稳定表达CD19的非小细胞肺癌细胞系的构建_朱帅旗.pdf

第 卷第期湖北工业大学学报 年 月 收稿日期 第一作者朱帅旗（），男，河南商丘人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为生物工程 通信作者刘滨磊（），男，湖北武汉人，湖北工业大学教授，研究方向为生物制药 文章编号 （）稳定表达 的非小细胞肺癌细胞系的构建朱帅旗，张帆，詹思建，段海潇，王迪，胡翰，汪洋，刘滨磊（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 ）摘要细胞系表达的 可被靶向 的嵌合抗原受体（）特异性识别。为探究靶向 抗肿瘤疗效及机制提供可靠稳定的靶细胞系，运用 脂质体转染法将 和 质粒转入 细胞。嘌呤霉素（）筛选，稳定细胞株 单克隆细胞由有限稀释法得到；鉴定 细胞系中 的表达；流式细胞术检测 中 的表达；法比较改造前后细胞系的生长活性变化。经 抗性筛选和挑取单克隆，得到个 单克隆细胞；鉴定 细胞系均有 高表达；流式检测单克隆细胞系阳性率均达到；法检测发现 细胞系与亲本细胞 细胞具有一致的生长活性。运用 转座系统构建稳定表达 的 细胞系成功，为评估靶向 实体瘤 疗效提供靶细胞，奠定 细胞抗实体瘤疗效机制研究基础。关键词 细胞；绿色荧光蛋白 中图分类号 文献标识码人 是由胞外末端、跨膜结构域与胞内末端组成的跨膜糖蛋白，其大小为 ，在多数细胞中极其保守，但在多数慢性和急性淋巴细胞白血病及细胞淋巴瘤中过表达。作为关键标记物已被用于白血病、淋巴瘤及免疫疾病的诊断预后评判指标，也为治疗这些疾病提供了靶点。多个靶向 的双特异性抗体与 细胞免疫疗法已在临床试验中取得进展，临床实验也证实其良好的疗效，但其在实体瘤组织中的疗效研究较少。据 等报道，抗实体瘤具有可 行 性。此 外，等 人 发 现 在肺癌模型中具有优异的抗肿瘤活性。新英格兰杂志报道了 细胞疗法治疗恶性胶质瘤晚期患者案例，经多次输注 细胞后，患者病症得到完全缓解，这启示了 疗法在实体瘤具有可行性。限于 大多表达在血液淋巴瘤，而淋巴瘤细胞多存在于病人血液内，为研究 的抗肿瘤机制带来了不便。而实体瘤细胞具有体外易培养与体内易成瘤的特点，便于评估 抗实体瘤疗效机制。人非小细胞肺癌 细胞系作为常用肿瘤研究细胞模型，在肺癌研究中最具代表性，因此本研究拟构建稳定表达 的 细胞系以便于后续 抗实体瘤疗效机制研究。此外，用于构建稳转细胞系的常见载体有慢病毒载体和转座子载体，本研究采用的是实验室前期开发的 转座质粒系统。本研究使用带有 基因的转座质粒和表达转座酶的质粒，将带有 基因的转座序列转座至 细胞染色体 上，实 现 细 胞 稳 转。此 外，绿 色 荧 光 蛋 白（，）具有探针的特性，作为报告基因标记特定分子或细胞为科学研究提供极大便利。在本研究中，作为荧光标记，在细胞系筛选、单克隆挑选等步骤起重要作用。本研究构建稳定表达 的 细胞系，旨在为评估靶向 实体瘤 疗效机制提供理想靶细胞模型。实验材料从北京协和医院细胞中心获得 细胞；用（，）培养 细胞；于浙江天杭生物购买 。从 购买 转染试剂盒；重组质粒和 （）转座酶质粒由本实验室改造并保 存。无 内 毒 素 质 粒 小 提 中 量 试 剂 盒 购 于 公司。嘌呤霉素（）与 分别购于碧云天生物和 公司；大肠杆菌 感受态由本团队自主制备。抽提和 逆转录试 剂 盒 于 和 购 买，荧光染料于 公司购买。抗体于 公司购买。流式细胞检测仪（）；体 视 荧 光 显 微 镜（公 司）；荧 光 定 量 仪（），多功能酶标仪（）；北京东联哈尔二级生物安全柜。实验方法质粒提取于 超低温冰箱中取出甘油保存的 （即 质 粒菌，由实验室成功构建），将解冻菌液以 的比例接种至 液体培养基中，加入 使其终浓度为 ，摇菌。使用质粒试剂盒提取质粒并测浓度和纯度。细胞对嘌呤霉素的敏感性实验收集 细胞并离心（，），离心后重悬细胞并计数。细胞铺 孔板（个孔），于，湿润的培养箱培养。次日于细胞孔中加入梯度浓度的 ，之后每天观察细胞贴壁百分比并做记录，共计。期间每 换含 的新鲜培养基，在第天确定 细胞的最低致死浓度。细胞转染转染前天，用 胰酶消化 细胞，终止消化后收集细胞悬液至离心管，于 下离心 后弃上清重悬计数。之后调整细胞密度，接种至 孔板，个孔，将细胞放入细胞培养箱过夜培养。第天当细胞汇合度达到 时进行质粒转染：按 转染 试 剂 说 明 书 以（）（）的质粒质量比转染 细胞。用体视荧光显微镜下观察转染 后细胞的 表达率。抗性筛选与 单克隆细胞系挑选 细胞转染 后，按确定的最低致死浓度筛选转染细胞。其间，每天换一次含 的新鲜培养基，待所剩细胞均表达 时进行单克隆挑选。将孔板内细胞消化后计数，根据计数的细胞密度进行梯度稀释，稀释密度为 个。孔板预加 培养基，接种细胞，每孔 细胞悬液。孔板放入细胞培养箱，后记录单个细胞孔。待细胞克隆形成后于体视荧光显微镜下判断表达 情况，筛选出表达 细胞克隆并将其扩大培养，依次扩培到 孔板、孔板、孔板、培养瓶中。检 测 单 克 隆 细 胞 系 的表达从 数据库获取 和 基因转录 序列并设计 荧光染料定量 引物，送 基 因 公 司 合 成 备 用。分 别 取 、细胞铺孔板，个孔，培养箱培养过夜。第二天 抽提和逆转录试剂盒提取，并将 逆转录 。以 为模板进行相对 ，作为内参，检测 转录水平的相对表达，使用 法 （样品 ）（对照 ）进行数据处理分析。其中 的 定 量 引物 为：，：；的 定 量 引 物 为：，：。流式细胞术检测 单克隆细胞系 的表达准备约 个的 和 细胞上机进行流式细胞检测，其中 作为对照细胞。胰酶消化并用完全培养基终止消化，将细胞悬液收集到 管中，于 下离心 ，弃上清并用 重悬细胞。使用 清洗细胞次，最后用 重悬，此时细胞密度约 个。之后加入偶联 的 抗体与细胞避光孵育 ，孵育完成后使用 清洗细胞次，重悬细胞。细胞悬液经细胞滤网过滤，同时设置流式细胞仪检测通道为 和 双通道、设置细胞上样的上限数为 个。最后将细胞悬液上机检测，收集数据。的相对荧光强度作为 表达的量化指标。法检测 细胞系增殖活性选取表达较高的 细胞系进行增殖活性测定。取一定量的 与 细胞，计数后铺 孔板，每个孔板接种对应细胞悬液 （个），每种细胞三个复孔，铺块 孔板。培养过夜按计，分别于，后测定细胞活性。检测步骤如下：于空白培养基和细胞所在孔中分别加入 溶液，包裹锡纸于细胞培养箱中避光孵育。后多功能酶标仪待测样品孔 波长下的吸光度。实验结果 细胞系构建 质粒构建如图所示。其第 卷第期朱帅旗，等稳定表达 的非小细胞肺癌细胞系 中 全长 ，并且受上游 启动子转录调控。抗性基因 和标记基因 之间通过 序列连接并受 启动子调控。图 转座质粒系统 细胞对嘌呤霉素敏感性分析图展示的是 细胞在 （）作用下的致死曲线。结果表明，经 处理后，的剂量即可观察到细胞完全死亡，因此后续筛选转染细胞的浓度确定为。图 细胞对嘌呤霉素的敏感度曲线 与 质粒共转 细胞 转座载体质粒与 辅助质粒转染 细胞 后，于体视荧光显微镜蓝色激发光下可以观察到 的表达，表明质粒转染表达且效率在 左右（图）。图荧光显微镜拍摄 在 细胞中的表达 细胞单克隆挑选经过 抗性筛和单克隆细胞挑选并将细胞培养后，得到个表达 的 单克隆细胞团。图是于荧光显微镜明场和暗场下拍摄的结果。图 在 单克隆细胞系中的表达 在 细胞系中高表达收集单克隆细胞系并对其 的转录进行 荧 光 相 对 定 量。如 图 所 示，个 单克隆细胞系相较于 细胞有 多倍的表达，表明 在 单克隆细胞系中高表达。图 细胞系中的 高表达 在 细胞系中具有高表达以 细 胞 作 为 对 照，流 式 细 胞 术 检 测 单克隆细胞系的纯度及 在细胞膜上的表达。如图 所示，个单克隆细胞系的 与 的 双 阳 率 均 高 于，表 明 细胞系的纯度很高。另外，通过 单通道的平均荧光强度即 判断 的表达情况（图），的 均达到，表明 在 细胞系中的表达丰度很高。综上，细胞系构建成功。（）细胞系的纯度检测湖北工业大学学报 年第期（）细胞系 表达丰度检测图流式检测 单克隆细胞系 的表达 细胞系具有与亲本 细胞一致的生长活性从 和 两个细胞系中随机选取 单克隆细胞系进行增殖活性比较。如图所示，根据 溶液加入细胞后的 处吸光度值显示，细胞系在、时间点的吸光度值与亲本细胞的吸光度值差异无显著统计学意义（），的表达对细胞增殖活性基本无影响。图 和 细胞系的生长活性比较结论与讨论运 用 转 染 试 剂 共 转 质粒与 质粒至 细胞中，构建了表达 的人非小细胞肺癌单克隆细胞系即 ，而后运用 和流式细胞术成功检测到 的转录表达。细胞抗原受体 作为膜上免疫球蛋白共受体的重要一员，在 细胞的各生长阶段基本都表达，在大多急性慢性 淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤上可以鉴定。这些特性决定了 是抗淋巴恶性肿瘤 治疗的最佳靶点。根据已有报道，细胞具有靶向 肿瘤细胞的特异、有效且持久的杀伤效果。因此，通过建立稳 定 表 达 的 人 肺 癌 细 胞 系（即 ）为后续评估 抗实体瘤疗效及机制研究提供理想的靶细胞系。作为高效的转座子系统之一，长期被用于体细胞诱导多能干细胞工程，而且不改变原基因的结构和功能，可以为人淋巴细胞提供持续的转基因表达。因此，使用 转座子系统作为稳定遗传修饰的技术平台，将 质粒与 质粒导入 细胞，根据转染后成功表达 的细胞对嘌呤霉素的抗性筛选阳性细胞。选择表达 的单克隆细胞建立 细胞系；转录水平的 反 应 和 蛋 白 水 平 的 流 式 细 胞 术 检 测 证 实 整合到 基因组中并成功转录表达。根据 生长活性差异性比较，细胞系表现出与亲本细胞一致的生长增殖活性。总之，在此构建的单克隆 细胞系不仅为体外评估 改造 细胞抗实体瘤疗效机制研究提供了靶细胞，同时也为后续 在动物模型体内浸润对抗实体瘤疗效研究奠定了基础。参考文献袁园 一株可应用于嵌合体抗原受体基因修饰的细胞治疗技术的 单克隆抗体的筛选与鉴定 苏州：苏州大学，（），（），（）：，（）第 卷第期朱帅旗，等稳定表达 的非小细胞肺癌细胞系 ，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：王琳，张紫怡，金静，等稳定表达荧光素酶 细胞系的构建湖北工业大学学报，（）：段海潇，杨俊寒，王琳，等表达近红外荧光蛋白的结肠癌细胞系的建立湖北工业大学学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（，.，）：（）（），：，（），：，；：，：；责任编校：张众湖北工业大学学报 年第期