小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能POCT技术研究.pdf

2023 年 6 月第 44 卷第 3 期河南工业大学学报(自然科学版)Journal of Henan University of Technology(Natural Science Edition)Jun.2023Vol.44 No.3收稿日期:2023-04-17基金项目:国家自然科学基金项目(32202172,32072331,32102084);中国农业科学院科技创新工程项目(CAAS-ASTIP-2021-OCRI)作者简介:王丹(1999),女,重庆人,硕士研究生,研究方向为生态学。通信作者:张兆威,研究员,博导,E-mail:。小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能 POCT 技术研究王丹1,2,3,胡 小 风1,2,4,王 督1,2,4,唐 晓 倩1,2,4,姜 俊1,2,4,李 培 武1,2,4,张兆威1,2,41.中国农业科学院油料作物研究所,湖北 武汉 4300622.湖北洪山实验室,湖北 武汉 4300703.西藏大学 生态环境学院,西藏 拉萨 8500004.农业农村部生物毒素检测重点实验室,农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室(武汉),国家农业检测基准实验室(生物毒素),湖北 武汉 430062摘要:玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是谷物中危害大、污染重的一种真菌毒素,造成粮食大量损失。现有的检测技术存在局限性,如检测灵敏度低、智能化程度低等,难以实现对 ZEN 的早检测和早发现,而高灵敏智能快速检测技术是防止 ZEN 进入食物链的重要技术方法。针对以上难题,在前期自主研发ZEN 高亲和力抗体的基础上,制备了氧化铕乳胶微球抗体探针,研发出荧光定量高灵敏智能即时检测(Point-of-care testing,POCT)技术,实现了小麦中 ZEN 高灵敏快速智能检测。在优化条件下,POCT 技术线性范围为 0.2 2.4 ng/mL,最低检测限为 0.02 ng/mL,加标回收率为 104.9%110.3%,重复性(批内)和再现性(批间)试验的回收率为 95.2%104.2%(变异系数 5.5%)和 92.3%107.5%(变异系数 3.4%)。本研究为真菌毒素智能 POCT 提供了通用型技术平台和粮食减损智慧监管技术方法。关键词:玉米赤霉烯酮;小麦;即时检测;智能检测中图分类号:TS207文献标志码:A文章编号:1673-2383(2023)03-0034-08DOI:10.16433/j.1673-2383.2023.03.005Study on sensitive intelligent POCT technology of zearalenone in wheatWANG Dan1,2,3,HU Xiaofeng1,2,4,WANG Du1,2,4,TANG Xiaoqian1,2,4,JIANG Jun1,2,4,LI Peiwu1,2,4,ZHANG Zhaowei1,2,41.Institute of Oil Crops,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Wuhan 430062,China2.Hubei Hongshan Laboratory,Wuhan 430070,China3.School of Ecology and Environment,Tibet University,Lhasa 850000,China4.Key Laboratory of Biotoxin Detection,Ministry of Agriculture and Rural Affairs;Oil Product Quality and Safety Risk Assessment Laboratory,Ministry of Agriculture and Rural Affairs(Wuhan);National Agricultural Testing Reference Laboratory(Biotoxins),Wuhan 430062,ChinaAbstract:Zearalenone(ZEN)is a harmful and heavily-polluting mycotoxin in grains,causing significant grain loss.It is usually generated by Fusarium and Gibberella fungal species that can contaminate food and feed at all stages of production,harvesting,storage,and processing.A variety of existing analytical and detection technologies face technical bottlenecks such as low sensitivity and lack of intelligence,and they are difficult to realize early detection and early discovery of ZEN.To solve these problems,the antibody combined europium oxide latex microspheres probes were developed.Latex microspheres are nano labeled 第 44 卷第 3 期王丹,等:小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能 POCT 技术研究materials with abundant color,uniform size and large specific surface area,providing abundant sites for conjugated antibodies.The detection technology based on a latex microsphere antibody probe has excellent stability and high sensitivity.Europium(Eu)is an element with high quantum yield,narrow band width,long emission life and large volume.It is widely used in immunoassay due to large Stokes shift and low toxicity.Eu can effectively avoid the interference of background fluorescence,and the fluorescent oxide latex microspheres prepared by Eu have the advantages of bright color,uniform particle size and good mon-odispersity.These characteristics make the europium oxide latex microsphere antibody probe have the advantages of high repeatability,accuracy and sensitivity in ZEN rapid intelligent detection.In this work,a fluorescence quantitative intelligent point-of-care testing(POCT)method was developed for the detection of ZEN in wheat.Under optimized conditions,the linear range of this detection was 0.2-2.4 ng/mL,the minimum detection limit was 0.02 ng/mL,and the recovery rate was 104.9%-110.3%.The intra-batch repeatability and inter-batch reproducibility experiments showed a recovery rate of 95.2%-104.2%(CV=5.5%)and 92.3%-107.5%(CV=3.4%),respectively.In practical application,this study not only pro-vided an accurate and sensitive method for intelligent detection of ZEN,but also showed great potential for monitoring mycotoxins and other hazard factors in food and feed.Key words:zearalenone;wheat;point-of-care testing;intelligent detection玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是真菌产生的有毒代谢产物。小麦是一种重要的农作物,也是受 ZEN 污染的主要粮食作物之一。全世界范围内均有 ZEN 污染报道,我国对粮食和饲料中ZEN 污 染 调 查 分 析 显 示 阳 性 检 出 率 可 达100%1。ZEN 具有非类固醇雌激素作用,影响生殖细胞分化,破坏细胞内遗传物质,甚至引起动物死亡2。食用含有 ZEN 的小麦及制品会引起中枢神经系统的中毒症状,如恶心、神智抑郁和共济失调等3。GB 27612017 中规定小麦和小麦粉中 ZEN 的最高限量为 60 g/kg。目前,ZEN 检测方法有精密仪器分析法、生物传感器法和免疫分析法。精密仪器分析法有高效液相色谱法4、气相色谱质谱法5和薄层色谱法等6,具有分析较迅速和检测限低等特点;生物传感器法主要有电化学生物传感器法、光学生物传感器法、测温生物传感器法和压电生物传感器法等,具有选择性好等特点7;常用的免疫分析法有酶联免疫分析法8和胶体金免疫分析法9等,具有专一性高和特异性强的优点。随着检测需求的提升,传统方法的灵敏度和智能程度已无法满足需求,精密仪器分析法步骤复杂,无法实现现场检测10;生物传感器法存在结合效率低和稳定性易受到干扰等问题11;免疫分析法也存在灵敏度低和智能化差的问题12。因此,亟须研究 ZEN 高灵敏检测技术,实现 ZEN的早检测和早发现。纳米标记材料乳胶微球(latex microsphere,LMs)具有颜色丰富、大小均匀和比表面积大的特点,为偶联抗体提供了丰富的位点。基于乳胶微球抗体探针的检测技术具有良好的稳定性与较高的灵敏度13。铕(Eu)是一种量子产率高、带宽窄、发射寿命长、体积大的元素,因其斯托克斯位移大和低毒等特点被广泛应用于免疫分析14。Eu 能有效避免背景荧光的干扰,用其制备的荧光氧化物乳胶微球具有颜色鲜艳、粒径均匀和单分散性好的优点,使得基于氧化铕乳胶微球抗体探针在 ZEN 快速智能检测中具有结果重复性高、准确和 灵 敏 度 高 等 优 点。作 者 在 前 期 自 主 研 发ZEN 高亲和力抗体的基础上,研发了荧光定量高灵敏智能即时检测(Point-of-care testing,POCT)技术。通过优化条件获得了基于乳胶微球抗体探 针 的 POCT 技 术 的 线 性 范 围、最 低 检 测 限(LOD)和加标回收率,评估了其重复性(批内)和再现性(批间),为真菌毒素等危害因子检测提供了通用型技术平 台和粮食 减 损 智 慧 监 管 技 术方法。1材料和方法1.1材料和试剂氧化铕乳胶微球:上海优你生物科技股份有限公司;卵清蛋白(OVA)、羊抗鼠免疫 球 蛋 白(IgG):武汉博斯特生物科技有限公司;玉米赤霉烯酮(ZEN)、黄曲霉毒素 B1(AFB1)、赭曲霉毒素53河南工业大学学报(自然科学版)2023 年A(OTA)、T-2 毒素(T-2)、呕吐毒素(DON)、伏马菌素 B1(FB1)、杂色曲霉毒素(ST)、蛇形霉素(DAS)、环匹阿尼酸(CPA):Sigma-Aldrich 公司。样品垫(GFCP000800 玻璃纤维、fusion3、fu-sion5、滤血膜)、吸水垫:上海金标生物科技有限公 司;HF135 硝 酸 纤 维 素(nitrocellulose mem-brane,NC)膜:Millipore 公司;FF120 NC 膜:What-man 国际有限公司;CN95 NC 膜:Sartorius 公司;超纯水:Milli-Q 系统。1.2仪器与设备超声细胞破碎仪:美国 SONICS 公司;恒温孵育器:杭州瑞诚仪器有限公司;自制的智能检测设备:中国农业科学院油料作物研究所;LCMS-8060 UPLC-MS/MS 仪:日本 Shimadzu 公司;试验筛:北京盛田嘉源科技有限公司;FEI tecnai G2 F30 透射电子显微镜:美国 FEI 公司。1.3方法1.3.1智能检测设备的设计自制的智能检测设备结构设计如图 1 所示,检测时,打开锂电池的开关,电量显示器亮起,风扇排风。将数据线插头与数据口连接,将 light-ning 接口/type-c 接口/micro-USB 与智能手机连接,将待测试纸条插入试纸条卡槽中,通过智能手机上的软件控制 LED 光源(Ex=365 nm)照射到试纸条上,摄像头采集图像,再通过应用进行解析可得待测物含量。1.外壳;2.内置摄像头;3.LED 光源;4.电量显示器;5.数据口;6.智能手机;7.lightning 接口;8.type-c 接口;9.micro-USB 接口;10.数据线插头;11.电源口;12.锂电池;13.风扇;14.试纸条卡槽图 1智能检测设备整体构造Fig.1Structure of the intelligent detection device1.3.2ZEN 抗体制备和鉴定根据本实验室前期的报道进行 ZEN 抗体的制备和鉴定15。1.3.3氧化铕乳胶微球-抗体探针的研制用于偶联 ZEN 单克隆抗体的氧化铕乳胶微球在可见光照射下呈白色,在紫外光照射下呈明亮 的 橘 红 色,激 发 波 长 365 nm,发 射 波 长613 nm。氧化铕乳胶微球与 ZEN 单克隆抗体偶联步骤:取 800 L 0.2 mol/L pH 8.0 的硼酸缓冲液,加入 200 L 氧化铕乳胶微球,振荡混匀,用超声 细 胞 破 碎 仪 超 声 4 s;加 入 一 定 体 积 的EDC 溶 液(20 mg/mL),涡 混 匀 15 min;离 心10 min(13 300 r/min,10 ),弃去上清液;将沉淀用 1 mL 硼酸缓冲液重悬,振荡混匀,再用超声细胞破碎仪超声 4 s;加入一定量的 ZEN 单克隆抗体溶液,涡旋混匀,10 旋转混匀 12 h;离心 10 min(13 300 r/min,10 ),弃去上清液,加入 1 mL 0.5%的牛血清白蛋白(BSA)溶液重悬,涡旋混匀,10 旋转混匀 2 h(250 r/min);4 保存待用。在 ZEN 单克隆抗体标记荧光探针的制备过程中,EDC 用量会影响氧化铕乳胶微球的活化程度,因此要对 EDC 用量进行优化。加入不同物质的量的 EDC 水溶液,根据试纸条检测线(T 线)和质控线(C 线)荧光强度选择最佳 EDC 用量。1.3.4POCT 法检测条件的影响因素分析配制 1.0 mg/mL 的 ZEN 单克隆抗体水溶液,在最佳 EDC 用量及氧化铕乳胶微球封闭液条件下,偶联抗体用量设置为 10、20、40、80 L,通过T/C 优化出最佳抗体用量。T 线包被质量浓度 优化:将不同 质量浓度(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL)的 ZEN-OVA 包被于 NC 膜 T 线处,取氧化铕乳胶微球偶联的单克隆抗体于微孔中,插入试纸条进行反应,检测系列 ZEN 标准品,根据灵敏度选择 ZEN-OVA 最佳包被质量浓度。C 线包被质量浓度优化:将不同质量浓度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的羊抗鼠IgG 包被于 NC 膜的 C 线位置,取氧化铕乳胶微球偶联的单克隆抗体于微孔中,插入试纸条进行反应,根据 C 线荧光强度选择 IgG 最佳包被质量浓度。1.3.5POCT 法原材料的优选使用 fusion3、fusion5 和滤血膜 3 种样品垫;CN95、FF120 和 HF135 3 种 NC 膜,按照上述优化条件,用 ZEN 系列标准品溶液(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL)点样,观察荧光氧化铕乳胶微球在 NC 膜上的移动速度、背景是否干净等;反应结束后,采用自制的智能检测设备读数,考察线性范围和相关系数等,优选出合适的样品垫和 NC 膜。选择合适的样品垫和 NC 膜,在塑料衬板上63第 44 卷第 3 期王丹,等:小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能 POCT 技术研究由下至上依次粘贴样品垫、NC 膜和吸水垫,相邻各垫在连接处交叠 1 mm,检测垫以 NC 膜为基垫,自下而上设置横向 T 线和 C 线。使用 BioDot XYZ 3050 划膜仪,以 0.7 L/cm 的速率划膜,划好 T 线和 C 线后,37 烘箱处理 1 h,取出切条(宽 4 mm),4 密封保存。1.3.6样品前处理将小麦粉碎成粉末,过试验筛(1 mm 孔径)后称取小麦粉末 25 g,加入 100 mL 乙腈/水(体积比 为 60 40)16,高 速 均 质 3 min(15 000 r/min),过滤后取滤液 1 mL 加入 3 mL 样品稀释液,混匀待测。1.3.7POCT 法与 UPLC-MS/MS 法比对验证提前将未使用的试纸条及配套试剂从冰箱中取出平衡至室温。将一定量的 BSA、吐温-20(Tween-20)、蔗糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮-30(PVPK-30)等化学试剂根据不同配比溶解于 PBS 缓冲液中,配制成样品稀释液。将样品稀释液加入试样微孔中,加入抗体标记的氧化铕乳胶微球,混匀,用自制的智能检测设备进行测试,根据背景干扰、T 线和 C 线的清晰程度确定最佳的样品稀释液配方。在最佳样品稀释液条件下进行检测,取混合后的待测样液与标记抗体的氧化铕乳胶微球加入微孔中,插入试纸条,于恒温孵育器中 37 反应 10 min17,将试纸条放入自制的智能检测设备中读取 T 线和 C线荧 光 值。对 于 UPLC-MS/MS 检 测,滤 液 用0.22 m 有机过滤器进行过滤,然后注入 UPLC-MS/MS 进行检测。1.4方法学评价1.4.1校准曲线与最低检出限在阴性小麦样品提取液中加入系列质量浓度(0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8、2.4 ng/mL)的 ZEN 标准品,然后将待测液加至试纸条的样品孔中 37 反应 10 min,用自制的智能检测设备读取 T 线和 C 线荧光值,计算 T 线与 C线的信号强度比值,以 ZEN 质量浓度的常用对数为横坐标,以 T 线与 C 线的信号强度比值为纵坐标,建立校准曲线。取 21 组空白小麦样品用试纸条进行检测,通过公式“LOD=3/s”计算最低检出限(LOD),其中,为 21 个空白样品值的标准差,s 为灵敏度,即校准曲线的斜率18。1.4.2重复性与再现性用批内差异和批间差异评价智能 POCT 技术的重复性和再现性。以阴性小麦样品提取液为基质,添 加 ZEN 标 准 品 使 其 质 量 浓 度 为 2.0 g/kg。采用同一批次的 ZEN 试纸条重复 6 次检测,并用自制的智能检测设备读取结果作为批内差异数据;采用 6 个批次的 ZEN 试纸条进行检测,并用自制的智能检测设备读取结果作为批间差异数据。1.4.3稳定性测试本研究的试纸条在 180 d 内是否有效,将试纸条密封储存在 4 的冰箱中,每 30 d 取出测试,考察其稳定性。1.4.4特异性配制 ZEN、AFB1、OTA、T-2、DON、FB1、ST、DAS、CPA 9 种毒素的标准溶液 1 ng/mL,用建立的智能 POCT 技术进行特异性验证。1.4.5与 UPLC-MS/MS 对比验证用建立的智能 POCT 技术与 UPLC-MS/MS进行比对,验证该技术的准确性,从而评估其检测实际样品的可行性。UPLC-MS/MS 采用多反应监测模式(MRM),色谱分离柱为 Thermo C18色谱柱(2.7 m,10 cm),柱温 40 。流动相 A为水,流动相 B 为乙腈。采用梯度 洗脱程序:01 min,25%B;13 min,70%B;34 min,70%B;4 5 min,25%B。洗脱流速 300 L/min,进样量 1 L,运行时间 5 min。离子源为电喷雾离子源(ESI),质量分析器为三重四极杆,电离方式为电喷雾电离(ESI-)。毛细管电压 3.0 V,源温度 150 ,去溶剂化温度 350 。氩气用作碰撞气体(碰撞池,0.8 V),氮气用作雾化气体(50 L/h)和去溶剂化气体(650 L/h)。1.5数据处理与分析使用 LabSolution 5.89 对 UPLC-MS/MS 所得数据进行处理。2结果与讨论2.1EDC、ZEN 抗体、ZEN-OVA 和羊抗鼠 IgG的用量图 2 为氧化铕乳胶微球的透射电子显微镜图,此微球尺寸均一、圆形、粒径 200 nm 左右。当加入 EDC 体积中的物质的量大于或等于氧化铕乳胶微球表面的羧基物质的量时,氧化铕乳胶微球才能得到充分活化。当加入的抗体量一定时,在一定范围内,EDC 的用量越多,与抗体偶联的氧化铕乳胶微球数量越多,试纸条上 T 线和 C73河南工业大学学报(自然科学版)2023 年图 2氧化铕乳胶微球的透射电子显微镜图Fig.2Transmission electron microscopy of europium oxide latex microspheres线的荧 光 强 度 越 强。当 加 入 40 L 20 mg/mLEDC 水溶液时,试纸条 T 线和 C 线的荧光强度最合适(图 3(a),因此,40 L 20 mg/mL EDC 为最佳剂量,能确保氧化铕乳胶微球的充分活化。智能 POCT 技术的灵敏度受抗原和抗体用量的影响较大,通过 T/C 优化出 1.0 mg/mL ZEN 抗体最佳用量为 20 L(图 3(b)。测试 NC 膜 T 线处包被不同质量浓度 ZEN-OVA 的试纸条,根据试纸条的灵敏度选择 0.5 mg/mL ZEN-OVA 为 T 线的最佳包被质量浓度(图 3(c);测试 NC 膜的 C 线处包被不同质量浓度 IgG 的试纸条,根据试纸条上 C 线荧光强度选择 0.2 mg/mL IgG 为 C 线的最佳包被质量浓度(图 3(d)。注:(a)EDC;(b)ZEN 抗体;(c)ZEN-OVA;(d)羊抗鼠 IgG。图 3EDC、ZEN 抗体、ZEN-OVA 和羊抗鼠 IgG 的用量优化Fig.3Dosage optimization of EDC,ZEN antibody,ZEN-OVA and goat anti-mouse IgG2.2试纸条原材料的选择 对样品垫种类和 NC 膜种类进行优化以获得更好的 T 线和 C 线荧光强度。通 过荧光信号测试评估了 T 线和 C 线的性 能(表 1)。样品垫和 NC 膜 对 显 色 和 线 性 的 检 测 结 果 显 示FF120 NC 膜 和 fusion5 样 品 垫 的 显 色 速 度 较快,背景 清 晰 干 净 且 线 性 良 好。所 以 选 择 fu-sion5 样品垫与 FF120 NC 膜,以保证 T 线和 C线的荧光强度。2.3样品稀释液在免疫层析中,用样品稀释液稀释样品,再表 1试纸条原材料的选择Table 1Selection of materials for test strips样品垫FF120CN95HFC135玻璃纤维+fusion3+fusion5+滤血膜+注:+表示 T 线和 C 线的清晰度,+越多,清晰度越好。与氧化铕乳胶微球混合后进行层析反应。样品稀释液的作用主要有:降低样品中有机相的浓度;提供稳定的 pH 值,保护抗体活性;使氧化铕83第 44 卷第 3 期王丹,等:小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能 POCT 技术研究乳胶微球均匀分散。因此,研究了各种样品稀释液配方对免疫层析结果的影响。结果表明:当样品稀释液组成为“1%蔗糖+0.5%BSA+2.5%Tween-20+0.5%PVPK-30 的 PBS(pH 7.4)溶液”时,T 线荧光强度最高、最清晰,背景值最小,层析效果最好。蔗糖可以增加亲水性及增加蛋白稳定性并维系蛋白结构;BSA 可以消除非特异性吸附、降低背景信号、保护抗体活性及分散氧化铕乳胶微球颗粒;Tween-20 为表面活性剂,可作为增溶剂和亲水剂,使活性蛋白的结合位点充分暴露,促进抗原抗体结合反应;PVPK-30 是一种大分子聚合物,可作为增稠剂,帮助氧化铕乳胶微球均匀分散并在溶液中保持悬浮状态。2.4方法学评价用智能检测设备读取系列校准液每个浓度点的 T/C 值。将每个浓度点的 T/C 作为纵坐标,ZEN 质量浓度的常用对数作为横坐标,以最小二乘法绘制校准曲线(图 4),得到校准曲线方程Y=-0.894 8X+0.457 2,R2=0.982 3。ZEN 的LOD 由公式 LOD=3/s 计算得出,ZEN 在小麦基质中的 LOD 为 0.02 ng/mL,线性范围 0.2 2.4 ng/mL,显著高于酶联免疫分析法和胶体金免疫分析法等分析方法的灵敏度(表 2)。注:ZEN 质量浓度分别为 0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8、2.4 ng/mL;内插图为检测小麦基质中 ZEN 的试纸条照片。图 4小麦基质中 ZEN 校准曲线Fig.4Calibration curve of ZEN for the test strip in wheat sample substrate表 2本方法与其他 ZEN 分析方法的比较Table 2Comparison of this method with other ZEN analytical methods检测方法最低检出限线性范围回收率/%酶联免疫吸附分析法190.3 g/kg0.5 10 g/kg76.7 104.2胶体金免疫分析法125 g/kg7 129 g/kg86.1 103.7高效液相色谱法200.35 g/kg10.16 508.00 ng/mL81.3 107.6电化学传感器法210.067 g/mL0.2 6 g/mL98.4 106.7本方法0.02 ng/mL0.2 2.4 ng/mL104.9 110.3采用同批次试纸条检测了 6 次加标的小麦样品。ZEN 加样回收率为 95.2%104.2%,变异系数(CV)为 5.5%,表明智能 POCT 技术具有良好的重复性;使用 6 个批次的试纸条检测了小麦加标样品,ZEN 加样回收率为 92.3%107.5%,CV 为 3.4%,表明智能 POCT 技术具有出色的再现性。试纸条的稳定性试验得到加样回收率为95.2%103.2%,表明试纸条在 180 d 内具有良好的稳定性。为了证明智能 POCT 技术可以用于 ZEN 的快速 检 测,通 过 比 较 ZEN、AFB1、OTA、T-2、DON、FB1、ST、DAS 和 CPA 9 种不同真菌毒素的荧光信号验证测试条的特异性(图 5)。制备每种真菌毒素的质量浓度为 1 ng/mL,进行特异性验证,对 比 发 现 测 试 条 带 对 ZEN 有 很 好 的 选择性。图 5试纸条特异性分析Fig.5Specificity analysis of test strips2.5与标准方法比对验证对空白小麦样品分别进行了高中低质量浓度的加标回收试验,通过智能 POCT 技术与 UP-LC-MS/MS 进行比对,进一步验证智能 POCT 技术的准确性。ZEN 的 UPLC-MS/MS 定量和定性93河南工业大学学报(自然科学版)2023 年离子对见表 3。表 3ZEN 的 UPLC-MS/MS 定量和定性离子对Table 3Quantitative and qualitative ion pairs for ZEN UPLC-MS/MS分析物母离子(m/z)定量离子(m/z)定量离子碰撞电压/V定性离子(m/z)定性离子碰撞电压/VZEN317.1M-H-131.2030175.3024如表 4 所示,智能 POCT 技术检测加标小麦样品中 ZEN 的回收率为 104.9%110.3%。相比之下,UPLC-MS/MS 法检测加标小麦样品中 ZEN 的回收率为 103.6%105.7%,两种方法的检测结果符合率较高。两种方法的 RSD 均低于 6%,结果表明所提出的 ZEN 智能 POCT 技术准确可靠。表 4ZEN 在小麦中的加标回收率Table 4Recoveries of spiking ZEN in wheat分析物加标浓度/(ng g-1)本方法UPLC-MS/MS 法回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%ZEN5110.35.9103.65.110105.85.3105.73.750104.94.4104.43.2注:数据为 3 次测量平均值。3结论研发了一种灵敏、快速、简便的测定小麦中ZEN 的高灵敏智能 POCT 技术,准确性和可靠性高。基于抗原抗体的特异性免疫反应原理,采用高灵敏度氧化铕乳胶微球作为示踪物来标记抗体,采用智能手机进行现场检测。检测小麦基质中 ZEN,其 LOD 为 0.02 ng/mL,线 性 范 围 为0.2 2.4 ng/mL,加 样 回 收 率 为 104.9%110.3%,批内重复性和批间再现性分别为 95.2%104.2%和 92.3%107.5%。该方法操作简便,所需时间短,与 UPLC-MS/MS 方法检测结果一致,为真菌毒素快速智能检测提供了通用型技术平台。本研究自制的智能检测设备和智能手机之间现只能使用有线传输数据,下一步研究可改进为蓝牙或 Wi-Fi 连接,提高智能化程度;此外,还可以建立数据储存云平台,有利于政府部门智慧监管。参考文献:1邢广旭,邢云瑞,孙亚宁,等.玉米赤霉烯酮荧 光 免 疫 层 析 快 速 检 测 方 法 的 研 究 J.畜 牧 与 兽 医,2022,54(8):105-109.2马传国,王英丹.玉米赤霉烯酮污染状况及毒性的研究进展 J.河南工业大学学报(自然科学版),2017,38(1):122-128.3ROPEJKO K,TWARUZEK M.Zearalenone and its metabolites:general overview,occur-rence,and toxicity J.Toxins,2021,13(1):35.4LIAO C D,CHIUEH L C,SHIH D Y C.Determination of zearalenone in cereals by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry J.Journal of food and drug analysis,2020,17(1):52-58.5CUNHA S C,FERNANDES J O.Develop-ment and validation of a method based on a QuEChERS procedure and heart-cutting GC-MS for determination of five mycotoxins in cereal products J.Journal of separation science,2010,33(4/5):600-609.6刘梅,张晋欣,刘沙沙,等.粮油作物中玉米赤霉烯酮检测方法研究进展 J.食品与生物技术学报,2021,40(5):12-20.7李壮,王猛强,马磊,等.农产品中玉米赤霉烯酮限量标准及快速检测技术研究进展 J.分 析 试 验 室,2021,40(8):985-992.8付少伟,孙淑敏,谢岩黎.基于酶联适体竞争法检测谷物制品中真菌毒素的研究 J.河南工业大学学报(自然科学版),2021,42(1):56-62.9谭新柳,黄菲,缪文俊,等.玉米赤霉烯酮检测方法研究进展J.南京工业大学学报(自然科学版),2020,42(1):9-17.10 董梅,武琴园,薛海燕,等.高效液相色谱法测定食品中玉米赤霉烯酮的研究 J.粮食与食品工业,2022,29(3):65-68,72.11 应晨辉,吴龙,陈健,等.适配体传感器在玉米赤霉烯酮检测中的应用 J.食品安全质量检测学报,2022,13(18):5821-5830.12 贾寅,杨宏伟.胶体金快速定量法检测粮04第 44 卷第 3 期王丹,等:小麦中玉米赤霉烯酮高灵敏智能 POCT 技术研究食中玉米赤霉烯酮 J.粮食科技与经济,2016,41(1):35-38.13 刘源,张开惠,王莹莹,等.多重免疫层析检测技术在食品安全快速检测中的研究进展 J.食品与发酵工业,2023,49(1):337-346,360.14 ZHU F,ZHANG H,QIU M,et al.Dual-la-bel time-resolved fluoroimmunoassay as an advantageous approach for investigation of diethyl phthalate&dibutyl phthalate in sur-face water J.Science of the total environ-ment,2019,695:133793.15 唐晓倩,李培武,张奇,等.玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及鉴定 J.化学试剂,2012,34(10):869-871,926.16 吴伟峰,张燕,彭宏威.玉米赤霉烯酮样品前处理与快速检测技术研究进展 J.食品 安 全 质 量 检 测 学 报,2015,6(9):3536-3542.17 YANG Q B,QI Y H,ZHOU J M,et al.De-velopment of fluorescent immunochromato-graphic test strip for qualitative and quantita-tive detection of Zearalenone J.Food ana-lytical methods,2022,15(9):2547-2557.18 TIAN Y X,HU X F,JIANG J,et al.Smart-phone-based quantitative detection of ochra-toxin A in wheat via a lateral flow assay J.Foods,2023,12(3):431.19 刘刚,韩铮,聂冬霞,等.玉米赤霉烯酮快速间接竞争酶联免疫检测技术研究及应用 J.上海农业学报,2015,31(1):92-95.20 胡云,王帅,邹勇平,等.优化的免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测食品中的玉米赤 霉 烯 酮 J.食 品 安 全 导 刊,2022(33):121-125.21 周曙曙,黄浩,廖金莲,等.基于新型碳基纳米材料的食品中玉米赤烯