香蕉长链非编码RNA_Ma...区域分析及上游调控因子筛选_李文彬.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（）；国家重点研发计划项目（）作者简介：李文彬，副研究员，研究方向为植物分子生物学，：。通信作者：孙建波，副研究员，研究方向为微生物学，：。李文彬，于晓玲，闫羿辰，等 香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选 南京农业大学学报，（）：，（），（）：香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选李文彬，于晓玲，闫羿辰，孙建波（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南省热带农业资源研究院，海南 海口；琼台师范学院，海南 海口）摘要：目目的的 为了深入研究香蕉长链非编码 的功能和特性，对 的启动子顺式作用元件、病原菌响应模式及结合因子进行了初步的研究。方方法法 将 全长启动子（）及从 端到 端序列互补的启动子片段（）、（）和（）转入拟南芥，研究其在高盐和尖孢镰刀菌粗毒素胁迫下的响应模式；以 启动子 为诱饵，利用酵母单杂交技术筛选获得与该启动子结合的转录因子，并确定启动子的核心功能区。结结果果 的启动子包含多个与光照、病原菌、激素响应相关的顺式作用元件；所有启动子片段在尖孢镰刀菌粗毒素处理的 活性比高盐处理后更高，且 驱动下 的活性与全长 驱动下的活性相似；通过酵母单杂文库筛选到 个潜在的结合因子序列，其中双 结构的锌指蛋白 经点对点酵母单杂交验证可与 和 互相结合。结结论论 的启动子对尖孢镰刀菌粗毒素比对高盐处理更敏感，筛选到 个锌指蛋白 可与启动子核心功能区（）结合。关键词：香蕉；启动子；顺式作用元件；调控因子中图分类号：；文献标志码：文章编号：（）（），（，；，）：，（）（），（）（），（）：（）；南 京 农 业 大 学 学 报第 卷非编码（）是指不编码蛋白质的。近年来的研究发现，它们在基因组中所占的比例随着物种进化水平的升高而增加，许多非编码 可以与蛋白、或 相互作用，参与多种细胞活动。非编码 根据长度分为 类：一类是小（，），长度一般在 ，包括小干扰（，）、蛋白结合（，）和（，）；另一类是长度在 个核苷酸以上的长链非编码（，）。其中，占非编码 的 以上，具有 尾巴与启动子结构，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式。长链非编码 在植物受到生物和非生物胁迫下的作用机制也是当下研究的热点之一。越来越多的研究证明 可以在表观遗传、转录及转录后等方面调控基因的表达，并广泛参与植物开花、雄性不育、营养代谢、生物与非生物胁迫等过程。基因表达决定了生物的多样性，基因转录的起始是基因表达的关键阶段，聚合酶与启动子的相互作用在基因转录起始中发挥重要作用，而启动子的结构影响它与 聚合酶的亲和力，进而影响基因表达的水平。启动子中所包含的特异性顺式作用元件对基因表达的组织特异性、作用强弱、时空表达的精确性及转录因子的结合程度都非常关键，深入分析基因启动子的顺式作用元件可以全面了解基因的功能。近年来，许多研究已经证明顺式作用元件在调控基因启动响应生物 非生物胁迫方面发挥重要的作用。例如：类转录因子可以调控启动子中含有（）元件的功能基因的表达，响应病原物、机械损伤或植物生长素的诱导；元件与 是基因中脱落酸（）信号的响应元件；结合位点、热胁迫（）、低温（）、抗病与逆境胁迫应答（）和增强转录水平等顺式作用元件，也被证明在植物受到逆境和非逆境胁迫影响时，可以诱导下游基因表达并激活相关代谢途径。真核生物的表达调控是多层次的，转录水平上的调控是植物基因表达调控的主要途径，启动子与转录因子的互作在转录水平调控中非常重要。转录因子通过特异结合目标基因启动子区的顺式作用元件激活或抑制转录，调控目标基因的时空表达。在已有的研究中，大部分集中于转录因子对编码蛋白基因的调控作用，而对 的调控作用的研究相对较少。香蕉（）为单子叶植物纲、姜目、芭蕉科、芭蕉属草本植物，是热带和亚热带国家重要的粮食和经济作物，因其口感香甜丝滑，富含蛋白质、碳水化合物、胡萝卜素、尼克酸及多种微量元素等受到人们的喜爱。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（，）引起的土传性植物真菌性病害，病害严重，防治困难，尤其对 类且基因型为 的香蕉（如目前主栽品种巴西蕉）造成了致命性的打击，香蕉枯萎病业已成为当前危害香蕉生产的主要病害。近年来，香蕉与枯萎病菌互作机制的研究越来越多，尤其是随着高通量测序技术和生物信息学的发展，发现了许多可能参与香蕉与枯萎病菌互作的，的功能研究对揭示互作机制将发挥重要的作用。基于前期转录组学的研究结果，我们选取了 个在枯萎病菌侵染后，在巴西蕉根部被显著上调表达的 命名为，初步证明过表达 的拟南芥对非生物胁迫更敏感，启动子序列、顺式作用元件及结合因子的研究对揭示该 的作用机制非常重要。本研究采用分段启动子研究的方法从 上游克隆了启动子全长 ，及 个互补片段（、和 ），通过在线序列分析软件对启动子不同片段的顺式作用元件进行分析；通过 报告基因研究 启动子对高盐和枯萎病菌粗毒素胁迫的响应模式，并初步确定核心启动子区域；利用酵母单杂交文库筛选 的调控因子，挖掘潜在参与 调控的转录因子，为揭示 在香蕉枯萎病菌互作中的功能和调控机制提供理论参考。材料与方法 试验材料及试剂巴西蕉（）由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供；尖孢镰刀菌古巴专化型 号小种（，）（）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所彭军老师惠赠；拟南芥野生型（）由本实验室保存。载体购于宝生物工程（大连）有限公司；植物表达载体 含有 和，具有潮霉素抗性，由本实验室保存；大肠杆菌感受态 和农杆菌 购于上海唯地生物技术有限公 第 期李文彬，等：香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选司；植物总 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、普通 酶购于天根生化科技有限公司；高保真酶 购于宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶、和 连接酶购于 公司；染色试剂盒购自 生物公司；培养基购于北京索来宝科技有限公司；酵母单杂交试剂盒、酵母培养所需的蛋白胨、酵母提取物、肌醇磷酸神经酰胺合成酶 抑制剂（，）、均购自 公司。酵母单杂交所用的二甲基亚砜购于 公司。引物合成及测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。启动子克隆及序列分析根据香蕉转录组和基因组数据序列信息，以巴西香蕉基因组 为模板，利用高保真酶扩增香蕉 上游 （）左右的序列。克隆鉴定成功后，根据 的序列信息，设计序列上互补的从端到 端的 个启动子片段，分别为（）、（）和（），使用 软件设计引物，个启动子片段的引物见表。表 所有启动子片段克隆用引物 启动子 正向引物 （）反向引物 （）所有片段通过 和 双酶切连接到表达载体 上替换 启动子，位于 基因的前端，质粒构建成功后用于拟南芥的转化。拟南芥的转化参照 等的方法，含有表达载体的阳性单克隆于新鲜菌液过液培养后 离心，收集菌体，重悬液（，蔗糖溶液）重悬（），然后加入拟南芥转化辅助液（，），点花法改进为浸花，即将拟南芥的花序浸入悬浮液 ，保证在花心上看到菌液。暗培养 后转至正常光照培养，即 、短日照 、长日照 。收种后，根据潮霉素抗性进行转基因植株的筛选，获得抗性植株，种植后收种，再根据孟德尔遗传法则，获得各片段转基因 代纯合株系各 株。尖孢镰刀菌浸染巴西蕉参照 等的方法，采用伤根后菌块包裹的方法进行接种，尖孢镰刀菌块侵染后 和 后，取伤口上部 以上的根部。蛋白染色及定量分析将拟南芥整株置于 离心管中，加入 染色液 ，避光染色 ，然后以 乙醇脱色至叶绿素完全脱掉，于基恩士（）超景深三维立体显微镜 下观察拍照。蛋白活性测定参照试剂盒进行。先制备标准曲线，用于检测样品蛋白含量。取新鲜样品提取蛋白，取 蛋白上清液，加入 预热的 提取缓冲液，再加入 底物，温浴。于、和 分别取混合反应物 加入 反应终止液，室温避光保存。于激发波长 、发射波长 下，测定不同时间点的荧光强度值，计算单位质量蛋白在单位时间的荧光强度变化值。尖孢镰刀菌粗毒素的提取参照许文耀等的方法，将 菌块于 （马铃薯和蔗糖 于水中煮 后，定容至 ，灭菌）中培养 ，离心 ，取上清液，用 滤膜过滤除菌，再用 滤膜过滤，镜检无孢子即为粗毒素，然后于冷冻干燥器中浓缩至 （浓缩 倍），后续备用。非生物胁迫处理高盐胁迫：拟南芥种子消毒后播种于含 的 培养基中，光照 ，发芽生长。尖孢镰刀菌粗毒素处理：拟南芥种子消毒后播种于含 粗毒素的 培养基中，光照 ，发芽生长 。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 酵母单杂交试验诱饵载体构建：启动子 和 与 载体以 和 双酶切后连接构建诱饵载体 和，转化大肠杆菌，提取阳性克隆进行 和双酶切鉴定，并进行测序。诱饵载体 和 转化酵母菌株：以 酶线性化诱饵载体和阳性对照质粒，转化 酵母感受态细胞，并取 菌液涂布于 的培养基上，培养 。利用 进行阳性克隆鉴定，取诱饵阳性克隆和阳性对照克隆，涂布于含不同浓度 的 培养基上，进行 抑制浓度的筛选。香蕉根高质量 文库构建：以受到枯萎病菌侵染 和 的香蕉根部为研究对象，提取总，加上 接头后，经 逆转录合成 第 链，利用长距离（）扩增技术合成双链，并用 琼脂糖凝胶电泳进行检测，最后用 层析柱进行纯化，参照 试剂盒说明书构建。启动子 互作蛋白筛选：将香蕉根 文库和 线性化质粒共转化阳性诱饵菌株 感受态细胞，将约 酵母细胞转化液按每皿 涂布于 （）培养基上，培养 ，挑选阳性克隆至 液体培养基扩大培养 后抽提质粒，并利用 的通用引物进行 鉴定，以 为阳性对照，以 空载质粒作为阴性对照。将阳性质粒测序，并进行功能注释，筛选出与 启动子 互作的蛋白。酶母单杂交点对点验证互作蛋白：根据香蕉基因组数据库中 基因序列设计 引物，以香蕉基因组 为模板克隆 基因，连接 载体进行测序鉴定，然后将鉴定的阳性克隆质粒和 空载进行双酶切，构建新的 载体，并进行测序鉴定，鉴定正确的阳性质粒分别转化含 和 的酵母感受态细胞，分别稀释 和 倍涂布于 （和 ）培养基，培养 。以阳性质粒 转化 菌株为阳性对照，空载体 转化 或 菌株为阴性对照。结果与分析 启动子顺式作用元件分析从香蕉根基因组 中扩增到 启动子片段 （图）（），序列信息与已有的基因组数据库（：）中的序列基本一致。利用 数据库（：）在线对该序列进行顺式作用元件分析，发现整个启动子中除包含多个控制转录起始的元件及增强子外，还含有多种调控响应外在信号的顺式作用元件，如：感知光照、干旱、伤害的响应元件，即、等；病原菌和抗逆响应相关的调控元件，即、等；响应脱落酸（）、分裂素、水杨酸（）和生长素等的作用元件，即、等；多个糖信号响应元件，即、等；转录因子结合位点，即、等。香蕉 启动子具备多种调控作用元件，而顺式作用元件和启动子的功能是密切相关的，说明该 可能通过参与激素代谢、传导、糖代谢和转导调控香蕉的生长发育以及对逆境胁迫进行应答。为进行启动子核心功能区域的鉴定，根据顺式作用元件的富集程度，我们分段克隆了序列上互补的 段启动子，从 端到 端依次为（）、（）和（）。比较启动子片段中含有的顺式作用元件及数量（表），发现 中总体顺式作用元件较少富集，其中含有较多的元件包括 个分裂素响应元件、个 转录增强子元件、个 蛋白结合位点、个光响应元件及 个病原菌响应元件。序列较长也集中分布有更多的顺式作用元件，包括 个分裂素响应元件（）、个、个启动子增强元件（）、个病原菌及水杨酸响应元件（）、个 响应元件、个 及多个光响应元件（）等。距离 最近，含有 个分裂素响应元件（）、个、个 蛋白结合位点（）和 个 元件。第 期李文彬，等：香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选图 的启动 子序列.表 启动子片段中主要顺式作用元件分析 序列名称 序列数量 功能 响应元件 诱导元件 真菌或创伤响应元件 分裂素响应元件 生长素响应元件 蛋白结合位点 识别顺式元件 元件 转录因子结合位点 蛋白结合位点 病原菌及 响应调控元件 病原菌及 诱导响应元件 病原菌诱导响应作用 病原菌诱导元件 病原菌诱导元件 、伤害及病原物响应信号，抗逆应答元件 伤诱导元件 光调控基因上游保守序列 生理节律，光调节 ，光响应元件 光诱导元件 启动子中的一般保守性调控元件 聚合酶识别位点 转录起始频率的重要元件 转录起始频率的重要元件 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 启动子对高盐和尖孢镰刀菌粗毒素的响应为了考察 启动子的核心区域，根据启动子分区情况，分别构建了、和 的 表达载体，载体构建的插入方式和位置见图，转化拟南芥后，获得各个启动子片段的 个拟南芥转基因 代纯合株系。图 启动子不同片段表达载体构建.：香蕉第 号染色体 ；：表达载体 ；：潮霉素基因；：左臂 ；：右臂 ；：终止子；：潮霉素基因启动子 ；：花椰菜花叶病毒 启动子 ；：葡萄糖苷酸酶基因 图 胁迫处理下 不同启动子片段拟南芥 的染色检测.：对照；：氯化钠处理 ；：尖孢镰刀菌粗毒素处理 下同 尖孢镰刀菌粗毒素是枯萎病菌中诱发香蕉根部病变的主要物质，会严重影响根部生长。以 尖孢镰刀菌粗毒素和高盐（）处理各转启动子片段的拟南芥株系，根据 染色情况来研究 对非生物胁迫的响应。拟南芥转基因纯合子 代种子直接播种于含有上述物质的 培养基上，于光照培养箱中培养，然后分别进行 染色。对照的植株染色较浅，盐胁迫下较深，而尖孢镰刀菌粗毒 素 处 理 后 的 子 叶 和 根 部 的 颜 色 最 深（图）。其中，和 驱动下 的染色情况相似，即整株都被染成蓝色；而 和 驱动下 的染色情况相似，根系颜色较深而子叶颜色较浅，并且在尖孢镰刀菌粗毒素处理后的 和 中，子叶中的颜色明显较高盐处理下的染色深。染色结果初步表明各个启动子片段可能对尖孢镰刀菌粗毒素的响应更强。对 蛋白活性进行定量测定以进一步证明各个片段启动子对不同胁迫的响应程度。高盐胁迫处理后，拟南芥中 启动下 蛋白平均活性是对照的 倍，而尖孢镰刀菌粗毒素处理后，启动下 蛋白平均活性是对照的 倍（图），个处理之间蛋白平均活性差异显著。进一步证明该启动子对尖孢镰刀菌粗毒素处理更敏感。对不同区段启动下 的活性进行分析，高盐和尖孢镰刀菌粗毒素处理后，启动下 蛋白的平均活性最低。其中，高盐处理后，启动下 的活性是 的 倍，与 启动下 的蛋白活性相似，是 的 倍；尖孢镰刀菌粗毒素处理后，启动下 的活性是 的 倍，启动下 的蛋白活性与 相似，是 的 倍（图）。蛋白定量数据与图 中的 染色的结果相一致，即 和 驱动下 的活性在 种胁迫中均相似且较高，表明 启动子可能含有 启动子的核心功能区域，即 启动子的核心功能区域可能存在于该基因上游 。第 期李文彬，等：香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选图 不同胁迫处理 不同启动子片段 活性的定量分析.不同处理 驱动下 的活性。数值为处理与对照的比值。不同启动子片段处理后 的活性。数值为不同处理下、与 的比值。，启动子结合因子的筛选经酵母单杂交试验筛选共获得 个阳性克隆。测序后进行 比对，筛选出小于期望值 的序列进行同源对比，获得 条潜在结合蛋白基因序列，对其进行功能注释，其中 条在、和 数据库中均没有注释。功能注释后显示结合蛋白包括 个核糖体蛋白、个脱氢酶、多个参与氧化还原反应的酶类（个过氧化物酶、个谷胱甘肽转移酶）等。其中 条注释为锌指蛋白家族的转录因子，通过香蕉基因组数据及同源克隆的方法获得 基因（）。对 基因编码蛋白的保守区分析发现，其属于具有双 锌指结构的锌指蛋白（图），该蛋白由 个氨基酸组成，相对分子质量为。图 编码的蛋白及结构域分析.星号代表 结构和保守氨基酸。灰色部分代表保守的 锌指结构区域。分别将 转入含 和 的酵母感受态细胞，取不同稀释倍数（和 倍）的感受态细胞涂布于 （和 ）培养基上，培养 ，结果显示，转化菌可以在 （和 ）培养基上正常生长，而转化空载 的 和 不能生长，阳性对照 质粒转入含 的酵母感受态，结果阳性对照可以正常生长（图），表明 蛋白与 启动子 之间相互作用激活了报告基因 的表达，从而证明 与启动子 存在互作。蛋白与启动子 也可以结合，证明 启动子的核心序列确实存在于 中，即存在于 上游 。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 启动子与转录因子 互作.启动子 与 在 （）培养基上的互作。（）；启动子 与 在 （）培养基上的互作。（）：（）（）（）；：（）；：（）（）讨论香蕉是重要的果粮兼用作物，在全球农产品贸易中仅次于小麦、玉米和大豆，分布在全球南北回归线之间的 多个国家，但是目前主栽品种广泛受到尖孢镰刀菌的危害，香蕉枯萎病大面积暴发将为香蕉产业带来毁灭性的打击。尖孢镰刀菌的致病机制及植物的抗性响应策略是植物与病原菌互作研究的重点，尤其是 在植物与病原菌互作中的作用越来越受到人们的重视，是近年研究的热点之一。本研究中，启动子对尖孢镰刀菌的处理非常敏感，其中 及两端缺失的启动子片段 对胁迫响应更敏感，中含有较多的顺式作用元件，包括 和分裂素响应元件（）、病原菌及 响应元件（）、蛋白结合识别元件及光诱导响应元件。研究表明，为一类包含 家族的顺式作用元件，能够应答一些环境因子，如、光照、紫外线、伤害及病原物信号。种子或果实特异性启动子 和 等大部分受激素的诱导，其启动子区均含有 应答元件和 元件等。另外，启动子区含 的基因可与 和 蛋白结合，在植物防御反应中发挥着重要的作用。本研究中，上较多的 元件说明该基因可能受到激素调控，也可能在香蕉受到胁迫时与特异性转录因子结合，进而激活相关代谢途径，在香蕉与病原菌互作中发挥重要的作用。另一类顺式作用元件 与真菌诱导基因的表达密切相关。例如：欧芹病程相关蛋白 和 的启动子中均含有 个 顺式作用元件，突变该核心序列后启动子的真菌诱导活性丧失；烟草几丁质酶基因 及玉米 基因的启动子上都鉴定到该顺式作用元件。通过与 蛋白特异性结合，在植物防御过程中发挥着重要的作用。上成簇存在的 序列响应多种病原菌激发子，被病原菌诱导表达水平发生变化。基因启动子区的 顺式作用元件与植物对病原菌的响应相关，如 等在葡萄中克隆到 个受白粉病和赤星病诱导表达的 诱导型启动子，发现其序列中含 等特殊的元件。上多个 蛋白识别元件说明该基因与病原菌的侵染响应相关，这对下游病程相关基因的启动可能也是至关重要的。我们将核心启动子区锁定在基因上游 ，证明 对光照、激素及病菌胁迫都有响应，对该基因在香蕉与病原菌互作中的功能研究非常重要。但是，哪些关键基序是 发挥作用所必需的还需进一步的研究。通过酵母单杂交系统筛选到 个与关键区域结合的 型锌指蛋白。蛋白可能通过核心功能区域的协助来识别启动子，参与 的功能调控。锌指蛋白根据保守的半胱氨酸和组氨酸的组合方式分为 （）、和 等亚家族。其中具有双锌指结构的 型锌指蛋白，在植物生长发育、逆境应答等生理过程中发挥着重要的调控作用，如提高耐盐性、抗冻性和抗旱性，参与活性氧的清除及激素传导。研究表明启动子区的（）重复序列、或 都可能是 型锌指蛋白的结合位点，而 中在、和 处均有类似序列，这些序列可能协助 蛋白对启动子的识别，进而调控 的表达。但是 的二级、三级结构复杂，在、基因转录以及 第 期李文彬，等：香蕉长链非编码 启动子区域分析及上游调控因子筛选蛋白水平都可能发挥重要的作用，且调控机制非常繁杂。本研究证明 参与 上游的调控，为进一步揭示 的功能奠定了重要的基础。参考文献：，：，（）：朱玉贤，李毅 现代分子生物学 版 北京：高等教育出版社，：，：，：（），（）：，：，：，：，（）：，：徐园园，李竹帛，王惠玉，等 不结球白菜 基因的克隆与功能分析 南京农业大学学报，（）：，（）：（），（）：刘波，黄俊生，肖荣凤 尖孢镰刀菌生物学及其生物防治 北京：科学出版社，：，：，：（），（），（）：，：，（）：许文耀，兀旭辉，杨静惠，等 香蕉假茎细胞对枯萎病菌不同小种及其粗毒素的病理反应 植物病理学报，（）：，（）：（），（）：，：纪璐璐，马小军，高教琪，等 多形汉逊酵母启动子的挖掘 生物加工过程，（）：，（）：（），：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 ，（）：孔维龙，于坤，但乃震，等 甜菜 转录因子全基因组鉴定及其在非生物胁迫下的表达分析 中国农业科学，（）：，（）：（），（）：，（）：，：，（）：，（）：责任编辑：刘怡辰