DB1301_T295-2018水貂种群阿留申病对流免疫电泳检测操作规程.pdf

ICS 11.220 B 41 DB1301 石家庄市地方标准 DB 1301/T 2952018 水貂种群阿留申病对流免疫电泳检测 操作规程 2018-07-31 发布 2018-08-20 实施 石家庄市质量技术监督局 发 布 DB1301/T 2952018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由石家庄市藁城区质量技术监督局提出。本标准起草单位：石家庄市藁城区华泽畜牧业发展有限公司、石家庄市农林科学研究院。本标准主要起草人：刘洁、任二军、刘进军、李伟、韩学良、荣敏、周建颖、周俊会、邢立民。DB1301/T 2952018 1 水貂种群阿留申病对流免疫电泳检测操作规程 1 范围 本标准规定了水貂种群阿留申病的检测时间及对流免疫电泳检测方法。本标准适用于石家庄市水貂养殖场水貂阿留申病的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 2847-2011 水貂阿留申病检疫技术规范 DB13/T 717-2005 水貂饲养管理技术规程 DB1301/T 238-2017 水貂阿留申病碘凝集试验操作规程 3 检测时间 检测时间按表1进行。表1 检测时间和检测种群 检测次序 检测时间 检测种群 第1次 分窝初选时 留种母貂 第2次 9月份复选时 留种水貂 第3次 11月份终选时 留种水貂 第4次 翌年2月份配种前 留种水貂 第5次 配种结束后 留种公貂 4 血样采集 按照DB1301/T 238-2017中3.2的规定执行。5 对流免疫电泳检测 5.1 材料准备 5.1.1 仪器 电压和电流分别为5V600V和4mA600mA的电泳仪、宽度25cm的电泳槽、分析天平、PH计。5.1.2 设备 DB1301/T 2952018 2 微波炉、100mm100mm2mm的玻璃板、直径3mm的打孔器、10uL加样器、50mL塑料刻度试管、50mL量筒、1000mL量筒、150mL三角瓶、1000mL烧杯、10cm10cm的双层医用纱布、医用砂轮、胶头滴管、镊子、10uL枪头、水平尺、玻璃板支架。5.1.3 试剂 水貂阿留申病诊断抗原、标准阳性血清、浓盐酸、琼脂糖（分析纯）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、巴比妥、巴比妥钠、三级水。5.2 试剂配制 5.2.1 电泳缓冲液 电泳缓冲液成分及用量见表2。表2 电泳缓冲液成分及用量 成分 用量 三羟甲基氨基甲烷 2.408g 巴比妥 1.024g 巴比妥钠 4.064g 三级水 500mL 将各成分放入1000mL烧杯中加热溶解，冷却后用浓盐酸调节pH至8.48.6，4冰箱保存，使用前平衡至室温。5.2.2 1%的琼脂糖 称取1g琼脂糖，加入100mL电泳缓冲液，微波炉加热融化。5.3 操作步骤 5.3.1 琼脂糖凝胶板的制备 取玻璃板，放于调平后的玻璃板支架上，用塑料刻度试管量取30mL已融化并冷却到6070的琼脂糖，均匀倒在玻璃板上，待凝固后打孔，现用现制备。5.3.2 打孔 5.3.2.1 打孔模型纸的制作 打孔模型纸按照SN/T 2847-2011附录B图B.2制作，外面宜封一层透明的硬塑料膜。5.3.2.2 打孔 将模型纸平铺在桌面，凝胶板放于模型纸上，用凝胶打孔器按模型纸打孔，配对的抗原、样品孔同时打孔，挑出孔内的琼脂糖。5.3.3 加样 将毛细管用医用砂轮轻划，用手掰断毛细管，将样品按顺序逐份加到样品孔内（左侧），加满为止；用10 L的移液器将抗原加到另一列抗原孔内（右侧）。每块板在左下角设一个阳性血清对照。DB1301/T 2952018 3 5.3.4 电泳 5.3.4.1 凝胶板放置 加样完毕，将凝胶板放在电泳槽架上，样品孔在阳极，抗原孔在阴极，将用电泳液浸泡过的双层纱布搭在凝胶板边缘的凝胶上，另一侧浸泡在电泳液中，用胶头滴管在凝胶上的纱布滴少量电泳缓冲液，用镊子轻轻压平。5.3.4.2 更换缓冲液 电泳槽内注入电泳缓冲液，每检测一批弃掉部分缓冲液，同时添加等量的新缓冲液，将电泳槽的一侧稍抬高，然后放平，反复23次，使分隔在三个独立槽中的缓冲液混合均匀。5.3.4.3 设置电压 调整电压至90V100V，电压稳定后，电泳30min60min。5.3.5 结果判定 电泳结束，取出凝胶板，在辅助光源下观察结果。在阳性对照成立的情况下，抗原孔和样品孔之间形成一条直的或稍弯曲的沉淀线，即判定阳性，记录为“+”。没有沉淀线为阴性，记录为“-”。5.3.6 记录 记录内容包括凝胶板编号、样品编号、检测结果、检测日期、检测人等，记录表格参见附录A。DB1301/T 2952018 4 附 录 A（资料性附录）水貂阿留申病对流免疫电泳检测记录表 表A.1给出了水貂阿留病申对流免疫电泳检测记录的内容。表A.1 水貂阿留申病对流免疫电泳检测记录表 凝胶板编号 样品编号 检测结果 样品编号 检测结果 样品编号 检测结果 样品编号 检测结果 阳性对照 检测人：日期：