痛泻要方合四逆散对糖尿病的治疗效果及作用机制研究_贾晓蕾.pdf

北京中医药 2023 年 2 月第 42 卷第 2 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，February，2023，Vol.42，No.2痛泻要方合四逆散对糖尿病的治疗效果及作用机制研究贾晓蕾1 孙宏峰2（1.北京中医药大学第三附属医院综合内科，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院内分泌科，北京 100078）【摘要】目的探讨痛泻要方合四逆散对糖尿病小鼠的治疗作用及机制。方法将24只KKAy小鼠按照随机数字表分为模型组及低、中、高剂量中药组4组，各6只；另设6只C57BL/6J小鼠作为空白组。低、中、高剂量组分别给予中药生药量1.84、3.68、5.52 g/（kg d），空白组、模型组予等体积蒸馏水，1次/d，连续给药4周。比较各组体质量、空腹血糖（FBG）、胰岛素（INS）、胰岛素抵抗指数（HOMAIR）、皮质酮（CORT）变化；Western blotting法检测各组海马组织11羟基类固醇脱氢酶（HSD1）、糖皮质激素受体（GR）蛋白表达水平变化。结果与空白组比较，干预第0、1、2、3、4 周模型组体质量高（P0.05）；第3、4周时，低、中、高剂量组体质量低，差异有统计学意义（P0.05）。与空白组比较，干预第0、1、2、3、4周模型组FBG高（P0.05）；第4周，高剂量组FBG水平低，差异有统计学意义（P0.05）。与空白组比较，模型组INS水平及HOMAIR高（P0.05）；中、高剂量组INS水平及HOMAIR低，差异有统计学意义（P0.05）；中、高剂量组CORT低，差异有统计学意义（P0.05）。与空白组比较，模型组海马组织11HSD1蛋白表达高、GR蛋白表达低，差异有统计学意义（P0.05）；中、高剂量组海马组织11-HSD1蛋白表达低、GR蛋白表达高，差异均有统计学意义（P0.05）。结论痛泻要方合四逆散能改善2型糖尿病小鼠FBG水平和胰岛素抵抗状态，其作用机制可能与降低皮质酮含量及调控海马组织11HSD1及GR蛋白表达有关。【关键词】2型糖尿病；痛泻要方；四逆散；11羟基类固醇脱氢酶；糖皮质激素受体DOI：10.16025/j.1674-1307.2023.02.0102 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM）是临床最常见的慢性终身性疾病之一1。预计到2040 年，全球将有 6.42 亿人罹患 T2DM2。胰岛素抵抗（IR）是T2DM发生发展的主要因素，也是多种代谢相关疾病的共同发病机制3。研究4-6表明，抑郁能增加 IR和 T2DM的患病风险。抑郁通过神经内分泌免疫机制影响糖脂代谢，主要是下丘脑垂体肾上腺轴（HPA）的激活，表现为皮质醇升高和葡萄糖利用率降低，从而诱发糖尿病及其并发症发生7。海马11羟基类固醇脱氢酶（HSD1）作为海马糖皮质激素（GC）的代谢酶，具有还原酶特性，是T2DM靶标，可将非活性GC转化为生物活性形式，从而增加 GC 浓度8。此外，研究9表明GC可促进海马神经元11HSD1的表达。西医干预IR以口服二甲双胍、噻唑烷二酮（TZD）等药物为主，但是不良反应较大10。糖尿病属中医学“消渴”范畴，IR作为消渴病发病的重要机制，在益气养阴的基础上，采用疏肝、健脾、化瘀等方法治疗或改善IR，取得了一定的疗效。中医疏肝健脾法能够改善糖尿病患者相关症状并具有一定的降糖作用11，伤寒论经典方剂四逆散及丹溪心法中的痛泻要方是疏肝健脾的代表方。四逆散能明显改善T2DM患者糖脂代谢紊乱12；痛泻要方加味能明显提高T2DM 实验研究 基金项目：北京中医药大学青年教师项目（2018-JYBZZ-JS176）作者简介：贾晓蕾，女，37岁，硕士，主治医师。研究方向：中医药防治糖尿病及其并发症。通信作者：孙宏峰，E-mail：引用格式：贾晓蕾，孙宏峰.痛泻要方合四逆散对糖尿病的治疗效果及作用机制研究 J.北京中医药，2023，42（2）：168-172.168北京中医药 2023 年 2 月第 42 卷第 2 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，February，2023，Vol.42，No.2腹泻患者的临床疗效，降低空腹血糖（FBG）水平等13。本研究采用动物实验方法观察痛泻要方合四逆散对KKAy小鼠11HSD1及糖皮质激素受体（GR）的影响，探索疏肝健脾法对 T2DM 及 IR 的调控作用。1 实验材料 1.1动物SPF 级 雄 性 KK Ay 小 鼠 24 只，68 周 龄，体质量（225）g；同龄雄性 C57BL/6J 小鼠 6 只，体质量（225）g，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）20140004。饲 养 于 北 京 中 医 药 大 学 隔 离 动 物 房，温 度（232）、相对湿度（5510）%、光照循环，小鼠摄食饮水自由。实验过程符合动物伦理学标准。1.2药物痛泻要方合四逆散，组成：柴胡、白芍、枳壳、炒白术、陈皮、防风、甘草（药物质量比4446322），颗粒剂。实验前用蒸馏水配制成溶液，冰箱4 保存；灌胃前取出，放置室温后使用。1.3主要试剂小鼠单克隆 11HSD1 抗体（美国 Santa Cruz公 司，sc-518168），小 鼠 单 克 隆 Glucocorticoid Receptor抗体（美国Santa Cruz公司，sc-393232），总蛋白 BCA 提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，20190429）等。1.4主要仪器小型垂直电泳槽（美国 Bio Rad 公司，Mini PROTEAN Tetra Cell），小型湿转电泳槽（美国Bio Rad 公司，Mini Trans-Blot Cell），电泳仪（美国Bio Rad 公司，PowerPacTM Universal Supply），凝胶化 学 发 光 成 像 分 析 系 统（法 国 Vilber 公 司，FUSION FX6 XT），全 自 动 生 化 分 析 仪（日 本Olympus 公司，AU2700+IS），电子天平（美国OHAUS公司，DV215CD）。2 实验方法 2.1动物分组及药物干预24只KKAy小鼠，采用普通饲料适应性喂养7 d，均经尾尖血2次测随机血糖13.9 mmol/L。按照随机数字表法分为模型组及低、中、高剂量中药组，各6只；另设6只C57BL/6J小鼠作为空白组。依据药理实验方法学及课题组前期实验结果14，低、中、高剂量组分别给予中药生药量1.84、3.68、5.52 g/（kg d），空白组、模型组予等体积蒸馏水，每 10 g 体质量给予 0.1 mL 体积药量，灌胃1次/d，连续给药4周。2.2观察指标及方法2.2.1体质量测量：干预第 0、1、2、3、4 周分别采用电子天平对小鼠进行称重，并记录其体质量。2.2.2FBG、胰岛素（INS）、胰岛素抵抗指数（HOMAIR）、皮质酮（CORT）检测：干预第 0、1、2、3、4 周分别通过鼠尾静脉取血检测小鼠FBG水平；干预第4周末次给药后对小鼠禁食不禁水，待8 h后通过鼠尾静脉测定FBG；随即对小鼠进行摘眼球取血，静置，4 离心（3 000 r/min、半径13.5 cm）15 min，采用放射免疫法检测空腹血清 INS。计算 HOMAIR 值，HOMAIR=FBG空腹胰岛素/22.5。采用双抗体夹心ELISA法检测外周血CORT。2.2.3 Western blotting 法 检 测 海 马 组 织11HSD1、GR蛋白表达：干预第4周末次给药取血后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，随即剪开小鼠头皮暴露头部，待拨开脑壳后，于大脑皮层底部暴露并收集海马组织，收集的海马组织通过组织研磨、裂解、变性等获取蛋白，并通过BCA蛋白试剂盒进行定量。12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过电转膜仪将蛋白转印到至酸纤维素膜（NC膜）上，用10%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入稀释后一抗（11HSD1抗体稀释比例1500，Glucocorticoid Receptor 抗体稀释比例 11 000），4 过夜。第 2 日用 TBST 洗涤 3 次，每次洗涤5 min，随后加入稀释后二抗（GAPDH稀释比例1 5 000），室温孵育1 h，用TBST洗涤3次，每次洗涤5 min，暗室压片。使用Image J软件对胶片进行扫描和定量分析。目标蛋白表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。2.3统计学方法全部资料均采用SPSS27.0统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数标准差（-xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P0.05为差异有统计学意义。169北京中医药 2023 年 2 月第 42 卷第 2 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，February，2023，Vol.42，No.23 结果 3.1各组体质量比较与空白组比较，干预第 0、1、2、3、4 周模型组体质量高，差异有统计学意义（P0.05）；第 3、4周，低、中、高剂量组体质量低，差异有统计学意义（P0.05）。见表1。3.2各组FBG比较与空白组比较，干预第0、1、2、3、4周模型组 FBG 高，差异有统计学意义（P0.05）。第4周，低、中剂量组FBG水平低于模型组，但差异均无统计学意义（P0.05）；高剂量组FBG水平低于模型组，且差异有统计学意义（P0.05）。见表2。3.3各组INS水平及HOMA-IR比较与空白组比较，模型组INS水平及HOMAIR高（P0.05）；中、高剂量组INS水平及HOMAIR低，差异有统计学意义（P0.05）。见表3。3.4各组CORT水平比较与 空 白 组 比 较，模 型 组 CORT 水 平 高（P0.05）；中、高剂量组CORT水平低，差异有统计学意义（P0.05）。见表3。3.5各组海马组织11HSD1、GR蛋白表达比较与空白组比较，模型组海马组织11HSD1蛋白表达高、GR蛋白表达低（P0.05）；中、高剂量组海马组织11HSD1蛋白表达低、GR蛋白表达高，差异有统计学意义（P0.05）。见表3。4 讨论 精神情志作为肝主疏泄的影响因素之一，在表1各组干预不同时间体质量比较（g，-xs）组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666第0周22.810.5431.662.57*32.031.8831.222.2031.292.35第1周23.610.4833.332.32*33.572.3832.251.5832.022.44第2周24.760.8535.111.98*34.432.0133.591.6133.812.34第3周25.741.3037.201.42*35.141.6735.121.8935.042.02第4周26.731.8039.911.21*36.481.7136.471.5836.312.24与空白组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05表2各组干预不同时间FBG比较（mmol/L，-xs）组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666第0周4.250.298.530.90*8.570.918.551.238.501.24第1周4.080.489.200.85*9.001.048.980.818.951.11第2周4.450.5210.201.15*9.701.059.670.869.521.27第3周4.020.3412.071.56*11.651.1011.251.3910.981.17第4周4.280.5314.331.75*13.400.9513.781.1011.400.89与空白组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05表3各组INS水平、HOMAIR、CORT水平及海马组织11HSD1、GR蛋白表达比较（-xs）组别空白组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n66666INS（ng/mL）22.921.0140.211.36*35.782.1030.381.8626.410.82HOMAIR4.370.5825.623.23*21.342.2818.682.5513.381.19CORT（ng/mL）192.7019.56417.2822.48*373.9620.20321.4712.24283.0324.9811HSD1/GAPDH1.570.173.070.29*2.410.172.670.392.060.24GR/GAPDH1.050.170.140.06*0.220.070.400.140.590.19与空白组比较，*P0.05；与模型组比较，P0.05 170北京中医药 2023 年 2 月第 42 卷第 2 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，February，2023，Vol.42，No.2消渴病IR中发挥重要作用，而脾运化失常亦是IR发生的重要环节11，15。肝郁、脾虚与 IR及 T2DM关系密切，中医疏肝健脾法在改善糖尿病患者相关症状方面有较好的疗效，并具有一定的降糖作用12-13。伤寒论四逆散为疏肝解郁名方，调和肝脾，透邪解郁，疏肝理脾；丹溪心法痛泻要方为肝脾同治名方，调和肝脾，补脾柔肝，本研究合用两方，是疏肝健脾法的灵活运用，共奏调和肝脾、补脾柔肝之功效。全方以疏肝为主，兼顾脾胃，其中柴胡解泄、调达肝气以治郁；配以白芍，疏肝、柔肝；白术苦甘而温，燥湿健脾；陈皮、枳壳共同理气醒脾、疏畅气机；防风助升散，燥湿健脾以固本。叶天士曾言“心境愁郁，内火自燃，乃消症大病”，提示肝失疏泄与糖尿病密切相关。在益气养阴的基础上，采用疏肝健脾法能改善胰岛素抵抗11，临床研究12-13显示在改善糖尿病患者相关症状、血脂代谢紊乱等方面有较好的疗效。11HSD1不仅是周围局部组织中皮质醇代谢的重要调节因子9，还是海马GC的代谢酶，具有还原酶特性，能促进GC的表达；而GC水平升高又能负反馈调控GR水平进而抑制HPA轴活性8-9。11HSD1广泛分布于小鼠肝脏、脂肪组织、脑组织等。有研究显示其活性增加能增加GC浓度，进而抑制GR水平，调控血糖变化，改善T2DM患者IR16。GR作为参与调节糖代谢的主要核受体，能拮抗糖皮质激素的升糖作用，在改善IR方面发挥了重要作用17。本实验结果显示，痛泻要方合四逆散干预后，KKAy小鼠体质量、FBG、INS及HOMAIR、CORT水平明显降低，提示痛泻要方合四逆散能抑制HPA轴的激活，同时11HSD1蛋白表达降低和GR蛋白表达的升高，且呈现剂量依赖性。表明痛泻要方合四逆散作用机制可能与降低CORT水平及调控海马组织11HSD1、GR蛋白表达相关。本研究结果证实痛泻要方合四逆散能改善2型糖尿病小鼠FBG和胰岛素抵抗，其作用机制可能与降低皮质酮含量及调控海马组织 11HSD1 及GR蛋白表达有关，但痛泻要方合四逆散如何通过11HSD1及GR蛋白来实现调控糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用，仍需进一步深入研究。参考文献1 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groups were given the crude dosage of Chinese medicine 1.84，3.68 and 5.52 g/（kg d）respectively，while the blank group and model group were given the same volume of distilled water once a day for 4 weeks.The changes of body mass，fasting blood glucose（FBG），insulin（INS），insulin resistance index（HOMAIR）and corticosterone（CORT）in each group were compared.The expression levels of 11 hydroxysteroid dehydrogenase （HSD1）and glucocorticoid receptor（GR）in hippocampus were detected by Western blotting.Results Compared with the blank group，the body mass of the model group was higher at the 0，1，2，3 and 4 weeks of intervention（P0.05）.At the 3rd and 4th week，the body weight of the low，middle and high dose groups was low（P0.05）.Compared with the blank group，the FBG in the model group was higher at the 0，1，2，3 and 4 weeks of intervention（P0.05）.At the 4th week，the level of FBG in the high dose group was low（P0.05）.Compared with the blank group，the INS level and HOMAIR in the model group were higher（P0.05）.The levels of INS and HOMAIR in middle and high dose groups were lower，and the difference was statistically significant（P0.05）.CORT in middle and high dose groups was lower，and the difference was statistically significant（P0.05）.Compared with the blank group，the expression of 11 HSD1 protein in hippocampus of model group was higher，while the expression of GR protein was lower，with statistical significance（P0.05）.The expression of 11-HSD1 protein in hippocampus was low and GR protein was high in middle and high dose groups，and the difference was statistically significant（P0.05）.Conclusion Tongxie Yaofang combined with Sini Powder can decrease the level of FBG and improve insulin resistance in type 2 diabetes mice，and its mechanism may be related to the reduction of corticosterone content and the regulation of 11-HSD1 and GR protein expression.Keywords T2DM；Tongxie Yaofang；Sini Powder；11-Hydroxysteroid dehydrogenase；glucocorticoid receptor（收稿日期：2022-08-17）172