线粒体12S与COI条形码对海洋鱼类的鉴定差异_陈治.pdf

本研究基于 145 种常见海洋鱼类比较了使用 12S 与 COI 条形码鉴定物种的差异。结果如下:(1)145 种鱼类共测得 12S 序列 528 条，所测鱼类基于 12S 条形码的种内遗传距离在 0 0 006 8 之间，最小种间遗传距离为0 0 416 2;有 7 种鱼类的种内遗传距离过大(大于 0 005 5)，且 NJ 系统发生树中存在不同鱼类聚于同一组内，种与种之间不分界的现象。(2)145 种鱼类共测得 COI 序列 686 条，所测鱼类基于 COI 条形码的种内遗传距离在0 0 004 9 之间，种间遗传距离均大于 0 02，且至少为种内遗传距离的 15 28 倍;NJ 系统发生树显示，各鱼类聚于不同组内，种与种之间分界明显。结果表明，基于 12S 基因的鱼类 DNA 条形码的物种鉴定存在物种注释假阴性或假阳性风险，应尽可能考虑使用 COI 条形码，以提高物种鉴定的准确性。关键词:海洋鱼类;12S rRNA 基因;细胞色素 C 氧化酶亚基 I;条形码;物种鉴定中图分类号:S932 4文献标识码:A文章编号:2096 3122(2023)02 0010 07DOI:10 13307/j issn 2096 3122 2023 02 020引言DNA 条形码技术是利用一段较短的 DNA 序列实现快速、准确鉴定物种的工具，近年来已成为生物类群的研究热点，并逐步被引进到各个领域1。理论上任何基因(如线粒体、叶绿体、核基因等)均可作为DNA 条形码片段，但受制于扩增子变异速率、引物通用性等因素的制约，常用的鱼类 DNA 条形码主要有线粒体 12S rRNA(以下简称 12S)、细胞色素 C 氧化酶亚基 I(Cytochrome oxidase I;以下简称 COI)等。近年来，结合第一代(Sanger)、第二代(Next-generation sequencing，NGS)测序技术，12S、COI 条形码广泛应用于海洋鱼类等水生生物多样性调查2 3。然而，目前两种条形码尚有许多环节需要完善，如参考数据库不够全面准确4、条形码变异速率缺乏系统研究等5。为了提高后续基于 DNA 条形码技术的鱼类多样性调查结果的准确性，本研究比较了使用 12S 与 COI 条形码鉴定海洋鱼类的差异。1 材料与方法1 1 材料鱼类样品收集始于 2019 年 9 月，样品主要来源于青岛、舟山、三亚等鱼市场。形态鉴定主要参考黄渤海鱼类调查报告、东海鱼类志、南海鱼类志、日本鱼类检索等进行6 9。鉴定后的样品立即进行编号拍照、取肌肉等工作。肌肉样品加入浓度为 95%的酒精后 20 保存备用。1 2 方法1 2 1 样品 DNA 提取剪取豆粒大小的肌肉，将吸附的酒精吸干后，放入离心管。总 DNA 的提取步骤参考陈治10 报道的方法。将提取好的 DNA 样品风干至酒精挂壁，加入100 L 水溶解(半天)，置于4 冰箱待用或长期保存于01陈治等:线粒体 12S 与 COI 条形码对海洋鱼类的鉴定差异2023 年第 2 期20。1 2 2 样品 PCR 扩增将按照上述方法提取的鱼类 DNA 作为模板，分别使用硬骨鱼类线粒体 12S、COI 通用引物进行对应条形码片段扩增。引物序列分别参考 Miya 等11 6和 Ivanova 等12 的研究报道。PCR 反应体系和步骤见表 1。扩增后的序列送华大基因进行双末端测序。表 1本研究中 12S 与 COI 片段的 PCR 反应体系和反应步骤PCR 反应体系DNA 模板(1 L)超纯水(17 5 L)10 buffer(2 5 L)DNTPs(2 L)正向引物 F(1 L)、反向引物 R(1 L)rTaq(0 15 L)PCR 反应步骤步骤 195，5 min95，30 s步骤 2，40 个循环58，30 s72，30 s步骤 372，10 min步骤 44 1 2 3 DNA 条形码分析利用 DNAstar 软件包对测序后的序列进行校对。序列校对、碱基含量分析、系统发育树构建的具体操作及参数设置参考柳淑芳等 13 的研究。使用 SPSS 20 软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，方差齐性检验值用 F 表示;差异显著系数用 P 值表示(P 005，存在显著差异;P 001，存在极显著差异)14。2 结果与分析2 1 样品收集情况截至 2022 年 6 月 8 日，本研究共采集鱼类 145 种，部分代表性物种名单见表 2。表 2本研究中代表性海洋鱼类线粒体条形码种内与种间遗传距离(平均值 标准差)种名COI 序列数目 基于 COI 条形码的种内遗传距离基于 COI 条形码的种间遗传距离虎纹猫鲨10 191 7 0 461(0 343 8 0 041 5)中国团扇鳐290 003 60 117 5 0 541 2(0 4 0 046 3)棘鼬鳚80 004 90 222 6 0 455 2(0 306 3 0 039 7)细条银口天竺鲷150 003 90 192 7 0 397 1(0 287 9 0 038 5)黑边银口天竺鲷160 002 30 103 1 0 436(0 290 8 0 047 7)史密斯氏银口天竺鲷隐存种80 003 10 103 1 0 453 4(0 290 5 0 050 8)小黄鱼40 0040 152 1 0 461 9(0 356 1 0 048 3)棘头梅童鱼300 152 1 0 472 6(0 324 1 0 047 6)鳞鯻120 004 90 206 8 0 452(0 296 1 0 047 3)细刺鱼30 003 70 195 8 0 430 2(0 300 5 0 047 5)四角唇指40 003 30 063 1 0 417 2(0 298 4 0 045 1)花尾唇指300 063 1 0 405 6(0 313 5 0 043 7)六丝钝尾虾虎鱼30 0010 060 1 0 417 6(0 333 3 0 043)斑尾复虾虎鱼30 0030 073 1 0 429 1(0 335 8 0 043 7)黄鳍刺虾虎鱼30 002 80 246 0 485 5(0 369 1 0 034 5)中华栉孔虾虎鱼20 002 20 163 9 0 414 9(0 313 8 0 034 7)11第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报表 2(续)种名COI 序列数目 基于 COI 条形码的种内遗传距离基于 COI 条形码的种间遗传距离三色菖鲉40 001 20 050 8 0 417 2(0 283 3 0 044 1)虻鲉30 003 70 237 3 0 438 7(0 334 7 0 036 5)大泷六线鱼400 163 9 0 420 4(0 323 0 036 4)斑头鱼30 002 20 205 2 0 430 4(0 304 4 0 041 1)绿鳍马面鲀30 003 10 052 9 0 439 3(0 299 9 0 053 5)密斑马面鲀30 0020 029 8 0 453 9(0 295 4 0 053 4)黄鳍马面鲀40 001 10 029 8 0 473 6(0 319 4 0 058 1)横纹东方鲀50 000 60 034 0 452(0 298 5 0 044 6)黄鳍东方鲀20 002 10 034 0 437 9(0 294 9 0 043 2)种名12S 序列数目基于 12S 条形码的种内遗传距离基于 12S 条形码的种间遗传距离虎纹猫鲨10 132 5 0 927 7(0 715 5 0 179 9)中国团扇鳐290 006 80 034 0 805 8(0 639 3 0 164 5)棘鼬鳚400 246 5 0 885 1(0 414 4 0 117 6)细条银口天竺鲷30 005 30 0 705 8(0 246 5 0 128 3)黑边银口天竺鲷30 005 20 0 705 8(0 246 5 0 128 3)史密斯氏银口天竺鲷隐存种10 0 705 8(0 246 5 0 128 3)小黄鱼60 004 70 0 730 5(0 200 9 0 120 3)棘头梅童鱼40 003 20 0 730 5(0 200 9 0 120 3)鳞鯻120 004 70 060 6 0 730 5(0 224 4 0 106 3)细刺鱼30 003 50 024 7 0 689 7(0 194 1 0 107 5)四角唇指40 001 80 0 715 8(0 235 7 0 111 7)花尾唇指30 000 50 0 715 8(0 235 7 0 111 7)六丝钝尾虾虎鱼30 005 60 185 2 0 914 5(0 348 0 140 3)斑尾复虾虎鱼30 005 60 043 3 0 893 2(0 313 1 0 150 8)黄鳍刺虾虎鱼30 006 20 043 3 0 914 5(0 317 6 0 153 3)中华栉孔虾虎鱼20 005 60 080 6 0 951 5(0 313 1 0 143 3)三色菖鲉40 0060 025 1 0 730 4(0 268 1 0 104 8)虻鲉30 005 70 127 3 0 967(0 420 3 0 111 6)大泷六线鱼500 0 702 2(0 239 3 0 120 1)斑头鱼300 0 702 2(0 239 3 0 120 1)绿鳍马面鲀30 003 10 0 688 1(0 245 0 116 2)密斑马面鲀300 0 688 1(0 245 0 116 2)黄鳍马面鲀40 000 70 0 688 1(0 245 0 116 2)横纹东方鲀400 0 700 4(0 314 1 0 150 9)黄鳍东方鲀700 0 700 4(0 314 1 0 150 9)2 2 12S 条形码分析本研究中，145 种鱼类共测得 12S 序列 528 条(表 2)。统一去引物后序列长度为 165 183(170 35 347)bp，其中硬骨鱼类序列长度为 165 178(169 64 2 1)bp，软骨鱼类序列长度为 179 183(181 11 21陈治等:线粒体 12S 与 COI 条形码对海洋鱼类的鉴定差异2023 年第 2 期136)bp。基于全部 12S 序列的邻接系统发育分析(Neighbor-joining，NJ)结果显示，145 种鱼类的种内遗传距离在 0 0 006 8 之间，平均遗传距离为 0 002 1(表 3)。其中有 46 种鱼类的种内遗传距离为 0，但同时有 7 种鱼类的种内遗传距离大于 0 005 5(表 2)。此外，NJ 构树结果显示，145 种鱼类的平均种间遗传距离为 0 194 1 0 715 5(0 303 5 0 098 8)(表 3)。但有 14 种鱼类的种间遗传距离为 0(如四角唇指鲶与花尾唇指，横纹东方鲀与黄鳍东方鲀)(表 2)。这部分鱼类存在种与种之间无法区分的现象(注:系统发育树过大，未展示)。表 3基于 12S 条形码的 145 种鱼类遗传距离检测指标遗传距离或比值种内遗传距离0 0 006 8(0 002 1 0 002)最小种间遗传距离0 0 416 2(0 081 1 0 067 9)最小种间遗传距离/种内遗传距离0 128 470 2(24 596 9 24 726 3)最大种间遗传距离0 556 6 0 990 2(0 770 1 0 101 1)最大种间遗传距离/种内遗传距离118 621 1 413 570 29(323 570 1 250 968 9)平均种间遗传距离0 194 1 0 715 5(0 303 5 0 098 8)平均种间遗传距离/种内遗传距离40 404 3 472 365 2(121 488 6 92 191 7)2 3 COI 条形码分析根据 Hebert 等15 316的 DNA 条形码理论:由于密码子的简并性，第三位碱基通常都不受自然选择作用，因此理论上只要考虑45 个碱基就可以获得近10 亿种可选择的编码序列;而实际300 bp 长度的 COI 片段已经足够分析绝大多数的物种。本研究 145 种鱼类共测得 COI 序列 686 条(表 2)。其中有个别序列起始、末尾双端峰图不理想，为保证序列准确性，统一截齐后序列长度为 499 bp。基于全部 COI 序列的 NJ 构树结果可见，145 种鱼类的种内遗传距离在 0 0 004 9 之间(表 4)，平均遗传距离为 0 002 1，种内遗传距离均在 0 02 以下，其中有 38 种鱼类的种内遗传距离为 0。基于 COI 条形码的种间遗传距离均大于 0 02，最小种间遗传距离为 0 029 8(出现在密斑马面鲀和黄鳍马面鲀间)(表 2);且全部 145 种鱼类的种间遗传距离至少为种内遗传距离的 15 28 倍(表 4)。NJ 系统发生树显示，各鱼种聚于不同组内，种与种之间分界明显(注:系统发育树过大，未展示)。表 4基于 COI 条形码的 145 种鱼类遗传距离检测指标遗传距离或比值种内遗传距离0 0 004 9(0 002 1 0 001 6)最小种间遗传距离0 029 8 0 314 8(0 184 1 0 066 1)最小种间遗传距离/种内遗传距离15 284 6 117 567 8(59 550 4 25 550 8)最大种间遗传距离0 388 8 0 541 9(0 448 9 0 033 4)最大种间遗传距离/种内遗传距离91 392 715 443 3(170 823 9 88 429 1)平均种间遗传距离0 277 3 0 420 8(0 319 8 0 025 5)平均种间遗传距离/种内遗传距离59 860 9 472 398 5(120 692 1 61 235 1)2 4 12S 与 COI 条形码的比较比较全部 145 种鱼类的遗传距离，结果表明:COI 与 12S 条形码除种内遗传距离、平均种间遗传距离/种内遗传距离两项指标不存在显著差异外，其余指标均存在显著或极显著差异(表 5)。31第 30 卷第 2 期海南热带海洋学院学报表 5本研究 COI 与 12S 两种 DNA 条形码遗传距离差异显著性比较检测指标FP种内遗传距离0 009 40 922 7最小种间遗传距离148 7417 89 1028最大种间遗传距离1 087 931 80 1099平均种间遗传距离4 006 10 046 2种间遗传距离标准差2 310 834 936 2 10139种间遗传距离变异系数1 309 938 818 8 10109最小种间遗传距离/种内遗传距离87 249 77 60 1017最大种间遗传距离/种内遗传距离30 539 91 29 107平均种间遗传距离/种内遗传距离0 175 10 676 2注:F 为方差齐性检验值;P 为差异显著系数(P 0 05，差异显著;P 0 01，差异极显著)。两种条形码的种内遗传距离(表 2)分布规律也存在差异。COI 条形码的种内遗传距离全部分布于低数值组(图 1)。但 12S 条形码的种内遗传距离分布范围更广，特别是有 7 种鱼类的种内遗传距离在 0 55以上(0 56 0 7)。图 1 表明，12S 条形码存在将地理亚种(种群)误鉴定为种的假阳性风险。组间距:0 000 5(0 05%)图 1145 种鱼类的种内遗传距离分布与种内遗传距离分布规律类似，最小种间遗传距离(表 2)分布结果(图 2)显示，基于 12S 条形码的最小种间遗传距离分布范围更广(图 2)。COI 条形码的最小种间遗传距离均大于 0 02，但有 31 种鱼类的12S 最小种间遗传距离小于或等于 0 02，甚至为 0。图 2 表明，12S 条形码存在将不同种误鉴定为同一种的假阴性风险。组间距:0 01(1%)图 2145 种鱼类的种间遗传距离分布3 讨论加拿大生物学家 Hebert15 318在 2003 年提出 DNA 条形码的概念时指出:当个体间遗传距离大于 0 02时，则这两个个体为不同的物种;当个体间遗传距离小于 0 02 时，则为同一物种，即著名的“0 02”原则。41陈治等:线粒体 12S 与 COI 条形码对海洋鱼类的鉴定差异2023 年第 2 期Ward 等16 以全球 2 000 多种鱼类为分析对象，指出不同鱼类群体间的遗传差异绝对值并不一致，应考虑使用“群体间/群体内”的相对比值作为定种标准，即比值“群体间遗传距离/群体内遗传距离”大于 10 时，则这两个群体为不同的物种，反之则为同一物种，此即“10”原则。本研究中的 145 种鱼类 DNA 条形码的分析结果表明:所有鱼类 COI 条形码种间遗传距离均大于 0 02 且至少为种内遗传距离的 15 28 倍，均同时符合“0 02”和“10”原则。基于 COI 条形码的 NJ 系统发生树各物种独占一枝，种与种之间界限明显，全部鱼种均可得到有效区分。但 12S 条形码结果与 COI 差异较大，除种内遗传距离、平均种间遗传距离/种内遗传距离两项指标不存在显著差异外，其余 6 项指标均存在显著或极显著差异。丛林林等17、肖宝华等18、Frye 等19 分别研究了鲆鲽目、石珊瑚、啮齿类的分类鉴定，也发现 12S 条形码难以对目标类群完全区分。姜芳燕等20、刘明中等21 研究了长尾大眼鲷、索氏桃花水母的遗传多样性，表明 COI 条形码可以有效用于目标物种的鉴定及遗传多样性分析。本研究结果与上述研究的结论一致 在计算种内、种间遗传距离时，COI 条形码均可有效使用，但 12S 条形码却存在假阴性或假阳性风险，需要 COI 条形码辅助进行物种鉴定。12S 条形码假阴性的原因可能是该基因整体进化速率低于 COI，更适合科(Family)及科以上阶元的系统发育关系研究。本研究中的 145 种鱼类中有多个鱼种的种间遗传距离为 0，Gantner 等22、李云臻等23 的研究结果也建议，低阶元物种的鉴定及系统发育研究慎重使用 12S 基因。然而，12S 条形码片段扩增子内分布有多个茎环结构(Stem-loop structure)11 8，线粒体基因在茎区和环区受到的选择压力不同 茎区比环区更加保守，环区的变异速率约为茎区的 3 8 倍，且大量存在插入缺失24 25。因此，12S 条形码虽然整体进化速率低于 COI，但却存在条形码高度变异与高度保守并存的现象。本研究中有 7 种鱼类的种内遗传距离大于 0 005 5，可能就是因为这些鱼类不同个体的条形码环区发生了变异，这种现象导致了 12S条形码出现了部分鱼类鉴定结果假阳性的错误。陈治等26 对海南岛淡水鱼类 DNA 条形码参考数据库进行初步构建及比较分析，结果显示，12S 条形码的种内、种间遗传差异的阈值约为 0 005 6，因此近缘鱼类的鉴定不适合使用 12S 条形码。相比之下，COI 条形码属于蛋白质编码基因，密码子第三位点的进化选择压力很小，因此条形码变异速率稳定，较少出现物种鉴定假阴性和/或假阳性错误。4 结论为了提高基于 DNA 条形码技术的鱼类多样性调查结果的准确性，本研究基于 145 种常见海洋鱼类比较了 12S 与 COI 条形码鉴定海洋鱼类物种的差异，结果表明，基于 12S 基因的海洋鱼类 DNA 条形码研究存在物种注释假阴性或假阳性风险，应尽可能考虑使用 COI 条形码以提高物种鉴定的准确性。参考文献:1THOMSEN P F，KIELGAST J，IVERSEN L L，et al Monitoring endangered freshwater biodiversity using environmental DNA J Molecular ecology，2012(11):2565 2徐念，常剑波 长江中下游干流环境 DNA 样本鱼类物种检测的初步研究 J 水生态学杂志，2016(5):49 3赵梦迪 利用环境 DNA 分析冬季中国东黄海水域的鱼类多样性 D 上海:上海海洋大学，2017 4马鸿娟，KATHRYN S，马利民，等 环境 DNA 及其在水生生态系统保护中的应用 J 生态学杂志，2016(2):516 5ZHANG S，ZHAO J，YAO M A comprehensive and comparative evaluation of primers for metabarcoding eDNA from fish J Methods in ecology and evolution，2020(12):1609 6张春霖，成庆泰，李思忠，等 黄渤海鱼类调查报告 M 北京:科学出版社，1955 7朱元鼎，张春霖，成庆泰，等 东海鱼类志 M 北京:科学出版社，1963 8中国科学院动物研究所 南海鱼类志 M 北京:科学出版社，1962 9NAKABO T Fishes of Japan with pictorial keys to the species M English edition，Tokyo:Tokai University Press，2002 10陈治 浙江近海鱼类多样性 eDNA 调查方法的建立与应用 D 青岛:中国海洋大学，2019:151 11MIYA M，SATO Y，FUKUNAGA T，et al MiFish，a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA 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20姜芳燕，韩冰冰，李语，等 长尾大眼鲷 COI 基因序列的遗传多样性分析 J 海南热带海洋学院学报，2020(2):6 21刘明中，张清凤，申志新，等 海南岛索氏桃花水母的遗传学鉴定 J 海南热带海洋学院学报，2021(5):18 22GANTNER S，ANDERSSON A F，ALONSO-SEZ L，et al Novel primers for 16S rRNA-based archaeal community analyses inenvironmental samples J Journal of microbiological methods，2011(1):12 23李云臻，李俊，徐伟江，等 基于 12S rDNA 和 16S rDNA 部分序列对澜沧江流域景洪段 5 种鲃亚科(Barbinae)鱼类的进化地位研究 J 云南师范大学学报(自然科学版)，2017(5):40 24郭宪光 中国鮡科鱼类分子系统发育和石爬鮡属物种有效性的研究 D 重庆:西南师范大学，2003:63 25徐裕海 中国猛禽类 28 种鸟类线粒体分子进化研究 D 大连:辽宁师范大学，2004:16 26陈治，蔡杏伟，张清凤，等 海南岛淡水鱼类环境 DNA 宏条形码参考数据库的初步构建及比较分析 J 南方水产科学，2022(3):2(责任编辑:何节玉)Differences in the Identification of Marine Fish byMitochondrial 12S and COI BarcodesCHEN Zhi1，GAO Tianxiang2(1 Key Laboratory of Utilization and Conservation for Tropical Marine Bioresources，Ministry of Education，Hainan Tropical Ocean University，Sanya Hainan 572022，China;2 College of Fisheries，Zhejiang Ocean University，Zhoushan Zhejiang 316022，China)Abstract:The differences between 12S and COI barcoding in species identification based on 145 common marine fish specieswere compared The results were as follows:1)a total of 528 sequences of 12S were detected in 145 species The intraspecific geneticdistance of all the fish based on 12S barcode ranged from 0 to 0 0068，the minimum interspecific genetic distance ranging from 0 to0 4162 and the intra-species genetic distances of 7 species were too large(0 005 5)In NJ phylogenetic tree，some interspecific fi-shes clustered in the same group without demarcation between species 2)A total of 686 sequences of COI were detected The in-traspecific genetic distance of all the fish based on COI barcoding ranged from 0 to 0 0049，and the interspecific genetic distance wasabove 0 02 and at least 15 28 times of the intraspecific genetic distance NJ phylogenetic tree showed that interspecific fishes clus-tered in different groups，and the boundary between species was obvious The results of this study suggest that fish DNA barcodingstudies based solely on 12S gene have the risk of false negative and/or false positive species annotation，and the use of barcodingfragments such as COI should be considered whenever possible to improve the accuracy of species annotationKeywords:marine fish;12S;COI;DNA barcoding;species identification61