菌菌丝利用充足的氮进行自身的生长和适合度的调整 促进了真菌病原菌群落生长和定殖 当真菌病原菌长期定殖于植物体内时 造成植物不同程度的病害 例如 日本落叶松球腔菌()的菌丝随病叶调落 翌年以形成的大量孢子侵染落叶松叶片 起初叶尖端出现黄色小斑点 逐渐扩展为红褐色斑 后期全针叶变成红褐色 最后使植株生长衰弱甚至枯死黑 龙 江 大 学 工 程 学 报 第 卷表 环境因子与病原菌群落结构的相关性 ()()注:利用 分析环境因素对样品差异的显著性分析 经过显著性检验的环境变量被列出 分别代表总磷、总碳、有机碳、总氮、微生物碳、微生物氮、铵态氮、硝态氮 显著性水平为 显著性水平为 显著性水平为 结 论通过对兴安落叶松林土壤、根系和叶片病原菌群落对氮添加响应的研究 得出结论:氮添加抑制了根际土壤病原细菌多样性指数 促进了根系和叶片细菌与真菌病原菌多样性以及土壤真菌病原菌多样性 氮添加对土壤和根系真菌病原菌群落结构有显著影响 土壤、硝态氮、微生物氮是影响细菌和真菌病原菌群落变化的关键环境因子 基于上述 氮添加可能会通过改变兴安落叶松林病原菌群落结构和多样性 进而对生态系统功能产生一定的影响 但现阶段对于其机制和影响强度仍不了解 需要后续进一步研究参考文献:.():.:.():.第 期 朱高强 等.长期氮添加对兴安落叶松林植物病原菌群落结构的影响 .():.():.:.():.():.():.孙赫奕 闫国庆 邢亚娟 等.大兴安岭不同演替阶段土壤呼吸及其组分的动态.黑龙江大学工程学报():.吴林坤 林向民 林文雄.根系分泌物介导下植物土壤微生物互作关系研究进展与展望.植物生态学报():.():.董艳 杨智仙 董坤 等.施氮水平对蚕豆枯萎病和根际微生物代谢功能多样性的影响.应用生态学报():.张喜娟 陈琛 郜飞飞 等.中国东北兴安落叶松林空间分布及其对气候变化的响应.生态学杂志 ():.():.():.():.():.():.刘蔚秋 刘滨扬 王江 等.不同环境条件下土壤微生物对模拟大气氮沉降的响应.生态学报 ():.张健 董星晨 张鹤 等.长期施氮对马铃薯田土壤剖面硝态氮积累及细菌群落结构的影响.甘肃农业大学学报:.():.():.:.():.侯攻科 辛恒 李永刚 等.落叶松落叶病的发生规律与防治技术.农业科技与信息():.黑 龙 江 大 学 工 程 学 报 第 卷 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