野生秦岭羚牛源食道口线虫的分离鉴定_潘广林.pdf

动物医学进展，（）：野生秦岭羚牛源食道口线虫的分离鉴定收稿日期：基金项目：秦岭大熊猫人工种群疫病防控研究（护熊猫函 号）作者简介：潘广林（），男，吉林安图人，硕士，高级兽医师，主要从事珍稀野生动物保护和疾病防控研究；王俊伟（），男，山西大同人，硕士，主要从事兽医寄生虫学研究。同等贡献作者。通讯作者潘广林，王俊伟，张强，马清义，雷颖虎，吴慧芳，王燕山，宋军科，赵光辉（秦岭大熊猫研究中心陕西省珍稀野生动物救护基地，陕西周至 ；西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 ）摘要：为了明确野生秦岭羚牛（）食道口线虫（）的种类与遗传进化关系，对秦岭山区的只野外死亡羚牛结肠内的食道口线虫利用蠕虫完全剖检法进行采集，初步观察虫体基本形态，并基于 、和 基因位点对虫体进行分子生物学鉴定和遗传进化分析。结果发现，共分离得到 条食道口线虫虫体，形态学鉴定符合食道口线虫的典型结构特征；代表性虫体样本的 基因、和 部分基因的 扩增产物长度分别为 、，其序列与山羊源粗纹食道口线虫（.，登录号：、）相似性分别为 、和 ，在遗传进化树中位于同一支，而与其他食道口线虫以及蛊口科其他线虫遗传距离较远。结果表明，该只野生秦岭羚牛结肠内的食道口线虫为粗纹食道口线虫。研究结果为秦岭羚牛食道口线虫病的流行病学调查和防控提供了基础数据。关键词：秦岭羚牛；食道口线虫；种属鉴定；遗传进化分析中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）食道口线虫（）隶属于圆线目（）、蛊口科（），主要寄生于宿主大肠中，引起食道口线虫病（），使宿主发生持续性腹泻和消瘦，严重时导致死亡。食道口线虫幼虫可钻入肠壁，破坏肠黏膜，使病灶部位形成结节，因此食道口线虫又被称为“结节虫”。秦岭羚牛（）又称金毛扭角羚，属于偶蹄目（）、牛科（）、羊亚科（），主要分布于秦岭山脉西部地区，是我国的一种特有山地森林珍稀物种。由于羚牛数量极其稀少，我国将其列为一类重点保护动物。近年来对野生秦岭羚牛寄生虫病的相关研究发现，其体内外寄生虫的感染率及感染强度较高。年月，在秦岭山区发现了只死亡羚牛，并在其结肠内发现多量食道口线虫。为了弄清其种属，本研究利用形态学和分子生物学手段对这些野生羚牛源的食道口线虫进行了种类鉴定和遗传进化分析。材料与方法材料虫体样品采用蠕虫完全剖检法采集死亡野生羚牛结肠内寄生的线虫。将死亡羚牛的腹腔剖开后，取出结肠，用手术剪剪开后，利用挑虫针挑取其中寄生的线虫，用生理盐水冲洗干净，在 乙醇中固定保存，标记宿主品种、采样时间、地点和年龄等信息，将虫体样本置于备用。主要试剂苯酚、乳酸、甘油，天津市致远化学试剂有限公司产品；、大 肠 埃 希 氏 菌 感受态细胞、标准 ，宝生物工程（大连）有限公司产品；、，北京天根生化科技有限公司产品。主要仪器光学显微镜，尼康仪器有限公司产品；型稳压稳流电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；紫外凝胶成像仪 ，赛智创业科技有限公司产品。方法虫体形态学指标的测定和种属初步鉴定肉眼观察虫体的形态特点，将虫体放入乳酸苯酚透明液中透明处理 左右，用显微镜测微尺测量并DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.024记录虫体的长度、宽度，以及头泡、食道、雌虫阴门、雄虫交合伞等形态特征，按照文献 的方法进行种属鉴定。虫体基因组 的提取选取条虫体进行基 因 组 的 提 取，包 括 条 雌 虫（命 名 为 、）和条雄虫（命名为 、）。虫体样本经无菌双蒸水洗涤后用使用 试剂盒按照使用说明提取每条虫体的基因组 。引物设计与合成参照文献 合成 基因、部分基因和 部分基因的引物（表），引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。虫 体 基 因、部 分 基 因 和 部分基因的 扩增、电泳、克隆和测序 扩增体系为，包括 （）（），（各 ），（），上、下游引物（）各，虫体基因组。反应条件为：；，（），共 个循环；最后 延伸 。表食道口线虫 基因、部分基因和 部分基因 扩增引物 ，基因 引物 序列（）（）长度 利用 琼脂糖凝胶电泳对 扩增产物进行鉴定。对于 基因，将正确的 扩增产物使用 试剂盒进行纯化，将纯化产物连接至 载体构建重组质粒，连接产物转化至大肠埃希氏菌 感受态细胞，利用 扩增的引物进行 鉴定，阳性菌液样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。对于 基因和 基因，将正确的 扩增产物直接送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。序列分析将所测得序列使用 中的 进行同源性比对，对照测序图谱进行序列校准后，利用 进行序列比对，将比对后的基因序列利用 进行同源性分析，并利用 软件使用邻近法（，）构建系统发育进化树，以 为模型，自展值（）设为 ，以 （登 录 号：、）为外群。结果秦岭羚牛源食道口线虫的形态学特征本研究共采集到 份食道口线虫虫体样本，其肉眼观呈乳白色。显微镜观察发现，虫体体表有横纹，口领发达，头泡膨大显著，食道呈棒状型，两侧具有颈沟（图）。虫体头端（）；雌虫的尾端（）；雄虫的尾端（）（）；（）；头泡；颈沟；食道；排卵器；阴门；肛门；交合伞；交合刺 ；图食道口线虫显微镜下形态观察 雄虫大小为 ，口领高 ，头泡发达，食道长 。交合伞发达，大小为 ，其背叶较小，侧叶较宽，交合刺一对且等长，长度为 。雌虫大小为 ，口领高 ，头 泡 发 达，食 道 长 为潘广林等：野生秦岭羚牛源食道口线虫的分离鉴定 。尾部较为尖细，自肛门后急剧缩小，肛 门 距 尾 端 ，阴 门 距 尾 端 ，阴门上方有一肾型的排卵器。秦岭羚 牛源 食 道口线虫 基因、部分基因和 部分基因的 扩增结果和序列特征以虫体组织 作为 模板，成功扩增出虫体样本 基因、部分基因和 部分基因片段（图）。条虫体的 基因的扩增条带均为 ，包括 的部分 、的 、的 、的 以及 的部分 片段。序列分析发现，虫体样本的 基因与 发表的山羊源.（登录号：）相似性最高，为 ，其中 基因与 发表的山羊源.（登录号：）相似性为 ，基因与 发表的山羊源.（登 录 号：）相 似 性 为 。虫体样本 部分基因的扩增条带大小约为 ，与 发表的山羊源.（登录号：）序列相似性为 。虫体样本 部分基因的扩增条带大小为 ，与 发表的山羊源.（：）序列相似性为 。标准 ；、；阴性对照 ；，；基因 扩增产物；部分基因 扩增产物；部分基因 扩增产物 ；图秦岭羚牛源食道口线虫 基因、部分基因和 部分基因的 扩增产物电泳图 ，秦岭羚牛源食道口线虫的种系发育分析基于 、基因序列分别构建的种群进化发育树表明（图和图），本研究中的个虫体基因序列与山羊源.（登录号：、）位于同一 分 支，与.（登 录 号：）呈姊妹支，而与其他蛊口科线虫距离较远。基于 部分基因序列构建的种群进化发育树表明（图），本研究中的个虫体基因序列与山羊源.（登 录 号：、）位于同一分支上，并与其他食道口线虫分别位于两支。基于 部分基因序列构建的种群进化发育树表明（图），本研究中的个虫体基因序列单独位于一小支，并与山羊源.（登录号：、）位于同一大支。讨论食道口线虫的种类较多，寄生于反刍动物的食道口线虫主要包括哥伦比亚食道口线虫（.）、粗纹食道口线虫（.）、微管食道口线虫（.）和甘肃食道口线虫（.）等。目前对食道口线虫的鉴定主要依靠形态学检查，根据其虫体的形态结构，如叶冠、头泡、颈沟、侧翼膜等，以及虫卵的形状大小为鉴定依据。本研究中发现的食道口线虫虫体特征与粗纹食道口线虫相似，体表有横纹，口领较为发达，口囊较深，头泡膨大显著。动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）秦岭羚牛食道口线虫样本序列 .图基于 基因序列的食道口线虫系统发育树 秦岭羚牛食道口线虫样本序列 .图基于 基因序列的食道口线虫系统发育树 雄虫交合伞发达，具有一对等长的交合刺；雌虫在阴门上方具有一个发达的排卵器，呈肾型。相对于基于虫卵或虫体形态进行寄生虫种属鉴定的方法，以遗传标记法为主的分子生物学鉴定方法可更加精确有效地区分寄生虫在种群内或种群间遗传变异特征。其中，核糖体 基因在生物进化过程中具有进化速度快、种内保守、种间有一定程度变异的遗传学特点，根据 基因的核苷酸序列可明确地识别和区分不同的寄生虫种属 。等 分析了不同种食道口线虫 基因序列的差别，评估了其种内和种间变异程度。等根据 基因潘广林等：野生秦岭羚牛源食道口线虫的分离鉴定秦岭羚牛食道口线虫样本序列 .图基于 部分基因序列的食道口线虫系统发育树 秦岭羚牛食道口线虫样本序列 .图基于 部分基因序列的食道口线虫系统发育树 开发一种有效鉴定.和.的 检测方法。将本研究中的虫体样本基于 基因与其他食道口线虫进行序列比对发现，其 与 发 表的 山羊源.（登 录 号：）相 似 性 最 高，为 ，其中 基因与 发表的山羊源.（登录号：）相似性为 ，基因与 发表的山羊源.（登 录 号：）相 似 性 为 。进一步分别基于 基因、基因序列的遗传进化发育分析发现，本研究所获得的虫体样本序列与山羊源.（：、）位于同一分支，表明本研究中的虫体样本与山羊源.的亲缘关系最为接近。线粒体 （，）作为一种胞核外遗传物质，与核 相比具有进化速度快、结构简单、母系遗传为主和无组织特异性等特点。许多研究表明，适合作为遗传学研究的标记，更适用于种间和种内遗传差异的研究，对分析物种进化分析具有重要意义 。等 首次利用 、基因等对藏猪食道口线虫病的流行情况进行了研究，发现.动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）和.的流行率最高，并且从结肠样本中分离出.。本研究中野生秦岭羚牛源食道口线虫样本的 和 部分基因经序列比对分析发现，其与 发表的山羊源.（登录号：、）序列相似性分别为 和 。进一步基于 部分基因序列的遗传进化发育分析发现，本研究所获得的虫体样 本 序 列 与 山 羊 源.（：、）位于同一分支，表明本研究中的虫体样本与山羊源.的亲缘关系最为接近。但基于 部分基因的分析发现，本研究中的虫体样本单独位于一小支，并与山羊 源.（：、）构成同一大支，这很可能是因为两者的宿主不同，使其在基因遗传上表现出一定的差异。基于不同基因的遗传进化分析发现，本研究中的虫体样本与.遗传距离最为接近，与其他食道口线虫以及蛊口科线虫距离较 远，表 明 基 因、基 因 以 及 基因可作为理想的遗传标记，用于食道口线虫以及其他线虫分类和遗传进化研究当中。本研究基于形态学特征和分子生物学鉴定结果，认为本研究中的虫体样本应为粗纹食道口线虫，研究结果为野生秦岭羚牛以及其他野生动物食道口线虫病的流行病学调查、诊断和防控提供了基础数据支持。参考文献：李国清兽医寄生虫学北京：中国农业大学出版社，吴家炎中国羚牛分类、分布的研究动物学研究，（）：吴家炎中国羚牛北京：中国林业出版社，于三科，潘广林，马清义，等 秦岭羚牛寄生虫种类的调查研究动物医学进展，（）：汪明兽医寄生虫学北京：中国农业出版社，廖党金，黄兵中国畜禽线虫形态分类彩色图谱北京：科学出版社，（）：，：林瑞庆，张媛，朱兴全食道口线虫与食道口线虫病的研究进展 中国预防兽医学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（：），（）：，（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：潘广林等：野生秦岭羚牛源食道口线虫的分离鉴定动物医学进展，（）：化脓隐秘杆菌 和 外排泵抑制剂的筛选李旭领，王述琪，林雨菲，张泽辉，郭玉茹，蔡宜彤，田春莲，王盈予，崔璨璨，刘明春（沈阳农业大学动物科学与医学学院，辽宁沈阳 ；中国医科大学中英联合学院，辽宁沈阳 ）摘要：为了筛选出效果较好的外排泵抑制剂，对化脓隐秘杆菌进行了耐药基因检测、药敏试验、联合药敏试验和尼罗红外排试验。结果显示，、基因的检出率分别为、和 ，未检出 、基因；槲皮素、木犀草素、黄芩苷、川陈皮素、芹菜素等种黄酮类化合物对化脓隐秘杆菌均具有良好的抗菌效果；其中木犀草素与种酰胺醇类药物联用后均有相加作用，；种黄酮类化合物均可以抑制 和 外排蛋白对尼罗红的外排，其中木犀草素的外排抑制能力最强。耐药消除试验发现，木犀草素可以不同程度的消减化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性。结果表明，木犀草素可通过抑制 和 的外排作用，逆转化脓隐秘杆菌对酰胺醇类药物的耐药性，为木犀草素作为天然外排泵抑制剂的临床开发利用奠定了基础。关键词：化脓隐秘杆菌；黄酮类化合物；外排泵抑制剂；中图分类号：文献标识码：文章编号：（）化脓隐秘杆菌（）是一种革兰氏阳性菌，可引起动物乳房炎、子宫内膜炎等疾收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（，）作者简介：李旭领（），女，内蒙古锡林郭勒盟人，硕士研究生，主要从事兽医药理学与毒理学研究。通讯作者 ，（.，；.，）：.，.（：，），.，.，.：；