携带鼠GM-CSF基因的穿梭质粒抗结肠癌作用研究.pdf

携带鼠 基因的穿梭质粒抗结肠癌作用研究苏红霞蔡林康刘滨磊李炎坤(.湖北科技学院药学院鄂南特色中药湖北省工程研究中心湖北 咸宁.武汉滨会生物科技股份有限公司.湖北工业大学)摘要:目的 探究粒细胞巨噬细胞集落刺激因子()基因修饰的穿梭质粒能否对/小鼠结肠癌有疗效 方法 构建表达鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子()的穿梭质粒 实验分为 组(质粒组)、空载体对照组(组)和溶剂对照组(组)检测 体外转染真核细胞后的表达量选取雌性/小鼠用表达近红外荧光蛋白()的鼠结肠癌细胞株()皮下植瘤采用瘤内注射方式给药游标卡尺测量实验组/小鼠肿瘤生长的情况用小动物活体成像仪观察/小鼠体内肿瘤 荧光强度表达情况并记录存活率 法检测瘤组织内免疫细胞浸润情况 结果 与 组和 组比较质粒组的表达在转染 质粒的 细胞上清中的含量达到/和溶剂 组相比质粒组与 组动物肿瘤生长趋势更为平缓给药第 与 组比较质粒组治疗效果明显在治疗 后质粒组小鼠存活率为 与 和 组相比有显著性差异携带 基因的穿梭质粒组 基因表达的荧光信号与 组和 组相比有显著性差异()检测结果显示质粒组瘤组织内有大量的 淋巴细胞、细胞浸润聚集 结论 基因修饰的穿梭质粒对鼠结肠癌具有明显的抑瘤效应可能与质粒 有效刺激免疫细胞浸润有关关键词:鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子结肠癌瘤内注射活体成像 中图分类号:文献标识码:文章编号:()开放科学(资源服务)标识码():./.():()/.().()()./()()./.湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()基金项目:国家自然科学基金项目()通讯作者:././.(.).:结直肠癌()是消化系统常见的恶性肿瘤预计到 年 的全球负担将增加新病例达到并超过 万死亡人数达到 万例 机体免疫系统不能有效识别肿瘤抗原是肿瘤发生的主要原因之一 近年来随着肿瘤免疫逃避机制的进一步明确人们不断探索靶向肿瘤免疫逃避的干预措施重新调动免疫应答吸引免疫细胞进入肿瘤组织让“冷肿瘤”变为“热肿瘤”恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应细胞因子是一种控制免疫细胞的发育由免疫细胞介导的多效性多肽可以对抗肿瘤免疫抑制激活肿瘤免疫细胞 已有研究表明粒细胞巨噬细胞集落刺激因子()对结直肠肿瘤细胞生长有直接抑制的作用 通过诱导细胞周期的/期停滞来抑制恶性肿瘤细胞的增殖并促进它们的分化 然而 在体内抑瘤的效果仍有待探讨在肿瘤微环境内高效表达细胞因子需要良好的载体 病毒载体转染效率高但易受免疫原性的影响引发严重的免疫反应和炎症反应靶向性较差且成本较高 腺病毒载体由于其高度免疫原性衣壳而触发严重免疫应答的能力可能导致病毒失活并阻碍转基因的系统传递使其应用受到了限制 早在 年就有文章报道质粒载体是一种极具前景的体内转染载体表达荧光素酶的 分子在小鼠体内表达时间可长达两个月 质粒 载体较为安全可诱导广泛的免疫反应也不存在任何与复制微生物相关的风险而直接瘤内注射质粒的方式减少了扩散和泄露且增加了对主要病灶的免疫原性本实验用 肿瘤细胞皮下接 种/小鼠建立肿瘤动物模型用穿梭质粒 注射小鼠瘤内观察 基因免疫治疗小鼠结肠癌的效果 材料与方法.实验材料.实验动物和细胞 周龄雌性/小鼠购于湖北省实验动物研究中心(合格证编号)细胞由本实验室通过 转座子系统将近红外荧光蛋白 转入鼠结肠癌细胞 细胞株并通过嘌呤霉素筛选获得 单克隆细胞株.主要试剂与仪器 重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)氨苄青霉素(德国)大肠杆菌(赛默飞世尔科技有限公司)购自(赛默飞世尔科技有限公司)胎牛血清(四季青公司)胰酶(美国 公司)/培养基(美国 公司)肌醇山梨醇缓冲液()(武汉塞维尔生物科技有限公司)(南京生航生物技术有限公司)苏木素染液(武汉塞维尔生物科技有限公司)一抗(武汉塞维尔生湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()物科技有限公司)一抗(武汉塞维尔生物科技有限公司)标记山羊抗兔组化试剂盒 显色剂(武汉塞维尔生物科技有限公司)细胞计数仪(美国 公司)基因扩增仪和二氧化碳培养箱(日本松下公司)恒温水浴锅(新苗生物科技有限公司)倒置荧光显微镜(日本 )生物安全柜(青岛海尔集团公司)低温冰箱(青岛海尔集团公司)高速离心机(美国 公司)小动物活体成像系统(珀金埃尔默股份有限公司)包埋机(武汉俊杰电子有限公司)病理切片机(上海徕卡仪器有限公司).实验方法.质粒构建与表达 载体由本实验室提供根据目的基因 序列设计引物引物序列以 基因组序列为模板扩增 产物用琼脂糖凝胶电泳检测条带大小正确后将目的片段进行产物回收 载体 以及目的基因 的 产物用 技术进行同源重组 将连接产物转化进大肠杆菌 利用氨苄青霉素进行阳性克隆筛选得到 后 测序检测载体正确性将质粒通过 转染试剂转染 细胞收集细胞上清用 验证抗原的表达重复实验 次.细胞培养 细 胞 用 含 有 胎 牛 血 清 的/培养基接种后将细胞放置于、培养箱中静置培养待细胞汇合度达 时按照 的比例进行细胞传代.植瘤前细胞处理对所需要植瘤的 细胞进行培养在植瘤前收集细胞离心条件为 然后重悬于/培养基中 调整 细胞浓度至 /.细胞植瘤 只/小鼠饲养于配有 笼具及新风系统动物实验室内饲养一周后开始实验于/小鼠右侧肋背部皮下注射 含有 个 的细胞悬液待肿瘤生长至 备用.瘤内给药实验随机分成 组分组见表 荷瘤鼠在第、瘤内注射(/)提取的质粒和 表 给药实验方案组别给药方式给药种类给药剂量(/只)动物数(只)组(质粒组)瘤内 空载体对照组(组)瘤内 溶剂对照组(组)瘤内.量取肿瘤体积用游标卡尺量取长径()一次、短径()两次肿瘤体积()的计算公式为:/.活体动物成像系统检测 产生的荧光信号小鼠肿瘤近红外荧光拍摄前先对小鼠进行麻醉后将小鼠分组放入小动物活体成像系统拍摄箱拍摄肿瘤近红外荧光表达图片 每隔 使用小动物活体成像仪观察小鼠体内荧光表达情况持续观察.免疫组织化学检测治疗第 时取各组肿瘤组织 多聚甲醛固定过夜脱水处理、石腊包埋、制成厚度为 的切片 免疫组化染色流程如下:石蜡切片常规脱蜡、补水处理室温孵育 以消除内源性过氧化物酶的活性 用组化油笔将待染组织圈好加入 室温封闭 加入待测一抗室温孵育 洗涤加入 标记 抗体室温作用 洗涤 显色自来水充分冲洗透明树胶封片.统计学方法应用 .软件进行统计学分析组间比较采用 检验以 为差异有统计学意义 结 果.质粒 在真核细胞中的表达参照 使用说明书将.的 转染 细胞转染 后收集六孔板中的细胞上清用 检测 蛋白表达 结果显示与 组和 组比较 质粒的表达在质粒组的湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()细胞上清中的含量达到/与其他两组有显著差异(.)如图 所示图 测定 在 细胞中的表达(.).质粒 体内抑瘤效应研究结果显示在 皮下移植瘤模型上 组和 组相比质粒组动物肿瘤生长趋势更为平缓 给药第 与 比较质粒组治疗效果明显(图)在治疗 后 质粒组小鼠存活率为 与 组和 组相比有显著性差异(.)见图图 肿瘤生长曲线图及鼠生存曲线图.肿瘤 基因在体内表达的荧光信号强度比较小鼠肿瘤荧光趋势图和给药 荧光强度图的数据显示在 小鼠皮下移植瘤模型上小鼠肿瘤总荧光强度和量瘤数据的趋势基本一致 肿瘤荧光强度结果显示质粒组 基因表达的荧光信号与 组和 组相比都有显著性差异()见图 图 肿瘤 基因在体内表达的荧光信号强度图.质粒 应用有效刺激免疫细胞浸润为了进一步探究质粒 的疗效我们开展了(指示 淋巴细胞)、(指示 细胞)免疫组织化学检测观察小鼠肿瘤组织中浸润细胞的类型 实验结果显示与 组相比质粒组的小鼠肿瘤组织内部有大量 淋巴细胞、细胞(图)提示质粒 能促进各种免疫细胞进入肿瘤组织、抑制肿瘤细胞的生长图 肿瘤局部组织免疫组织化学(标尺)湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()讨 论目前肿瘤免疫监控的概念正在复兴免疫系统可以通过各种途径激活来发挥抗肿瘤的效果为了达到这一目标必须提供适当的细胞因子环境使细胞因子操作成为免疫治疗的核心 近来国内外研究者对 功能的研究越来越深入尤其在肿瘤免疫治疗方面得到更多的关注 恢复肿瘤患者中性粒细胞驱动的免疫反应在 的下游免疫效应器中中性粒细胞尤其重要是最早对感染和癌症做出反应的免疫细胞类型之一 最近 被证明通过激活肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞中的 来驱动抗肿瘤的 和 细胞免疫反应 因此 在抗肿瘤方面的研究有必要进一步探讨本研究发现 质粒能高效表达靶基因明显抑制/小鼠结肠癌的生长延长小鼠的生存期 另外免疫组织化学结果发现穿梭质粒 治疗组肿瘤组织内部有大量 淋巴细胞、细胞提示穿梭质粒 能有效增强不同免疫细胞的趋化吸引作用促进各种免疫细胞进入肿瘤组织、抑制肿瘤细胞的生长 但穿梭质粒在患者原代肿瘤细胞中的局限性仍然不容忽视更值得注意的是这项研究仅限于单个细胞系后期仍有必要增加不同细胞系的研究并与病毒载体进行比较研究综上所述瘤内注射 基因修饰的穿梭质粒对小鼠结肠癌具有明显的抑瘤效应可能与质粒 有效刺激免疫细胞浸润有关但具体机制还需要进一步研究 本研究也为临床应用 基因免疫治疗提供了实验依据参考文献:.():.:.():.():.():.():.():张思琪谷相勇刘滨磊.抗乙肝病毒药物对 溶瘤效果的影响.湖北科技学院学报(医学版)():.:?.:.():(收稿日期:)湖北科技学院学报(医学版)年第 卷第 期 ()