土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究.pdf

采用稀释涂布平板法分离到放线菌；用纸片法初步筛选出抑菌放线菌，生长速率法对抑菌效果好的菌株复筛；用经典分类学方法：插片法、形态学特征、培养特征、生理生化特征对菌株进行初步鉴定；通过对蚯蚓进行解剖和体表观察，对蚯蚓进行初步鉴定。试验所用的蚯蚓为环毛蚓属（Pheretimatschiliensis）动物。共分离出43株放线菌，有15株放线菌对供试菌病原菌有抑菌活性，其中菌株T13对供试病原细菌和真菌都有抑菌活性，且菌株 T13 的热稳定性较好，初步鉴定菌株 T13 为链霉菌属（Streptomycetaceae）放线菌，其在改良的高氏2号培养基中抑菌活性高，最优发酵时间为6 d，有耐热性。关键词 抑菌放线菌；发酵条件；稳定性；特征观察中图分类号 Q81文献标识码 Adoi:10.3969/j.issn.1674-9340.2023.02.016文章编号 1674-9340（2023）02-0101-08收稿日期：2023-04-06第一作者简介：晏爱芬（1976），女，汉族，云南宣威人，硕士，副教授，研究方向为微生物。放线菌（actinomycetes）其菌丝体为放射状1，自然分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、水、动植物和真菌体内。人们依据不同的研究目的，从多种动物体内分离到了大量的共生放线菌，为医药和工业生产提供宝贵的先导化合物资源。王影姣等2从美洲大蠊肠道中分离到种类较多的共生放线菌，其中戈登菌等多种菌株都有较好的抑菌效果，并研究表明戈登菌在美洲大蠊抵抗外界恶劣环境时发挥着非常重要的作用。郭志凯等3从中华稻蝗肠道中发现一株共生放线菌，其能代谢出多种抗肿瘤细胞活性的化合物。矫继峰等4从新疆驴盲肠分离到大量放线菌，其中丙酸杆菌属放线菌占总微生物数量的30%，且对一些致病菌有抑菌作用，不仅促进了新疆驴对其食用的粗材料的吸收，而且对新疆驴的健康也起着重要作用。王容等5从南海紫海胆肠道中分离放线菌，其中有1株为稀有放线菌小单胞菌（Micromonospora sp.HDa2），并从该放线菌中分离到次生代谢产物，经鉴定为6个环二肽化合物，其中有4个化合物有相关的报道，具有较强的抑菌活性。刘雪连等6从蚯蚓粪中分离出对大肠杆菌具有抑菌作用的菌株，胡艳霞等7从蚯蚓粪中分离到对蔬菜幼苗病害具有防控作用的菌株。另外，袁向华等8研究表明，蚯蚓通过吞食土壤使其有机质、有效磷、氮、钾等含量明显增加，显著增强了土壤的肥力。大量的试验研究表明动物消化道中的微生物与机体相互作用为人类生活带来了很大的益处。本试验从保山市隆阳区耕地土壤中的蚯蚓中分离抑菌放线菌，并通过形态学特征、培养特征、生理生化特征对菌株进行初步鉴定，对抑菌菌株进行发酵条件研究，为肠道放线菌的开发利用提供一定的理论依据，增加蚯蚓肠道放线菌的研究价值。1 试验材料与方法1.1 试验材料1.1.1 样品保山市隆阳区耕地土壤中的蚯蚓（25841.24N，99951.90E）。第 42 卷第 2 期保山学院学报2023 年 4 月1.1.2 供试菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、白假丝酵母（Candida albicans）。均为保山学院微生物实验室提供。1.1.3 培养基高氏1号培养基；牛肉膏蛋白胨培养基；PDA培养基9。1.2 试验方法1.2.1 蚯蚓消化道研磨液的制备取耕地土壤中肥大的蚯蚓并让其不食土壤6 h，以确保放线菌是来自于蚯蚓的消化道而不是蚯蚓刚食用而未消化的土壤。用75%乙醇在蚯蚓体表消毒，用无菌水洗3次，洗去酒精10，解剖找到蚯蚓的沙囊，把蚯蚓的消化道分为2节：从口、口腔、咽喉、食管、砂囊为一节，肠道为另一节。两部分消化道分别放入灭过菌的培养皿中，并在28的烘箱内进行干燥加热处理36 h后，用研钵分别将其碾成粉末。称取3 g消化道粉末加入到锥形瓶，再向锥形瓶加入灭菌玻璃珠和27 mL、0.9%灭菌生理盐水。放入恒温培养箱40，140 r/min震荡1 h，使其充分混匀。1.2.2 放线菌的分离吸取1 mL消化道研磨液加入装有9 mL无菌生理盐水的试管中，逐步稀释成10-1、10-2、10-3倍稀释液，取0.4 mL各稀释液涂布在倒有改良高氏2号培养基培养皿上11，放在28恒温培养箱培养9 d，每个浓度重复3次。用高氏1号培养基划线接种改良高氏1号培养基上长出的放线菌10，纯化培养放线菌放于4冰箱保存。1.2.3 放线菌发酵液的制备取2 mL孢子悬液12接种于高氏1号液体培养基中，放于恒温培养箱28，170 r/min培养8 d，取1 mL培养液放入1.5 mL塑料离心管中10 000 r/min离心10 min。离心上清液用0.22 m滤膜过滤，滤液作为发酵液或无细胞发酵液置于4 冰箱保存。1.2.4 抑菌放线菌的筛选用滤纸片法筛选抑制细菌的放线菌：将指示菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种于试管液体培养24 h。用移液器各吸取0.2 mL 菌液，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，待35 min 菌液干燥后，用灭菌镊子夹取4个滤纸片（直径5 mm）等距离贴于涂有指示菌的牛肉膏蛋白胨培养基上，再用无菌移液枪吸取100 L的发酵液分别滴在3个滤纸片上，另一个滴上无菌水作对照，各平板做好标记，每个指示菌做三个重复，平板倒置放于培养箱37恒温培养，培养 1224 h 后观察并测量抑菌圈直径，抑菌圈直径的大小表示待测菌株抑菌活性的大小13。采用生长速率法14筛选抑制真菌的放线菌：取1 mL放线菌发酵液加入到15 mL灭菌并冷却到45左右的PDA培养基中混匀，待培养基冷却凝固后，将培养好的指示真菌菌块（d=5 mm）贴于培养基的正中，每个重复3次，置于28恒温培养57 d，以未加发酵液的作对照，待对照菌落长到直径在6070 mm时，采用十字交叉法测量菌落直径，并计算抑制率。菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径1001.2.5 放线菌的初步分类和鉴定1.2.5.1 培养特征观察将分离纯化的放线菌转接到高氏一号固体培养基上，28恒温培养，分别5 d、10 d观察记录菌株在培养基上的菌落形态、颜色变化和生长情况。1.2.5.2 形态学特征观察采用插片法9进行观察。用灭菌镊子将灭菌盖玻片以45度角斜插入培养基，再将放线菌-102晏爱芬，何寒霞：土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究接种在插盖玻片一侧的培养基上，28恒温培养57 d，用镊子小心取出盖玻片，无菌一面放在载玻片上显微观察。主要观察气生菌丝、基内菌丝和孢子丝、孢子排列方式、孢子形态及大小。1.2.5.3 生理生化特征的研究菌株的生理生化特征参考徐丽华等1的方法进行。1.2.6 发酵条件的研究以下实验均采用白假丝酵母作为指示菌。1.2.6.1 发酵培养基对发酵液抑菌活性的影响本实验通过配制3种不同的液体培养基，分别取25 mL装入100 mL的锥形瓶中，接种抑菌放线菌，置于28，180 r/min摇床恒温培养6 d后，测抑菌率。1.2.6.2 培养时间对发酵液抑菌作用的影响取25 mL发酵培养基加入到100 mL的锥形瓶中，接种抑菌放线菌，置于28，180 r/min摇床培养，分别在第4，5，6，7，8 d取样测抑菌率。1.2.6.3 温度对发酵液抑菌活性的影响本实验取pH为7.0的25 mL发酵培养基装入100 mL锥形瓶中，接种抑菌放线菌，分别置于24，28，32，36，180 r/min摇床培养6 d后，测抑菌率。1.2.6.4 pH对发酵液抑菌活性的影响利用氢氧化钠（1 mol/L）和盐酸（1 mol/L）将筛选到的液体发酵培养基的pH调至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，各取25 mL不同初始pH值的培养基装入100 mL锥形瓶中，接种抑菌放线菌，置于28，180 r/min摇床培养6 d后，测抑均率。2 结果与分析通过对蚯蚓进行体表和解剖观察，本试验所用蚯蚓为环毛蚓属（Pheretima tschiliensis）环节动物（见图1）。图1 蚯蚓消化道的组成（A）及其体表特征（B）2.1 放线菌的分离从蚯蚓口部到沙囊这一段消化道中分离出17株放线菌，如表1所示，其中能把培养基染上相应的颜色1即产水溶性色素的有3株，菌落表面有水珠的有5株。从肠道中分离出26株放线菌，如表2所示，其中能产水溶性色素1的菌株有2株，菌落表面有水珠的菌株有13株。两部分消化道所分离出的放线菌有相似菌株：菌株T2和C16的菌落在形态和正反面的颜色有相似之处。-103第 42 卷第 2 期保山学院学报2023 年 4 月表2 从C1C26的放线菌菌落特征菌株编号C1C2C3C4C5C6C7C8C9C10C11C12C13C14C15C16C17C18C19C20C21C22C23C24C25C26气生菌丝深灰淡棕色灰白色淡灰色浅灰色淡灰色黄灰色淡灰色银灰色深灰色淡灰色乳灰色淡灰色乳灰色白色微绿黄色白色灰白色深灰色浅红色棕黑色灰白色浅灰色白色灰蓝色橙灰色即内菌丝微褐黄色棕黑色淡黄色淡棕色乳黑色浅褐色乳褐色棕黑色淡棕色棕色浅褐色白黄色浅黑色乳白色黑色乳褐色浅棕色乳棕色浅棕色浅红色棕黑色乳棕色乳褐色暗蓝深蓝色黑红色可溶性色素-浅棕色-深蓝色-生长状况良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好较差较差良好良好良好良好良好有无水珠产生无有无无无有有有有有有有无无无有无无有无无无有有无有注：“-”表示无可溶性色素产生。菌株编号T1T2T3T4T5T6T7T8T9T10T11T12T13T14T15T16T17气生菌丝浅白灰色微绿黄色浅灰色白灰色灰蓝色灰白色白灰色雪白色灰色灰褐色淡灰色鼠灰色白灰色淡灰色淡灰色乳褐色深灰色基内菌丝浅黄色乳棕色乳褐色淡黄色深蓝色暗微红橙色深蓝色深褐色乳黑色微褐黄色深褐色褐色褐色棕黑色淡黑色乳褐色黑色可溶性色素-橘色-深蓝色-深蓝色-生长状况良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好良好较差良好有无水珠产生无有无有无无有有有无无无无无无无无注：“-”表示无可溶性色素产生。表1 从T1T17的放线菌菌落特征-104晏爱芬，何寒霞：土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究2.2 抑菌放线菌筛选从蚯蚓口部到沙囊这一段消化道中共分离到抑菌放线菌有12株，而肠道中的抑菌放线菌有3株。对枯草芽孢杆菌抑制作用最好的是菌株C24，对金黄色葡萄球菌抑制作用最好的是菌株C24，对大肠杆菌抑制作用最好的是菌株T5，其中菌株T13对四种指示菌均有一定的抑菌效果，且对白假丝酵母的抑制作用最好。此次实验主要研究放线菌对供试病原真菌的抑菌活性，因此选用菌株T13来做进一步研究（见表3）。表3 15株放线菌对供试病原菌的抑菌活性菌株编号T1T2T4T5T8T9T10T12T13T15T16T17C4C24C25抑菌圈直径（mm）枯草芽孢杆菌9.669.169.5710.809.5310.47-11.50-10.4312.209.90金黄色葡萄球菌-9.27-10.17-8.65-12.43-大肠杆菌-10.67-11.5710.239.2111.4711.09-白假丝酵母-11.23-15.33-10.3310.10-10.50-注：表中数值为3次重复实验的平均值，“-”表示无抑菌效果。2.3 菌株T13的初步鉴定2.3.1 培养特征观察菌株T13在高氏一号培养基上28恒温培养7 d后，菌落呈圆形、灰白色、粉末状、干燥隆起，不产色素（见图2）。图2 菌株T13的菌落特征注：正面菌落（A）；反面菌落（B）2.3.2 显微特征观察菌株T13基内菌丝颜色较浅、菌丝比较短；气生菌丝颜色较深、菌丝比较长，孢子丝呈螺旋状，孢子表面光滑，椭圆形（见图3）。-105第 42 卷第 2 期保山学院学报2023 年 4 月图3 菌株T13的显微特征（1040）2.3.3 生理生化特征观察菌株T13能利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖和果糖，能利用酪氨酸和柠檬酸三铵，色氨酸的利用能力较弱，能使明胶液化，不分解纤维素、不能代谢产生硫化氢（见表4）。表4 菌株T13的生理生化特征实验项目葡萄糖蔗糖阿拉伯糖甘露糖果糖酪氨酸色氨酸柠檬酸三铵明胶液化纤维素水解硫化氢实验结果+-+-注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。根据菌株T13的培养特征、形态学特征、生理生化特征，菌株T13初步鉴定为链霉菌属（Streptomycetaceae）。2.4 发酵条件研究采用生长速率法测定菌株T13对白假丝酵母菌的抑菌率。2.4.1 不同发酵培养基对菌株T13的抑菌活性影响采用3种不同的培养基对菌株T13进行发酵培养，从表5可以看出，在改良的高氏2号培养基中菌株T13的抑菌率最高。表5 不同发酵培养基对菌株T13的抑菌活性影响培养基对照菌落直径（mm）处理菌落直径（mm）抑菌率/%高氏1号14.256.1856.63改良的高氏2号14.255.3162.74培养基314.257.1749.682.4.2 不同发酵时间对T13的抑菌活性影响由表6可知，菌株T13培养到第6天的时候抑菌活性最高，之后因培养基中营养物质的消耗，代谢所产生的抑菌活性物质在减少。-106晏爱芬，何寒霞：土壤蚯蚓消化道中抑菌放线菌的筛选及发酵条件研究表6 菌株T13不同培养基时间对其抑菌活性的影响培养时间（d）对照菌落直径（mm）处理菌落直径（mm）抑菌率/%313.838.5837.96514.477.7546.44614.165.4261.72714.256.1856.63913.927.1648.562.4.3 不同发酵温度对T13的抑菌活性影响由表7可知，菌株T13培养温度在28时抑菌活性最高，培养温度过低或过高都会影响菌株的抑菌率。表7 菌株T13不同培养基温度对其抑菌活性的影响培养温度（）对照菌落直径（mm）处理菌落直径（mm）抑菌率/%2414.238.5839.702614.377.7546.072814.065.6260.023013.937.1848.463214.128.1642.212.4.4 不同发酵pH对T13的抑菌活性影响由表8可知，培养基pH值为7时菌株T13抑菌率最高，培养基pH值过低或过高都会影响菌株的抑菌率。表8 不同pH对菌株T13抑菌活性的影响pH对照直径（mm）处理直径（mm）抑菌率/%313.839.5830.73514.077.1549.18713.965.6259.74914.137.2848.491114.129.1635.133 讨论与结论放线菌代谢产物对抑菌和抗肿瘤有很大的作用，近年来已成为研究热点15。从产抑菌活性物质来看，链霉菌属的放线菌是第一大类新型活性物质的来源，其被发现和应用率很高16。本研究从保山市隆阳区耕地土壤蚯蚓消化道中所分离到的放线菌，通过培养特征和显微镜特征观察，发现大多菌株都是链霉菌属的放线菌。这与Egert等可将蚯蚓消化道和粪便中的物质视为特殊生境下的土壤的理论相符17，且与土壤中链霉菌为优势菌的有关报道相符。将蚯蚓放在烘箱中120，烘烤1 h后仍然能分离出6株放线菌，再一次证明了蚯蚓体内的放线菌对热有很好的耐热性，这与汪学军等在120仍然能从蚯蚓粪中分离出放线菌的结论相符11。且汪学军等在对蚯蚓粪中放线菌进行分离时发现，用高氏1号培养基分离得到的放线菌的数量少于从改良高氏2号培养基分离得到的放线菌数量11。本实验在分离过程中发现部分菌株在高氏1号培养基上的生长状况不是很理想，菌落较小，生长缓慢，这与从高黎贡山分离的放线菌生长相似18，说明高氏1号培养基不是这部分放线菌的最佳培养基。因此，我们可以尝试选用其它配方的培养基来培养这部分放线菌，使这部分放线菌得以正常生长。此次试验从蚯蚓消化道这一新环境中分离抑菌菌株，为其以后在肠道放线菌的开发利用提供一定的理论依据，增加肠道抑菌放线菌的数量或种类。T13菌株具有潜在的研究价值。参考文献：1 徐丽华，李文均，刘志恒，等.放线菌系统学-原理、方法及实践M.北京：科学出版社，2007.2 王影姣，沈娟，方霞，等.美洲大蠊肠道内生戈登放线菌的分离与鉴定J.中国媒介生物学及控制杂志，2016，27（02）：172-175.3 郭志凯，刘寿柏，马帅，等.铜绿金龟子肠道链霉菌 Streptomyces sp.BCa1 菌体的抗菌成分研究J.热带作物学报，2015，36（07）：1307-1311.4 矫继峰，陶大勇，赵义龙，等.新疆驴盲肠放线菌的多样性分析J.兽医科学，2016（21）：173-175.-107第 42 卷第 2 期保山学院学报2023 年 4 月5 王蓉，刘维，何晓娜，等.紫海胆肠道放线菌Micromonospora sp.HDa2次生代谢产物的研究J.热带农业科学，2013.33（10）：38-42.6 刘雪连，张宁，崔东良，等.蚯蚓粪中乳酸菌的分离及其在大肠杆菌O157：H7中的抗菌活性J.基因组学与应用生物学，2011，30（01）：1-6.7 胡艳霞，孙振钧，王东辉，等.蚯蚓粪中抑菌微生物分析J.应用与环境生物学报，2004，10（01）：99.8 袁向华，周艳玲，宋清姿，等.蚯蚓吞食过程中土壤理化性质与放线菌多样性的变化特J.生态学报，2017，37（04）：1999-2010.9 周德庆，徐德强.微生物学实验教程M.北京：高等教育出版社（第3版），2013.10 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method;the bacteriostatic actinomycetes were preliminarily screened by the paper disc method,and the strains with good bacteriostatic effect were re-screened by the growth rate method.The strain was preliminarily identified by classicaltaxonomic methods:insert method,morphological characteristics,culture characteristics,physiologicaland biochemical characteristics.The earthworm was preliminarily identified through anatomy and surface observation.Earthworms used in the experiment are Pheretima tschiliensis animals.A total of 43strains of actinomycetes were isolated,and 15 strains of actinomycetes had antibacterial activity againstthe pathogenic bacteria of the tested bacteria.Among them,strain T13 had antibacterial activity againstthe pathogenic bacteria and fungi of the tested bacteria,and the thermal stability of strain T13 wasgood.The preliminary identification of strain T13 was Streptomycetaceae actinomycetes,which hadhigh antibacterial activity in the modified Gaoshi 2 medium,the optimal fermentation time was 6 days,and had heat resistance.T13 has antibacterial activity and stability,and has research value.Key words:Bacteriostatic actinomycetes;Fermentation conditions;Stability;Characteristic observation-108