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大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

张海旺1 邓旭明2* 张煜1 苏杰1 胡仲明3
（1.河北北方学院，河北 张家口，075131；
2.中国人民解放军军需大学，吉林 长春；130062；3.军事兽医研究所，吉林 长春；130062）

摘要：目的 检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法 分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养，测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果 四环素诱导株产生多重耐药，氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变，诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。
关键词：大肠杆菌 多重耐药 外输泵 acrA marA

由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵（efflux pump）的表达水平提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外，从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，是发现外输泵最多的细菌，现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB－TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性，对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析，检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。
1 材料和方法
1.1 材料
菌株：大肠杆菌质控株ATCC25922，购自吉林省卫生监督检测中心。
抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等，均为标准品或对照品，中国药品生物制品检定所出品；盐酸环丙沙星，对照品，中国兽医药品监察所出品。
染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。
载体与质粒：克隆载体为pGEM－T，Promega公司产品。
酶与试剂：T4 DNA连接酶、Ex TaqTM DNA 聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。
其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司产品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷（Tris）等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等，均为国产分析纯试剂；
DNA片段凝胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0），TaKaRa公司产品；

国家自然基金资助项目，No 30270999
作者介绍：张海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者 E-mail：zhw5148@
分子量标准参照物：DNA Marker DL2,000、λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker，均为TaKaRa公司产品。
引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列为5´－ATG AAC AAA AAC AGA GGG TTT ACG CCT－3´；下游引物（PACR－R）5´－TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG－3´，marA的上游引物（PMAR－F）序列为5´－ATG ACG ATG TCC AGA CGC AAT AC－3´，下游引物（PMAR－R）5´－CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG－3´。上海博亚生物技术有限公司合成。
仪器：生物显微镜，OLYMPUS产品；PCR扩增仪，TC－25/H型，杭州 DAHE THERMO－MAGNETICS CO.LTD产品；电泳仪，DYY－6B型，北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器，HZQ－C，哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机，TGL－16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。
1.2. 方法
1.2.1 菌株鉴定
对购进的菌株作生化和形态鉴定，以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养，再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖）、靛基质试验、M.R试验、V—P试验鉴定及革兰氏染色的光镜观察。鉴定确认为ATCC25922的菌株作后续实验之用。
1.2.2 MIC测定
按照NCCLS（National Committee for Clinical Laboratory Standards）规定的方法配制包括诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药的标准溶液；用2倍连续稀释法配制各种含抗菌药的营养肉汤培养基，抗菌药的首选浓度范围为0.125～4.0μg/ml培养基（据细菌生长情况再作升或降的调整）。在1ml培养基中接种100μl菌液（约为105CFU）；37oC培养24h，确定MIC。
1.2.3 诱导
分别在三种含1/2×MIC诱导剂的麦康凯培养基接种适量培养物（约105CFU），37oC培养24h，挑选生长良好的菌落，接种于1×MIC诱导剂的培养基37oC培养24h，以此类推，逐渐提高培养基中诱导剂的浓度直到诱导前MIC的128倍（据细菌生长情况诱导剂浓度提高幅度可在1～2倍于原浓度的范围适当调整，也可当细菌生长不良时在同一个浓度重复传代培养）。
1.2.4 耐药谱的确定
上一步最后获得的诱导剂浓度达到128×MIC的耐药株，作4次无诱导剂传代培养后，再分别测定三个诱导株对所有受试抗菌药的MIC，以确定三个诱导株的多重耐药谱。
1.2.5 受试菌株acrA、marA基因序列的检测
据上一步耐药谱检测结果，氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的耐药谱相近，而四环素诱导株的耐药谱与之差异较大，故选择四环素诱导株（名为SEMR）、环丙沙星诱导株（名为SEICI）和质控株（ATCC25922）作acrA、marA基因序列的检测。
1.2.5.1 目的基因（acrA、marA）的获取
1.2.5.1.1 DNA提取：按卢圣栋等[4]的方法提取SEMR、SEICI和ATCC25922的基因组DNA。
1.2.5.1.2 acrA、marA基因的PCR扩增：以大肠杆菌染色体DNA为模板，用引物PACR－F和PACR－R扩增acrA（全长1194bp），用PMAR－F和PMAR－R扩增marA（全长390bp）。取5µlPCR产物在0.7%琼脂糖凝胶进行电泳观察PCR结果。
1.2.5.1.3 PCR产物的回收：用DNA片段凝胶回收试剂盒回收acrA和marA基因的PCR产物，方法按试剂盒使说明书进行。
1.2.5.2 acrA、marA基因的克隆
1.2.5.2.1 目的基因片段与载体的连接：将回收的PCR产物连接到pGEM－T 载体上。反应体系为：2×Rapid Ligation Buffer，5µl；PCR产物（2ng/µl），3µl；pGEM－T vector（50ng/µl），1µl；T4 DNA Ligase，1µl。16℃连接过夜。
1.2.5.2.2 感受态菌的制备：CaCl2法制备DH5α感受态细胞[5]。
1.2.5.2.3 重组质粒的转化：参照《分子克隆指南》[5]进行。
1.2.5.2.4 阳性克隆的筛选：利用α互补法（蓝/白菌落筛选法）进行阳性克隆的初步筛选[5]。
1.2.5.3 重组质粒的鉴定
1.2.5.3.1提取质粒：碱裂解法[5]提取质粒，作0.7％琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪观察并拍照。
1.2.5.3.2 重组质粒的酶切鉴定：用NcoⅠ和NotⅠ双酶切鉴定acrA－pGEM－T和marA－pGEM－T质粒。将经过电泳筛选出的疑似阳性克隆质粒进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切反应，同时做阴性克隆质粒的酶切对照。酶切反应体系为：克隆质粒，5µl；10×H Buffer，1µl ；0.1%BSA，2µl； NcoⅠ，1µl；NotⅠ1µl ；ddH2O，10µl。37℃恒温水浴2~4h。0.7%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪下观察电泳结果并拍照。
1.2.5.3.3 重组质粒的PCR扩增鉴定：利用PCR反应，对经过上述鉴定的疑似阳性质粒再作PCR扩增鉴定。用引物PACR－F和PACR－R扩增鉴定acrA－pGEM－T质粒；用PMAR－F和PMAR－R扩增鉴定marA－pGEM－T质粒。取5µl PCR扩增产物在0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。
1.2.5.4 重组质粒的核苷酸序列测定与分析
对经上述鉴定后均符合要求的阳性克隆质粒进行序列测定（上海博亚生物技术有限公司完成），用DNAsis软件分析测序结果。
2 结果
2.1 受试药物的MIC
包括三种诱导剂（氯霉素、四环素、环丙沙星）在内的各种受试抗菌药对于质控株的MIC见表1。
2.2 诱导株的耐药性变化
四环素、环丙沙星和氯霉素三个诱导株的MIC变化详见表2。从表中可见，在四环素诱导株，除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC没有明显的提高外，青霉素钾、头孢噻肟、四环素、土霉素、氯霉素、利福平、甲砜霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢西丁的MIC提高幅度都有达到或超过4倍（经统计处理，MIC变化值≥4×MIC为具有显著性意义）；在环丙沙星诱导株，只有头孢噻肟MIC提高倍数达到或超过了4，而其它受试抗菌药的MIC变化都没有显著性意义；氯霉素诱导株与环丙沙星诱导株相似，只有头孢噻肟的MIC提高具有显著性意义，而其他药物没有显著意义。
2.3 acrA、marA基因检测结果
2.3.1 SEMR、SEICI和ATCC25922基因组DNA的提取结果
从ATCC25922、SEMR、SEICI中提取的染色体DNA作0.7%的琼脂糖凝胶电泳，观察到一条特异带，大于23kb。见图1。
2.3.2 SEMR、SEICI、ATCC25922 acrA、marA基因的PCR扩增结果
acrA、marA 的PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，以DNA Marker DL2,000为对照，结果在约1194bp和390bp处分别出现特异的目的片段，与预计的片段大小吻合。见图2、图3。

表1 受试药物的MIC （ug/ml）
Table 1 MIC of antibacterial agents （ug/ml）
抗菌药 MIC 抗菌药 MIC 抗菌药 MIC
antibacterial agents antibacterial agents antibacterial agents
青霉素钾 Benzylpenicillin K 64 氧氟沙星 Ofloxacin 0.5 甲砜霉素 Clinfenicol 16
头孢噻肟 Antibacterial 0.25 诺氟沙星 Norfloxacin 0.25 阿米卡星 Amikacin 32
四环素 Tetracycline 4 头孢西丁 Cefoxitin 0.5 环丙沙星 Ciprofloxacin 0.25
土霉素 Oxytetracycline 8 链霉素 Streptomycin 64 妥布霉素 Tobramycin 8
氯霉素 Chloramphenicol 16 小诺霉素 Micronomicin 1 利福平 Rifampicin 32

表2 诱导菌株的MIC变化
Table2 Change for MIC of induced strains
受试药物
antibacterial agents
诱导后MIC提高倍数
Increasing power of MIC after induction

四环素诱导株 环丙沙星诱导株 氯霉素诱导株
strains of Tetracycline strains of Ciprofloxacin trains of Chloramphenicol

青霉素钾Benzylpenicillin K 8 0 2
头孢噻肟Antibacterial 256 8 8
四环素Tetracycline 128 2 0
土霉素Oxytetracycline 16 2 0
氯霉素Chloramphenicol 4 2 0
利副平Rifampicin 4 0 0
甲砜霉素Clinfenicol 16 0 0
环丙沙星Ciprofloxacin 4 0 0
氧氟沙星Ofloxacin 8 2 2
诺氟沙星Norfloxacin 8 2 2
头孢西丁Cefoxitin 4 1 0
链霉素Streptomycin 1 0 0
小诺霉素Micronomicin 1 2 2
妥布霉素Tobramycin 0 0 0
阿米卡星Amikacin 0 0 1
2.3.1 阳性克隆的筛选结果
转化平板经过16~20h 37℃的倒置培养，出现了稀疏的蓝色和白色的克隆菌落。其中蓝色菌落为阴性克隆，为T载体自身环化所产生。白色的菌落为疑似阳性克隆，需做进一步的鉴定。
2.3.2 克隆质粒的PCR鉴定
分别利用扩增引物，PCR鉴定各克隆质粒，结果可见到特异目的带，见图4。
2.3.3 克隆质粒的酶切鉴定
将经过PCR鉴定筛选出的疑似阳性克隆质粒acrA－pGEM－T和marA－pGEM－T进行NcoⅠ和NotⅠ双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳，结果在约2974bp、1220bp和416bp处分别出现特异的载体、acrA和marA的目的片段。见图5、图6。
2.3.4 acrA、marA基因序列的测序结果
由DNAsis软件分析测序结果表明，acrA和marA克隆质粒序列，在ATCC25922、SEMR和SEICI都一致，与GenBank中发表序列同源性为100%，acrA和marA基因在四环素诱导株和环丙沙星诱导株均没有发生突变。
3 讨论
普遍的观点认为，抗菌药物的使用是病原菌产生耐药性的关键所在。由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，给细菌的生存环境造成了选择性压力，这种环境压力因素可以通过多种机制导致病原菌对抗菌药物产生耐药性。药物外输泵是一类位于细胞膜上的具有特殊结构的膜转运蛋白质，其作用机理为当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时，药物外输泵系统相关mRNA的表达增加，结果使细胞膜上外输泵的数量增加，使细胞内的药物被泵出，从而使细菌耐药。由于外输泵种类较多，作用底物广泛（包括抗菌药、染料、消毒剂、洗涤剂、有机溶剂、亲脂阳离子、脂类、抗微生物多肽类、化学药物等），所以主动外输系统介导的耐药性呈现多重耐药的特点[6～9]。本实验依据细菌耐药性的原因和机理，人为造成一种抗菌药的选择性压力环境，对大肠杆菌质控株进行体外选择性诱导培养，以期产生耐药性。从诱导前后多种抗菌药MIC的变化结果看，四环素诱导株，除小诺霉素、妥布霉素、阿米卡星和链霉素的MIC没有明显的提高外，青霉素钾等11种抗菌药的MIC都有明显提高，即表现了不同程度的耐药。从耐药谱看，产生耐药的抗菌药分属于几类在结构和作用机理上各不相同的类别，说明四环素诱导株产生了多重耐药。
大肠杆菌是发现外输泵最多的一种细菌，在埃希氏大肠杆菌上发现了约30种外输泵，但一般认为AcrAB－TolC是最主要的外输泵[10]。有人报导大肠杆菌外输泵AcrAB的作用底物包括吖啶橙、结晶紫、溴乙啶、镰孢菌酸、四环素、氯霉素、新霉素、红霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氨比西林、氟喹诺酮类、β－内酰胺类、利福平、吐温X－100等多种制剂[9、11]。本实验的耐药谱在受试的抗菌药范围内耐药谱与AcrAB的作用底物大体一致。这个结果提示，四环素诱导大肠杆菌株多重耐药性的产生可能是由于激活了它的包括AcrAB在内的主动外排系统。
本实验中另外的氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株只对头孢噻肟一种抗菌药产生了耐药。导致这种结果的原因我们还不能确切定论，参考有关资料推测，假定AcrAB激活是多重耐药产生的直接机制，则acrAB又受到mar等的调控，有实验表明环丙沙星不是操纵子mar的诱导因子，但是操纵子Mar的诱导能力对药物产生低水平的耐药性；Hachler认为，大肠杆菌操纵子突变体能被选择，选择时用环丙沙星选择的频率大大低于能被接受的诱导物如四环素等的频率[12]。由此可以认为抗菌药的选择性压力与主动外输系统的交互作用在一定程度活范围内是有特异性的。
四环素能较容易地诱导大肠杆菌产生多重耐药这一结果还提示，四环素类抗菌药的使用要慎重或不提倡使用，特别是对于肠杆菌疾病的治疗。由此还可以联想到，在目前人们对付病原菌耐药性尚没有确实有效的办法的情况下，倒可以如世界卫生大会（World Health Assembly, WHA）[13]敦促的那样，在消除对病原菌人为的选择性环境压力，减少对耐药性的诱导方面多下些功夫。这不仅在现在，即使在将来人们逐渐找到了一些对付病原菌耐药性的办法，仍然不失为具有战略意义的对策。
从实验结果还发现，产生了耐药的抗菌药其MIC的提高幅度不尽一致。对此种现象产生的原因，推测是由于不止一种外输泵的激活，或是可能还有其他的耐药机制的作用。因为细菌的耐药有着多种而复杂的机制[14]，一种或几种机制可能同时作用于某一种/一类抗菌药，多种耐药机制错综的作用于不同的各类药物，可能是导致本实验中这种耐药的不整齐性的主要原因。特别是四环素的MIC提高幅度达128倍，极有可能存在另外的四环素耐药机制，比如四环素排出系统（Tet）的参与。
本实验对多重耐药株、单药耐药株和质控株对编码AcrAB－TolC外输泵组分之一AcrA[2]的acrA基因和其调控基因marA[15]作了完整的克隆和侧序，二者的测序结果在上述的3个菌株都是一致的，与文献报道结果的同源性均为100%，说明SEMR和SEICI的acrA和marA基因都没有碱基的改变，四环素、环丙沙星的诱导培养引起菌株的药敏变化是在acrA和marA基因没有突变的情况下发生的，即SEMR菌株多重耐药性的产生是由于除acrA和marA突变以外的其他原因。

参考文献：
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图1 SEMR、SEICI、ATCC25922菌株基因组DNA提取物的琼脂糖电泳
Figure 1 gelose gel electrophoresis with Genome DNA of ATCC25922,SEMR and SEICI.
1:λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker;
2: E.Coli ATCC25922; 3: SEMR; 4: SEICI
图4 克隆质粒的PCR鉴定
Figure 4 The identification of cloning plasmid monitoring with PCR
1,2,3:marA of ATCC25922,SEMR,SEICI;
M:DL2,000 DNA Marker;
4,5,6:acrA of ATCC25922,SEMR,SEICI.
图2 acrA 基因的PCR扩增结果
Figure 2 The amplification of acrA gene with PCR
1:ATCC25922; 2:SEMR; 3:SEICI;
M:DL2,000 DNA Marker 1: acrA; 2 :DL2,000 DNA Marker

图3 marA 基因的PCR扩增结果
Figure 3 The amplification of acrA gene with PCR
1:ATCC25922; 2:SEMR; 3:SEICI;
M:DL2,000 DNA Marker

图5 克隆质粒的酶切鉴定
Figure 5 The identification of Cloning plasmid monitoring with restriction enzyme digestion
1,2,3:acrA－pGEM-T of TCC25922,SEMR,SEICI
4:λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker;

图6 克隆质粒的酶切鉴定
Figure 6 The identification of Cloning plasmid monitoring with restriction enzyme digestion
1:λ－Hind Ⅲ Marker; 2,3,4: marA－pGEM-T
of ATCC25922,SEMR,SEICI;5: DL2,000DNA Marker