微生物降解烟叶烟碱研究应用进展_李晨虎.pdf

安徽农学通报2023年05期动植物 微生物 食用菌 中药材微生物降解烟叶烟碱研究应用进展李晨虎宁高杨姜振锟（福建中烟工业有限责任公司，福建厦门 316000）摘要本文从降低烟叶烟碱含量的主要方式、微生物代谢烟碱的主要途径、微生物及其酶降解烟碱的研究进展3个方面综述了近年来国内外对利用微生物及其酶降低烟叶烟碱的研究应用成果，以期为烟叶生产提供参考。关键词微生物；烟草；烟碱；降解中图分类号S572文献标识号A文章编号1007-7731（2023）05-0022-05烟碱，又名尼古丁，属于吡啶族生物碱，在烟草总植物碱中含量占约 90%以上1。烟碱含量是影响烟叶感官质量的重要因素，含量过高或过低均会对烟叶的感官质量造成不利影响2-4。而烟叶是支撑卷烟工业企业发展的重要物质基础，从目前情况来看，国内部分产区烟叶存在上部烟叶烟碱含量偏高的问题，致使这些产区上部烟叶进入卷烟叶组配方使用的难度较大，从而导致卷烟工业企业烟叶原料库存积压，一定程度上制约了烟草行业持续健康发展。如何把烟草的总植物碱含量控制在期望范围内，一直是烟草科技工作者研究的热点课题。1降低烟碱含量的方式烟草作为一种经济作物，其烟碱含量既与品种、地域、气候、施肥种类和施肥量等因素有关，也与后期的工艺处理过程及微生物的作用有关5。目前，降低烟草中的烟碱含量主要通过3种途径来实现：农业种植方法：主要通过遗传、生态、栽培等传统农业手段进行控制6。通过该方法降低烟碱，含量效果最为直接，但有可能在一定程度上影响烟叶产量，烟农接受度不高，实际推广应用难度较大。化学方法：可将烟叶通过有机溶剂萃取和蒸汽蒸馏等处理方法将其中的烟碱脱掉7。使用化学方法虽然可以降低烟碱含量，却可能导致烟叶外观和感官质量下降，降低烟叶的可用性。微生物及酶法：分离、筛选出具有降解烟碱功能的微生物，将菌株或其所产酶制剂作用于烟叶上，可有效降低烟叶中的烟碱含量。因为酶具有专一性，能较好防止其余化学成分改变造成的烟叶质量问题。因此，利用微生物及其酶降解烟碱的方式成为了现阶段烟草行业的热门研究课题和研究方向。2微生物代谢烟碱的主要途径为了弄清烟碱如何被微生物代谢，各国科技工作者已进行了诸多研究。目前已知的烟碱微生物代谢途径主要有3种：脱甲基途径（Me pathway），该途径主要是烟草植物和少数真菌降解烟碱的途径。Leete等8对烟草使用放射性标记的烟碱混合物处理，发现烟碱经过脱甲基化得到去甲基烟碱，再由去甲基烟碱代谢为麦斯明，最后转化为烟酸。关于该途径各类反应中的酶类和相关的基因描述很少，有待进一步研究。吡啶途径（Pyridine pathway），该途径主要以节杆菌属为主。Brandsch等9通过研究Arthrobacter oxidans说明了吡啶途径的过程（图1），吡啶途径开始于烟碱的吡咯环经过羟基化和氧化反应后生成6-HMM（6-羟基-N-甲基麦斯明），6-HMM不稳定自发水解形成 6-HPON（6-羟基假氧化烟碱），接着吡咯环通过羟基化打开，再经过侧链裂解形成MGABA（-N-甲基丁酸辛酯）和2，6-DHP（2，作者简介李晨虎（1998），河南济源人，从事烟草研究工作。收稿日期2022-05-23-22DOI:10.16377/ki.issn1007-7731.2023.05.0196-二羟基吡啶），其中 MGABA 生成-氨基丁酸，2，6-DHP最后经过催化和氧化后形成2，3，6-三羟基吡啶和马来酸。吡咯途径（Pyrrolidine pathway），假单胞菌属微生物主要通过此途径降解烟碱。Chen等10研究说明了Pseudomonas putida S16的吡咯途径起始于烟碱的吡咯烷脱氢作用转化为N-甲基麦斯明，接着是一步可逆反应，N-甲基麦斯明水解生成假氧化烟碱，再通过NicA（烟碱氧化还原酶）生成甲胺和SP（3-琥珀酰吡啶），SP），再经过6位羟基化反应生成HSP（6-羟基-3-琥珀酰吡啶），最后反应生成DHP（2，5-二羟基吡啶）和琥珀酸盐（图2）。而Ruan等11发现吡咯途径具有代谢多样性，如可将烟碱转化成可替宁或者转化为二烯烟碱、去甲基烟碱。图1吡啶途径图2吡咯途径3微生物及其酶降解烟碱的研究进展国外对于利用微生物及其酶降解烟碱的研究较早，1942 年，Bucherer12为了在降解烟碱的微生物中找到特殊的物质和酶用来当做人类和动物烟碱中毒的解毒剂，首次在接种细菌的营养培养基上进行了烟碱代谢产物研究，并分离得到 3 种嗜烟碱的细菌；20世纪50年代，Tabuchi13和Sguros14共发现了50多株能利用烟碱作为营养物质的微生物，包 括 Pseudomonas、Alicaligenes、Acbromobacter、Bacteriun 和 Bacilllus 等 属；1952 年，Frankenburg等15-17从烟草种子表面分离出一种微生物，可将烟碱降解成甲酰胺、氨、草酸以及微量的丙二酸和琥珀酸。而像国外的一些大型烟草企业，为满足部分低烟碱香烟的市场需求，很早便开始利用微生物对烟草中的烟碱进行降解18。Brown&Williamson烟草公司将白肋烟和烤烟的混合烟丝（1 1）用假单胞杆菌进行处理，18 h后烟碱含量从2.00%降到了 0.85%，并经过烟气分析发现烟碱含量从1.58 mg降至0.98 mg19。该公司还将筛选出的纤维单胞菌和假单胞菌两种细菌在烟草-烟碱液体培养基中培养，用培养后的菌液处理去梗的烟叶，经过 处 理 后 的 烟 叶 烟 碱 含 量 从 3.50%降 低 到1.65%20。截至目前，国内外研究人员发现的能降解烟碱的微生物种类繁多（表1），而近年来，国内在该领域的研究也逐渐增多。王书宁等21-22分离出一株烟碱降解菌株S16，发现其在培养基中烟碱耐受浓度可达 3.0 g/L，借助 NMR、FT-IR、GC-MS 和 HR-MS李晨虎等：微生物降解烟叶烟碱研究应用进展-23安徽农学通报2023年05期动植物 微生物 食用菌 中药材等方法对该菌株进行了代谢产物鉴定，测出菌株S16 降解烟碱后的主要代谢产物为 N-甲基麦思明、3-琥珀酰吡啶、6-羟基-3-琥珀酰吡啶、2，5-二羟基吡啶等。林智慧等23通过研究发现，具有高效烟碱降解功能的内生菌G16的烟碱降解能力与 pH、接种量和烟碱浓度有关，其代谢产物为尼古丁提林、脱甲基尼古丁和可铁宁等物质。孙柯丹24等从库存废弃烟叶中筛分出一株具有高效降解烟碱能力的菌株ZUTSKD，经鉴定该菌株为假单胞菌属，在温度为 30，pH 为 7.5 时，添加氯化铵和葡萄糖有利于烟碱的降解，并能检测出 3-（2，3，4-三氢-5-吡咯基）-吡啶，2，3-二吡啶、可天宁和3-羧基-吡啶等代谢产物。陈辰等25分离筛选出一株具有烟碱降解能力的菌株，在温度 30、起始pH 7.0、接种量10%、培养转速180 r/min 的条件下发酵，烟碱的降解率可达到 91.53%。苏丹等26从三明烟区的烟草植株中筛分出内生菌Y5，培养条件优化后可完全降解烟碱，并发现该菌株的中间产物与已报道的假单胞菌属的吡咯途径不同。邓高毅等27使用3种不同的菌液对烟株进行了叶面喷洒和根灌处理，结果表明虽然根灌处理方式无明显效果，但是通过叶面喷洒的方式，3株菌的降解率分别达到了17.7%、18.5%和25%，且处理后的上部叶感官质量有改善的趋势。任平等28分离筛选出一株能够高效降解烟碱的新菌株Y523，将发酵优化后的菌液进行烟叶烘烤应用试验，烘烤后上部烟叶的烟碱降解率达到28.7，且上部烟叶品质有一定的改善和提高。李雪梅等29通过筛分得到一株具有较高烟碱降解能力的微生物菌Nic22，利用其所产酶液对上部烟叶进行处理试验，感官评吸后发现，经酶液处理后的上部烟叶，其杂气和刺激性明显降低，感官质量得到显著提高。袁永军等30从福建三明地区的土壤中分离得到一株能够以烟碱为唯一碳源生长并且具有高效降解烟碱功能的菌株 DN2，在 500 mg/L的烟碱浓度下，其降解速率为 15 mg/（Lh），36 h 烟碱降解率为97.65%。表1降解烟碱的微生物菌株名称SaccharomycesCorynebacterium sp.Achromobacter nicotinophagumAlcaligenes paradoxusArthrobacter nicotinovoransEnterobacter cloacaeBacillus pumilusPseudomonas nicotianaeOchrobactrum intermedium DN2Bacillus brevisEnsifer sp.N7Rhodococcus sp.Y22Aspergillus oryzae 112822Acinetobacter sp.ND12Pseudomonas stutzeri ZCJPseudomonas sp.CS3Shinella sp.HZN7Pseudomonas geniculate N1Pseudomonas plecoglossicida TND35Arthrobacter sp.AH14Sphingomonas melonis TY发现年份1947311957321959331976341979351983362003372004382005392007402009412009422010432011442012452012462013472014482014492016502018514结语综上所述，前人研究和应用结果证实利用微生物及其酶能够有效降解上部烟叶烟碱改善烟叶品质，且具有高效性、选择性等优点，是一种切实可行提高上部烟叶可用性的方法。因此，在烟草行业“控总量、守红线、降库存”工作任务引导下，开展微生物及其酶降低上部烟叶的烟碱含量的研究应用前景广泛，可带来较高的经济效益和社会效益。5参考文献1 王威威，席飞虎，杨少峰，等.烟草烟碱合成代谢调控研究进展J.亚热带农业研究，2016，12（1）：62-67.2 包勤，张艳玲，王爱国，等.20022013年间我国烤烟主要化学成分变化趋势及原因分析J.烟草科技，2015（7）：14-19.3 张黎明，张明发，田峰，等.湘西州烤烟烟碱含量的区域特征及其与烟叶评吸质量的关系J.烟草科技，2014（12）：57-61.4 王广山，陈卫华，薛超群，等.烟碱形成的相关因素分析及降低烟碱技术措施J.烟草科技，2001（2）：38-425 左天觉.烟草的生产、生理和生物化学M.上海：上海-24远东出版社，19936 周冀衡，朱小平，王彦亭，等.烟草生理与生物化学M.合肥：中国科技大学出版社，19967 金闻博，戴亚.烟草化学M.北京：清华大学出版杜，19948 EDWARD L.Biomimetic synthesis of nicotineJ.Journalof the Chemical Society，Chemical Communications，1972，1（19）：1091.9 BRANDSCH R.Microbiology and biochemistry of nicotine degradationJ.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，69（5）：493-498.10 CHEN C，LI X，YANG J，et al.Isolation of nicotine-degrading bacterium Pseudomonas sp.Nic22，and its potential 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